本申請(qǐng)為申請(qǐng)日是2013年1月23日、申請(qǐng)?zhí)柺?01380001136.8、發(fā)明創(chuàng)造名稱是“化妝品”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)是非臨時(shí)申請(qǐng)，要求2012年1月23日遞交的第61/589,592號(hào)美國臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用的方式并入本申請(qǐng)。
本發(fā)明總的來說涉及化妝品及其組分，且尤其涉及包含了有利于提高皮膚質(zhì)量(膚質(zhì))的卵孵化蛋白質(zhì)提取物(egghatchingproteinaceousextracts)及其配方的化妝品。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的化妝品配方包含了在皮膚上形成保護(hù)性覆蓋層以緩解天氣造成的影響的油類物質(zhì)和多種親脂性物質(zhì)?；瘖y品中含有的防曬霜也能減輕對(duì)皮膚造成的與老化和自由基的產(chǎn)生有關(guān)的紫外線損傷?；瘖y品組合物的其他常規(guī)成分是可以運(yùn)送可觀數(shù)量的水至皮膚的潤膚劑(emollients)，這些水與油的組合影響從皮膚釋放或保留的水分量以掩蓋皺紋。遺憾的是，這些傳統(tǒng)化妝品的配方不能為膚質(zhì)提供長期的，化學(xué)方面的改善。
魚苗孵化場(chǎng)的工人的手有特別好的膚質(zhì)，即使長時(shí)間接觸冷水，這一觀察是分離與魚卵相關(guān)的一類新蛋白質(zhì)的起因。例如在專利u.s.6,346,245，u.s.6,592,866，u.s.2011/0280882，wo2011/06434和u.s.2009/0274770中對(duì)這類蛋白質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)說明。這類分離的蛋白質(zhì)包括魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)，白細(xì)胞凝集素(leukolectin)，極酸的酸性蛋白(vaps)和某種細(xì)胞溶解酶(choroelysins)，這些蛋白中至少一些在治療自身免疫性疾病和炎癥性疾病方面與治療損傷性皮膚一樣有效，都有最小的副作用。雖然這種蛋白改善了與風(fēng)化作用和多種環(huán)境壓力因素相關(guān)的受損的皮膚功能，諸如暴露于空調(diào)或空氣污染物，這些蛋白質(zhì)似乎對(duì)受損的和老化的皮膚相關(guān)的其他屬性影響很小或沒有影響。另外，雖然人們?cè)A(yù)想過在化妝品中添加這種魚卵分離蛋白(fishspawnisolateproteins)，但是能夠在化妝品配方中保持蛋白活性和給予貯存穩(wěn)定性是一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn)。
因此，現(xiàn)在需要一種可解決多種皮膚老化問題的儲(chǔ)存穩(wěn)定的化妝品，該化妝品整合了卵且特別是魚卵衍生蛋白的抗炎特性。進(jìn)一步的，還需要這樣的化妝品，其基本上不含對(duì)皮膚有意想不到毒害作用和有生物體內(nèi)積累問題的合成化妝品成分。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種組合物，其包含了對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚有抗炎作用的魚卵蛋白分離物(fishspawnproteinisolate)。其中也存在含有不飽和脂肪酸和甾醇類物質(zhì)(sterols)的天然產(chǎn)物提取物，該天然產(chǎn)物提取物(naturalproductextract)具有抗氧化活性。本發(fā)明提供了乳化劑或增溶劑，或它們的組合以形成分離物和提取物的混合物。本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含了具有對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚的抗炎作用的卵孵化蛋白分離物(egghatchingproteinisolate)。其中存在至少一種抗微生物劑(biocide)，其保護(hù)卵孵化蛋白分離物的活性在
一種生產(chǎn)含有對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚有活性的卵孵化蛋白分離物的化妝品的方法，該方法包括形成至少一水相和至少一疏水相。乳化劑和該至少一種抗微生物劑存在于該至少一水相和該至少一疏水相中的至少一相中。該至少一水相和該至少一疏水相組合以形成一乳液。該乳液或該至少一水相被緩沖至ph值在5.5到7.9之間，在將該卵孵化蛋白分離物添加到該乳液之前。
本發(fā)明提供了一種改善皮膚外觀的方法，包括將該組合物用于哺乳動(dòng)物的皮膚，使用量水平為每平方厘米皮膚1×10-6mg到0.1mg的分離物和2×10-7mg到0.02mg的不飽和脂肪酸，每周使用至少三次，以實(shí)現(xiàn)皮膚外觀的改善。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明作為具有皮膚修復(fù)特性的化妝品具有實(shí)用性。在一個(gè)實(shí)施例中，一發(fā)明的化妝品被配制成能提供多種組分之間的協(xié)同作用。在另一個(gè)實(shí)施例中，一發(fā)明的化妝品組合物被配制成不含有合成組分。所有實(shí)施例中的發(fā)明的化妝品保持蛋白質(zhì)組分的活性，同時(shí)具有在室溫下的貯存穩(wěn)定性，并且應(yīng)對(duì)因非消毒處理和受到使用造成的微生物污染所帶來的微生物挑戰(zhàn)。本發(fā)明提供了配方的生產(chǎn)方法，該方法生產(chǎn)了一種具有在化妝品的使用和儲(chǔ)存條件下保持蛋白質(zhì)的活性和貯存穩(wěn)定性的這些特性的化妝品配方。
根據(jù)本發(fā)明，卵孵化活性蛋白,特別是對(duì)活的哺乳動(dòng)物皮膚有抗炎作用的魚卵分離蛋白(fishspawnisolatedprotein)，其與含有不飽和脂肪酸和至少一種甾醇的天然產(chǎn)物提取物相組合。該提取物同時(shí)具有抗氧化活性和膠原酶抑制活性，并且其與能夠使含有蛋白分離物和提取物的混合物穩(wěn)定的乳化劑相組合?？梢岳斫獾兀景l(fā)明中可使用多個(gè)提取物以達(dá)到成分和活性方面的要求。驚奇地發(fā)現(xiàn)，卵孵化蛋白的活性，以及特別是魚卵蛋白和天然產(chǎn)物提取物協(xié)同作用，在一些本發(fā)明的實(shí)施例中以實(shí)現(xiàn)更好的皮膚外觀以及在一些實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)皮膚的更新，與對(duì)照實(shí)施例中單獨(dú)使用任一成分相比。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的化妝品在
魚卵蛋白分離物，例如，包括魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)、白細(xì)胞凝集素(leukolectin)或它們的組合，其所具有的性質(zhì)在美國專利u.s.6346245，第4欄第15行-第5欄第8行；美國專利u.s.2009/0274770a1中[0321]-[0326]段以及美國專利u.s.2011/0280882中[0157]-[0194]段有詳細(xì)說明；含有這種蛋白的粗提物；以及它們的組合。適合于蛋白分離的魚卵的典型來源包括鱘魚(sturgeon)，鮭魚(salmon)，白鮭魚(whitefish)，白鱒魚(vendace)，鱈魚(cod)，毛鱗魚(capelin)和淡水鱈魚(burbot)的魚卵?？梢岳斫獾氖?，本發(fā)明中可以使用的卵蛋白的其他來源包括兩棲類動(dòng)物的卵鞘(amphibianeggcases)，諸如蝌蚪(tadpoles)和蠑螈(salamanders)的卵鞘，爬行類動(dòng)物的卵鞘(reptilianeggcases)和禽類動(dòng)物的卵鞘(fowleggcases)。通常情況下，一個(gè)卵或特別是含有至少一些上述的蛋白質(zhì)的魚卵蛋白分離物占本發(fā)明的一個(gè)化妝品配方的總重量的0.0001％到10％，如果該粗提物的0.01％～10％是活性蛋白?？梢岳斫獾氖牵诒景l(fā)明的一個(gè)化妝品中存在的蛋白質(zhì)的量取決于例如包括與另一個(gè)化妝品的其它組分的混溶性和皮膚損傷的程度在內(nèi)的因素。
應(yīng)當(dāng)理解的是，在提供了數(shù)值范圍實(shí)例中，該數(shù)值范圍應(yīng)當(dāng)不僅包含該范圍的端點(diǎn)值，而且包含范圍的中間數(shù)值，具體來說是被包含在該范圍內(nèi)的和隨著該范圍的最后有效數(shù)值(lastsignificantfigure)變化的中間數(shù)值。例如，所述的從1至4的數(shù)值范圍應(yīng)當(dāng)包括1-2，1-3，2-4，3-4和1-4。
本發(fā)明的組合物還含有一種天然產(chǎn)物提取物。該天然產(chǎn)物提取物包含不飽和脂肪酸和甾醇，其量達(dá)到足以提供超出對(duì)照10％的抗氧化劑活性和膠原酶抑制活性，這些活性的檢測(cè)分別采用氧自由基吸收能力(orac)測(cè)試和在含有1％的天然產(chǎn)物提取物的培養(yǎng)基中的脂質(zhì)過氧化示蹤劑和采用紫外線b輻射，輻射量為每平方厘米150毫焦耳。r.l.prior,etal.等。血漿及其他生物和食品樣品的親水和親脂性的抗氧化能力(氧自由基吸收能力(oracfl))測(cè)定(j.agric.foodchem.)(2003)51:3273-3279?？梢岳斫獾氖?，天然提取物通常含有混合物，其為不飽和脂肪酸，一種或多種甾醇和其他的有不同皮膚病學(xué)活性(dermatologicalactivity)成分的混合物。在一個(gè)本發(fā)明的組合物中使用的產(chǎn)物提取物也能抑制膠原酶活性，在一些實(shí)施例中抑制達(dá)5％以上，該數(shù)值是通過與對(duì)照組的比較檢測(cè)獲得，對(duì)照組中含有0.1％重量百分比的提取物，該檢測(cè)采用抗膠原酶的目測(cè)操作規(guī)程，對(duì)與在37℃下培養(yǎng)了3個(gè)小時(shí)的低溫皮膚切片的活組織檢查進(jìn)行檢測(cè)，該低溫皮膚切片與和不與提取物一同培養(yǎng)，隨后不與(陰性對(duì)照)或與每毫升15微升膠原酶一同在37℃下的培養(yǎng)三個(gè)小時(shí)，之后是活組織檢查樣本的漂洗，之后對(duì)毛狀體染色(trichomeofmasson)的目測(cè)進(jìn)行染色和顯微鏡檢查。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物所使用的天然產(chǎn)物提取物包括ω-3，ω-6和ω-9脂肪酸中的至少一種。在其它實(shí)施例中，不飽和脂肪酸在天然產(chǎn)物提取物中存在的量為每100克提取物中至少20毫克。本發(fā)明的天然產(chǎn)物提取物還包括至少一種類型的甾醇，例如該甾醇包括膽固醇，菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，及其羥基化的形式和它們的組合。在一些實(shí)施例中，至少一種甾醇存在于天然產(chǎn)物的提取物中的量為每100克提取物中大于50毫克。通常，本發(fā)明的組合物中天然產(chǎn)物提取物的重量為組合物總重量的0.01～10％，在一些實(shí)施例中為總重量的0.1～3％。決定選擇天然產(chǎn)物提取物的量方面的因素，例如包括化妝品的卵孵化蛋白和糖苷在卵孵化蛋白存在下的穩(wěn)定性，皮膚損害的程度和化妝品的保質(zhì)期。
根據(jù)本發(fā)明的天然產(chǎn)物提取物很容易通過常規(guī)技術(shù)來制備，所述的常規(guī)技術(shù)例如通過親水性或疏水性的第一溶劑提取諸如葉、莖、芽、根、果實(shí)、或它們的組合的植物的一部分和經(jīng)與該溶劑接觸1-48小時(shí)后過濾該混合物，該溶劑的量相對(duì)于植物原料通常在1-20的體積比。在降低親水性的有機(jī)溶劑中進(jìn)行萃取和通過常規(guī)技術(shù)進(jìn)行洗脫以獲得本發(fā)明的天然產(chǎn)物提取物。代表性的脂肪酸/甾醇的提取技術(shù)請(qǐng)參見j.s.o’brienanda.a.benson,j.lipidres.,5,1964,pp.432-436.。該有機(jī)溶劑，例如包括醚類ethers，呋喃類furans，石油餾分petroleumdistillates，烷烴(alkanes)，鹵代烷烴(halogenatedalkanes)，醇類(alcohols)，醋酸纖維素(acetates)，以及它們的組合。各相之間充分相互作用通常20分鐘到48小時(shí)后，將有機(jī)相分離以獲得根據(jù)本發(fā)明的提取物。提取物的合適來源包括在本文中都統(tǒng)稱為“海藻”的紅藻，綠藻，褐藻和成簇狀的藍(lán)藻細(xì)菌(tuft-formingcyanobacteria)，以及植物或它們的具有紫色，紅色，黑色或橙色的果實(shí)或葉的著色的組成部分，葉著色在葉綠素的存在或不存在的條件下進(jìn)行測(cè)量。海藻類代表本發(fā)明的具有高含量的不飽和脂肪酸和甾醇類物質(zhì)的天然產(chǎn)物提取物的共同來源?？梢岳斫獾厥牵伙柡椭舅岷顽薮碱愇镔|(zhì)的合成和/或動(dòng)物來源很容易地用于本發(fā)明的組合物中。
除了卵孵化蛋白分離物和天然產(chǎn)物提取物，一些實(shí)施例中的本發(fā)明組合物包含了常用于化妝品中的一個(gè)或多個(gè)其他成分，前提條件是這些成分維持卵孵化蛋白分離物和天然產(chǎn)物提取物的性質(zhì)。很容易地配制到本發(fā)明的化妝品中的有代表性的傳統(tǒng)化妝品成分，例如包括可以構(gòu)成本發(fā)明化妝品的大部分重量的去離子水；諸如石油(petroleum)、羊毛脂(lanolin)、地蠟(ceresin)、微晶蠟(microcrystallinewax)、巴西棕櫚蠟(carnubawax)、c10-c30脂肪酸、c10-c30醇類物質(zhì)的固體和蠟類物質(zhì)(solidsandwaxes)；諸如橄欖油(oliveoil)、霍霍巴油(jojobaoil)、蓖麻油(castoroil)、葵花油(sunfloweroil)、榛子油hazelnutoil、乳木果油(sheabutter)和紅花油(saffloweroil)的油類物質(zhì)；諸如瓜爾豆膠(guargum)、黃原膠(xanthangum)、角叉菜膠(carrageenan)、羥乙基纖維素(hydroxyethylcellulose)、菌類植物膠(sclerotiumgum)，卡波姆膠(carbomers)，聚丙烯酸酯(polyacrylates)和丙烯酸酯-c10-c30烷基丙烯酸酯共聚物(acrylate-c10-c30alkylacrylatecopolymers)的粘度調(diào)節(jié)劑/穩(wěn)定劑；諸如甘油(glycerin)，丙二醇(propanediol)，乳酸鈉(sodiumlactate)，pca鈉(sodiumpca)的親水性保濕劑；諸如二辛基醚(dicaprylylether)、肉豆蔻酸肉豆蔻酯(myristylmyristate)、c10-c30的癸酸鹽(c10-c30caprates)、含有辛酸和/或癸酸的c10-c30的甘油三酯和c10-c30的甘油酯的潤膚劑；諸如十六烷醇(cetylalcohol)、十八烷醇(stearylalcohol)、硬脂酸甘油酯glycerylsterate、硬脂酸(stearicacid)、乙二醇甘油酯(glycolsterate)、雙硬脂酸甘油酯(glyceryldistearate)的助乳化劑；諸如非離子型表面活性劑和陰離子表面活性劑的乳化劑，所述的陰離子表面活性劑例如含有月桂酰乳酸(lauroyllactylate)的鹽、己酰乳酸(caproyllactylate)的鹽、椰油酰乳酸(cocoyllactylate)的鹽、硬脂酰乳酸(stearoyllactylate)的鹽、橄欖油鯨蠟醇酯(cetearylolivate)的鹽、橄欖油山梨糖醇(sorbitanolivate)的鹽或甘油油酸酯檸檬酸酯(glyceryloleatecitrate)的鹽，這些鹽的典型的陽離子包括鈉離子、鉀離子、銨離子、鈣離子和鎂離子；硅油類物質(zhì)；諸如無機(jī)輔配物(inorganicaccompaniments)和無機(jī)染料的著色劑；金屬皂化處理或硅處理的無機(jī)或有機(jī)顏料和有機(jī)染料；非離子型表面活性劑；聚硅氧烷(polysiloxanes)；水防腐劑(waterpreservatives)；ph調(diào)節(jié)劑；諸如維生素e、維生素k或b族維生素復(fù)合物的維生素和維生素代謝物；精油(essentialoils)；吸收紫外光的化合物(ultravioletlightabsorbingcompounds)；芳香劑(fragrances)；濕潤劑(humectants)；血流增強(qiáng)劑(bloodflowenhancingagents)；誘導(dǎo)冷感的物質(zhì)(agentsinducingacoldsensation)；止汗劑(antiperspirants)；活性物質(zhì)(actives)和抗微生物劑。
這里使用的活性物質(zhì)被定義為應(yīng)用于人皮膚來清潔、美容、提高吸引力或改善外觀的有機(jī)化合物，該有機(jī)化合物具有改善皮膚特性的效力，無論該化合物的性質(zhì)是極性或非極性的。這里使用的該術(shù)語，特別地排除卵孵化蛋白、卵孵化蛋白的混合物和天然產(chǎn)物提取物。這里可以使用的活性有機(jī)物質(zhì)，例如包含額外的提取物，例如下列物質(zhì)的提取物：桑景蘑菇(mushroommposongyi)，金合歡(acaciafarnesiana)，巴西莓(euterpeoleracea)，亮葉金虎尾(malpighiaglabra)，臙脂樹(bixaorellana)，甜杏仁(prunusdulcis)，蘆薈(aloevera)，高山玫瑰杜鵑花(rhododendronferrugineum)，尾穗莧(amaranthuscaudatus)，白芷根(angelicaarchangelica)，茴芹(pimpinellaanisum)，蘋果(malusdomestica)，蘋果薄荷(menthasuaveolens)，燕麥(oatavenanthramide)，大扁杏(prunusarmeniaca)，蒙大拿山金車(arnikamontana)，菜薊(cynarascolymus)，蘆筍(asparagusofficinalis)，鱷梨(perseaamericana)，倒地鈴(cardiospermumhalicacabum)，蜜蜂花(cardiospermumhalicacabum)，龍頭竹(bambusavulgaris)，粉芭蕉(musaparadisiaca)，猴面包樹(adansoniadigitata)，刺檗(berberisvulgaris)，羅勒(ocimumbasilicum)，月桂(laurusnobilis)，柳蘭(epilobiumangustifolium)，熊蔥(alliumursinum)，歐亞路邊青(geumurbanum)，歐洲樺(betulapubescens)，蘇林南苦木(quassiaamara)，黑種草(nigellasativa)，黑加侖(ribesnigrum)，黑桑(morusnigra)，蘿卜(raphanussativus)，野茶樹(camelliasinensis)，歐洲黑莓(rubusfruticosus)，變色鳶尾(irisversicolor)，歐洲越橘(vacciniummyrtillus)，琉璃苣(boragoofficinalis)，蠶豆(viciafaba)，睡菜(menyanthestrifoliata)，蕎麥(fagopyrumesculentum)，牛蒡(arctiumlappa)，假葉樹(ruscusaculeatus)，可可(theobromacacao)，菖蒲(acoruscalamus)，葛縷子(carumcarvi)，小豆蔻(elattariacardamomum)，胡蘿卜(daucuscarotasativus)，卡圖巴古柯(erythroxylumcatuaba)，百金花(centauriumerythraea)，洋甘菊(matricariachamomilla)，櫻桃(prunuscerasus)，鷹嘴豆(cicerarietinum)，小球藻(chlorellavulgaris)，黑果腺肋花楸(aroniamelanocarpa)，金雞納樹(cinchonapubescens)，錫蘭肉桂(cinnamomumverum)，丁香(syzygiumaromaticum)，椰子(cocosnucifera)，小果咖啡(coffeaarabica)，毛喉鞘蕊花(plectranthusbarbatus)，款冬(tussilagofarfara)，聚合草(symphytumofficinale)，大車前草(plantagomajor)，芫荽(coriandrumsativum)，玉米(zeamays)，虞美人(papaverrhoeas)，矢車菊(centaureacyanus)，草棉(gossypiumherbaceum)，越桔(vacciniumvitis-idaea)，黃花九輪草(primulaveris)，蔓越莓(vacciniummacrocarpon)，黃瓜(cucumissativus)，姜黃(curcumalonga)，雛菊(bellisperennis)，大馬士革玫瑰(rosadamascena)，特納草(turneradiffusa)，西洋蒲公英(taraxacumofficinale)，海棗(phoenixdactylifera)，野芝麻(lamiumalbum)，狗薔薇(rosacanina)，火龍果(hylocereusundatus)，麒麟竭(daemonoropsdraco)，狹葉松果菊(echinaceaangustifolia)，高山火絨草(leontopodiumalpinum)，西洋接骨木(sambucusnigra)，刺五加(acanthopanaxsenticosus)，余甘子(phyllanthusemblica)，藍(lán)桉(eucalyptusglobulus)，月見草(oentherabiennis)，沙生蠟菊(helichrysumarenarium)，小米草(euphrasiarostkoviana)，胡蘆巴(trigonellafoenum-graecum)，無花果(ficuscarica)，亞麻(linumusitatissimum)，雞蛋花(plumeriaalba)，球果紫菫(fumariaofficinalis)，酸模(rumexacetosa)，梔子花(gardeniayessminoides)，黃龍膽(gentianalutea)，生姜(zingiberofficinale)，銀杏(ginkgobiloba)，人參(panaxginseng)，毛果一枝黃花(solidagovirgaurea)，葡萄(vitisvinifera)，葡萄柚(citrusparadisi)，野茶樹(camelliasinensis)，巴西香可可(paulliniacupana)，干草花(graminisflos)，歐洲榛子(corylusavellana)，指甲花(lawsoniainermis)，玫瑰茄(hibiscussabdariffa)，金銀花(lonicerajaponica)，啤酒花(humuluslupulus)，歐洲七葉樹(aesculushippocastanum)，問荊(equisetumarvense)，長生花(sempervivumtectorum)，神香草(hyssopusofficinalis)，冰島地衣(cetrariaislandica)，贗靛(baptisiatinctoria)，角叉菜(chondruscrispus)，常春藤(hederahelix)，素芳花(jasminumofficinale)，霍霍巴(simmondsiachinensis)，歐刺柏(juniperuscommunis)，療傷絨毛花(anthyllisvulneraria)，非洲吊燈樹(kigeliaafricana)，獼猴桃(actinidiachinensis)，葛根(puerarialobata)，羽衣草(alchemillavulgaris)，薰衣草(lavandulaangustifolia)，檸檬(citruslimon)，香茅(cymbopogoncytratus)，光果甘草(glycyrrhizaglabra)，圣母百合(liliumcandidum)，來檬(citrusaurantifolia)，小葉椴(tiliacordata)，荷花(nelumbonucifera)，澳洲堅(jiān)果(macadamiaternifolia)，望春玉蘭(magnoliabiondii)，冬青葉小檗(berberisaquifolium)，錦葵(malvasylvestris)，芒果(mangiferaindica)，金盞花(calendulaofficinalis)，歐洲栗(castaneasativa)，藥蜀葵(althaeaofficinalis)，旋果蚊子草(filipendulaulmaria)，香瓜(cucumismelo)，水飛薊(silybummarianum)，黍(panicummiliaceum)，可樂豆(colophospermummopane)，花楸樹(sorbusaucuparia)，毛蕊花(verbascumthapsus)，榆葉梧桐(guazumaulmifolia)，香桃木(myrtuscommunis)，旱金蓮(tropaeolummajus)，印度苦楝樹(azadirachtaindica)，大蕁麻(urticadioica)，泡葉藻(ascophyllumnodosum)，肉豆蔻(myristicafragrans)，夏櫟(quercusrobur)，掌狀海帶(laminariadigitata)，燕麥(avenasativa)，須松蘿(usneabarbata)，油橄欖(oleaeuropaea)，洋蔥(alliumcepa)，甜橙(citrussinensis)，檸檬薄荷(menthacitrata)，牛至(origanumvulgare)，三色堇(violatricolor)，番木瓜(caricapapaya)，辣椒(caricapapaya)，香芹(petroselinumcrispum)，西番蓮(passifloraincarnata)，碧桃(prunuspersica)，西洋梨(pyruscommunis)，積雪草(centellaasiatica)，芍藥(paeoniaofficinalis)，胡椒(pipernigrum)，歐薄荷(menthapiperita)，菠蘿(ananascomosus)，櫻桃，歐洲李(prunusdomestica)，石榴(punicagranatum)，療肺草(pulmonariaofficinalis)，西葫蘆(cucurbitapepo)，榅桲(cydoniaoblonga)，覆盆子(rubusidaeus)，紅車軸草(trifoliumpratense)，水稻(oryzasativa)，線狀阿司巴拉妥(aspalathuslinearis)，洋薔薇(rosacentifolia)，迷迭香(rosmarinusofficinalis)，黑麥(secalecereale)，鼠尾草(salviaofficinalis)，五味子(schisandrachinensis)，沙棘(hippophaerhamnoides)，芝麻(sesamumindicum)，薺菜(capsellabursapastoris)，合歡花(albiziajulibrissin)，堿蒿(artemisiaabrotanum)，留蘭香(menthaspicata)，小麥(triticumaestivum)，鈍頂螺旋藻(spirulinaplatensis)，挪威云杉(piceaabies)，貫葉連翹(hypericumperforatum)，楊桃(averrhoacarambola)，甜葉菊(steviarebaudiana)，草莓(fragariaananassa)，向日葵(helianthusannuus)，草木樨(melilotusofficinalis)，除蟲菊(tanacetumcinerariifolium)，柑橘(citrusreticulata)，百里香(thymusvulgaris)，山柑藤(salvadorapersica)，纈草(valerianaofficinalis)，香草(vanillaplanifolia)，馬鞭草(verbenaofficinalis)，香堇菜(violaodorata)，核桃(juglansregia)，豆瓣菜(nasturtiumofficinale)，西瓜(citrulluslanatus)，小麥(triticumaestivum)，野茶樹(camelliasinensis)，山楂(crataegusrhipidophylla)，紅花百里香(thymusserpyllum)，白柳(salixalba)，弗吉尼亞州金縷梅(hamamelisvirginia)，板藍(lán)根(isatistinctoria)，寧夏枸杞(lyciumbarbarum)，苦艾(artemisiaabsinthium)，歐番草(achilleamillefolium)，南美紅檀(hymenaeacourbaril)，依蘭香(canangaodorata)，松口蘑(tricholomamatsutake)，或它們的組合。可以理解，這些提取物也具有一定程度的抗菌活性，在某些實(shí)施例中增強(qiáng)抗微生物劑的功效。活性的有機(jī)化合物通常被用于本發(fā)明的配方中，占本發(fā)明的配方總重量的0到1％，在一些實(shí)施例中高達(dá)總重量的5％。雖然這些活性物質(zhì)往往是更能耐受傳統(tǒng)的化妝品加工條件，且在許多情況下，與卵孵化蛋白和天然產(chǎn)物提取物不同，其適合被包含于水相或親脂相中，可以理解的是，在一些實(shí)施例中的這些活性有機(jī)化合物，通過一個(gè)c相或其他，在乳液形成之后，被單獨(dú)地加入到乳液中。
本發(fā)明的化妝品易于配制成水性化妝品(water-basedcosmetic)，例如包括爽膚水(toner)，噴霧(spraymist)，精華液(serum)，面霜(cream)，面膜(mask)，防曬霜(sunscreen)，清面乳(cleanser)，保濕霜(moisturizer)，浴用配置品(bathpreparation)，粉底液(liquidfoundation)，收斂劑(astringent)，剃須用品(shavingpreparation)，護(hù)發(fā)產(chǎn)品(haircareproduct)，和其他護(hù)膚品，或者外用藥劑，例如包括消炎藥。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，提供了一種化妝品，其包含諸如乳酸酯的植物性乳化劑(plantbasedemulsifier)，該植物性乳化劑，基本上不含硅樹脂(silicone-free)，浴用配置品不含礦物油，不含石蠟油(petrolatum)，且不含合成的對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑(parabens)。乳化劑“基本上不含”這些化合物在這里定義為這些化合物總共占不到10％的乳化劑的重量百分比，本發(fā)明的配方很容易應(yīng)用到人的皮膚，特別是且例如包括整張臉的區(qū)域，嘴、眼周圍的區(qū)域，前額、兩鬢、面頰或下巴；手；腳；頸部；頭皮；肘部；胸部；前臂；肩膀；腿；以及它們的組合。
本發(fā)明的化妝品目前存在難以在配制過程中保持蛋白質(zhì)的活性的困難。一般來說，可以看出加熱和高剪切混合，這些化妝品配制的常規(guī)技術(shù)往往使活性蛋白變性。再者，活性蛋白容易出現(xiàn)微生物降解(microbialdegradation)，特別是當(dāng)本發(fā)明的化妝品是在非無菌的條件下加工，并在
雖然，為了保持蛋白的活性，將本發(fā)明的化妝品的ph值調(diào)整到5.6和7.9之間，部分抑制卵孵化蛋白的微生物降解，但抗微生物劑存在于本發(fā)明化妝品配方中以保持蛋白質(zhì)的活性，針對(duì)配制過程中帶來的微生物并且針對(duì)在使用多劑量容器過程中，經(jīng)受試者局部的和呼吸的接觸本發(fā)明的化妝品，各種微生物連續(xù)不斷地在化妝品中接種的情況。因此，本發(fā)明的多用途化妝品配方和儲(chǔ)存穩(wěn)定的配方，包含廣譜抗微生物劑或抗微生物劑的組合。此處的廣譜的抗微生物劑被定義為，其具有抗革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌，以及與健康人體相關(guān)的真菌的活性。此處有效的抗微生物劑，例如包括苯甲酸(benzoicacid)，對(duì)羥基苯甲酸酯類(parabens)，水楊酸(salicylicacid)，石炭酸(carbolicacid)，山梨酸(sorbicacid)，烷基p-對(duì)羥基苯甲酸酯(alkylp-hydroxybenzoates)，對(duì)氯代間甲酚(p-chlorometacresol)，六氯酚(hexachlorophene)，氯化苯甲烴銨(benzalkoniumchloride)，氯化氯己啶(chlorohexidinechloride)，三氯對(duì)稱二苯脲(trichlorocarbanilide)，苯氧基乙醇(phenoxyethanol)，?；“彼?acylsarcosines)，谷胱甘肽(glutathione)，蘋果酸(malicacid)，酒石酸(tartaricacid)，抗壞血酸(ascorbicacid)，抗壞血酸鹽(ascorbates)，必需的植物油，變鏈素蛋白(mutacinproteins)，以及它們的組合。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，只存在天然來源的抗微生物劑。天然來源的抗微生物劑，例如包括，諸如乳桿菌(lactobacillus)、變形鏈球菌(streptococcusmutans)和明串珠菌(leuconostoc)的發(fā)酵濾液；沒藥醇(bisabolol)；桉油精(eucalyptol)；百里香酚(thymol)；肌醇(inositol)；皂甙；和諸如日本金銀花(japanesehoneysuckle，lonicerajaponica)、羊蹄(yangti(rumexjaponicus))、苦參(kushen(sophoraflavescens))、睡蓮(candock)、野生牛至(wildoregano)、橙(orange)、鼠尾草(sage)、曼尼佛(manifoil)、錦葵(commonmallow)、川芎(chuanxiong(cnidiiofficinalemakino))、日本綠龍膽根(japanesegreengentian(swertiajaponicamakino))，沒藥醇(bisabolol)，百里香(thyme)，當(dāng)歸(danguii(angelicasinensis))，橙皮(orangepeel)，樺樹(birch)，問荊(fieldhorsetail)，絲瓜(dishclothgourd)，七葉樹(horsechestnuttree)，虎耳草(creepingsaxifrage(saxifragestolonifera))，山金車(arnica)，百合(lily)，艾蒿(mugwort)，牡丹(peony)，蘆薈(aloe)，梔子花(gardenia)和那些在文獻(xiàn)m.m.cowan,clinicalmicrobiologyreviews,12(4)oct.1999,p.564–582中詳述的植物的天然提取物，或者它們的組合。這些提取物通過臨床微生物學(xué)評(píng)論(clinicalmicrobiologyreviews,12(4)oct.1999,pages.573–574)中詳述的步驟來制得且通常采用一種諸如c1-c8的醇(c1-c8alcohol)、多羥基醇(polyhydricalcohols)、水和含水酒精(aqueousalcohols)的親水性有機(jī)溶劑。在一個(gè)特定的本發(fā)明實(shí)施例中，采用日本金銀花(japanesehoneysuckle)，根皮素(phloretin)(蘋果)，高良姜素(蠟菊(helichrysumaureonitens))作為天然來源的抗微生物劑，各自單獨(dú)或組合使用?？梢岳斫獾厥?，除了殺菌性能，天然提取物常常賦予本發(fā)明的化妝品一種香味?？刮⑸飫┰诒景l(fā)明的化妝品的多功能包裝中，在特定的實(shí)施例中，為總重量的0.1％～5％(重量)，可以理解地是，超過總重量的5％的抗微生物劑的量可以很容易地按照要求被列入。
本發(fā)明的化妝品在某些實(shí)施例中，ph緩至5.6到7.9之間的任一數(shù)值，且在另一些實(shí)施例中，緩沖至在6.5到6.8之間，然而在其他實(shí)施例中，緩沖至6.8到7.3之間。沒有打算要限定到一特定的理論，例如ph值促進(jìn)諸如魚卵分離物的卵提取物和天然產(chǎn)物的提取物成分的穩(wěn)定化和貯存穩(wěn)定性。通過預(yù)先配制至少兩個(gè)組分，與可選的附加相一同促進(jìn)本發(fā)明化妝品的配方的形成，所述的至少兩個(gè)組分包括水包油型乳液和油包水型或有機(jī)硅乳液的第二相，所述的附加相，例如含有諸如魚產(chǎn)卵分離物的活性卵提取物和/或天然產(chǎn)物提取物的第三相?；蛘?，可以理解，卵孵化分離物或天然產(chǎn)物提取物其中一種或兩者很容易地分散在水包油型乳液、油包水型乳液、硅氧烷包水型乳液或血清制劑中。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在添加活性卵蛋白提取物之前，各種相ph的緩沖對(duì)于保證最終的本發(fā)明的化妝品的貯存穩(wěn)定性和蛋白在受試者皮膚上的活性是至關(guān)重要的。
水包油型乳液的小部分的相組分，例如包括油、蠟、酯、醚、黃油、甘油酯，或它們的組合物，如上文詳述。水包油型乳液的大部分的相組分，例如包括水、水溶性鹽(aqueoussalts)、潤濕劑和各種水溶性物質(zhì)，如上文詳述。用于該系統(tǒng)的乳化劑包括離子型表面活性劑，非離子表面活性劑，如上文詳述，并且還包括卵磷脂，脂質(zhì)體和油質(zhì)體(oleosomes)。其他非必要的添加劑按照上文詳述可以很容易地給出，其包括粘度調(diào)節(jié)劑，乳化穩(wěn)定劑，香料，諸如此類。在具體的實(shí)施例中，水包油型乳狀液的ph值為5.6至7.9之間。在某些實(shí)施例中，水包油型乳液的ph值為6.5和6.8。
油包水型乳液或有機(jī)硅包水型乳液的小部分和大部分的相組分的相對(duì)量可以變化，并且優(yōu)選的，依賴于非離子型表面活性劑和有機(jī)硅衍生物作為乳化劑。粘度調(diào)節(jié)劑和/或乳化穩(wěn)定劑，例如包括水溶性鹽，樹膠，蠟，以及它們的組合物，如上文詳述。在特定的實(shí)施例中，內(nèi)相的ph調(diào)節(jié)為5.6至7.9之間。在某些實(shí)施例中，內(nèi)相的ph值調(diào)節(jié)在6.5到6.8之間?？梢岳斫猓鞣N維生素，如維生素e，維生素k，諸如抗壞血酸葡糖苷的抗壞血酸衍生物，可以很容易地加入到上述的乳化相中的一個(gè)或兩個(gè)，或作為一個(gè)獨(dú)立的第三相。
本發(fā)明的化妝品可以很容易地通過如上文詳述的預(yù)混相的組合來形成，或者可選的，所有這些成分按照本領(lǐng)域的常規(guī)順序依次混合形成一個(gè)均一的混合物。本發(fā)明提供了一種改善皮膚外觀的方法，包括將本發(fā)明的組合物用于哺乳動(dòng)物的皮膚，用量為每平方厘米皮膚1x10-6mg到0.1mg的所述分離物和2x10-7mg到0.02mg的所述不飽和脂肪酸，每周至少三次，以達(dá)到皮膚外觀的改善。
本發(fā)明化妝品的典型范圍總結(jié)如表1-3所示。應(yīng)該理解的是，如在這里詳述，其它常規(guī)的基礎(chǔ)配方，單獨(dú)的或者與含有不飽和脂肪酸和甾醇的天然產(chǎn)物提取物組合，可以很容易地采用本文詳述的方法被調(diào)整以穩(wěn)定卵孵化蛋白。在這里可使用的用于化妝品的各種常規(guī)的基礎(chǔ)配方參見：“化妝品配方”，第二版，2001年第8卷，諾伊斯出版社(isbn0-1855-1454-9)(e.w.flick,“cosmeticandtoiletryformulations”,2nded.,vol.8；2001,noyespublications,norwich,newyork,usa(isbn0-1855-1454-9).)。
表1.本發(fā)明的化妝品的水包油型乳液形式的典型范圍，其中百分比是總重量的百分比。在此提供三相或四相的形式。
三相配方
a-1相：
b-1相
c-1相
活性(0.034％的活性的卵孵化蛋白)0.001～10
活性(天然產(chǎn)物提取物)0.001～10
四相配方
a-2a相
a-2b相
b-1相
c-1相
活性(0.034％的活性蛋白質(zhì))0.001～10％
活性(天然產(chǎn)物提取物)0.001～10％
*-ph調(diào)節(jié)也可以繼a相和b相混合之后進(jìn)行，然而要在加入c-1相之前。
**-需要一些數(shù)量的抗微生物劑，通常占總重量0.1-5％的多用途的非消毒的配方。
表2本發(fā)明的化妝品的有機(jī)硅包水型乳液形式的典型范圍，其中的百分比為總重量的百分比。
a相
b相
c相
活性(0.034％的活性蛋白質(zhì))0.001～10％
活性(天然產(chǎn)物提取物)0.001～10％
表3本發(fā)明的化妝品的血清配方的典型范圍，其中的百分比為總重量的百分比。
a相
b相
增溶劑0.1～10％
非極性的活性有機(jī)化合物0～1％
c相
活性(0.034％的活性蛋白質(zhì))0.001～10％
活性(天然產(chǎn)物提取物)0.001～10％。
實(shí)施例1
經(jīng)配制該三相之后來制備一美容霜(cosmeticcream)。a相經(jīng)加熱至75-80℃，并充分?jǐn)嚢枰孕纬删鶆虻幕旌衔铩相在室溫下置于一個(gè)獨(dú)立的容器中進(jìn)行預(yù)混合，并在40°
c或以下的溫度添加到a相。將相c依次添加到所得到的a相和b相的混合物，并充分?jǐn)嚢柚钡叫纬删鶆虻乃?。得到均勻的且穩(wěn)定的霜。
實(shí)施例2
提供了一種美容霜，其中魚卵蛋白分離物和天然產(chǎn)品提取物都是a相的組分，而不是像每一個(gè)實(shí)施例1中魚卵蛋白分離物和天然產(chǎn)品提取物存在于一個(gè)獨(dú)立的c相。通過在室溫下形成a相以避免蛋白變性，得到了一種類似的霜。
比較例
制備與實(shí)施例1進(jìn)行比較的組合物(比較例a)，其不含魚卵蛋白分離物。另一種組合物不含天然產(chǎn)物提取物(比較例b)。也制備了既不含魚卵蛋白分離物又不含天然產(chǎn)品提取物的對(duì)照配方(比較例c)。40個(gè)人的研究組被分成4組，每組人每天使用實(shí)施例1的霜或比較例a-c的任意一種達(dá)12個(gè)星期。測(cè)量每一個(gè)受試者的皮膚的基礎(chǔ)彈性，并且測(cè)得的研究結(jié)論基于以比較例c為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)施例1組合物與比較例a-c相比顯示出優(yōu)越的緊實(shí)度和光滑度。所有的組合物被標(biāo)準(zhǔn)化以達(dá)到這樣的水平：每次在每平方厘米皮膚上使用1x10-6毫克的分離物(如有)和2x10-7毫克的不飽和脂肪酸(如有)。
實(shí)施例3
新鮮的，未受精的鮭魚(安大略鮭魚(salmosalar))卵，其獲取自處于生殖期(晚秋)的雌性，將其放置于冰上，并且最好是立即制備提取物。在不破壞卵膜的情況下，可以在冷凍保護(hù)劑(例如1.5m1,2-丙二醇和0.2m蔗糖)中冷凍干燥的卵。冷凍方式可以是逐漸地(-1–c./min)至-80℃。在整個(gè)提取物制備的過程中，卵應(yīng)當(dāng)被解凍并置于冰上。
將卵放在含有蛋白酶抑制劑(10μg/ml)hbss或海水中洗兩次。去除清洗溶液，將卵溶解并在一個(gè)預(yù)冷凍的杜恩斯玻璃-玻璃勻漿器(dounceglass-glasshomogenator)進(jìn)行勻漿。將溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到貝克曼超純聚合物離心管(beckmanultraclearpolymercentrifugetubes)(5ml)，同時(shí)避免轉(zhuǎn)入卵殼，然后在采用sw55t1轉(zhuǎn)子的貝克曼離心機(jī)中，4℃以15,000g的轉(zhuǎn)速離心15min。由此得到3個(gè)部分，上層部分脂質(zhì)，中間部分細(xì)胞質(zhì)和包含了卵殼和核碎片的底層部分。中間部分細(xì)胞質(zhì)是待收集的提取物。該提取物預(yù)計(jì)將含有最多的胞內(nèi)的細(xì)胞器，包括線粒體、溶酶體和過氧化物酶體，該提取物應(yīng)當(dāng)是清澈的和粘稠的，并且有橙色的色彩。添加蛋白酶抑制劑(10μg/ml貯存物)，并且提取物保持在-80–c。收集斑馬魚的胚胎的中囊胚，去除液體，并且冷凍至-20℃。為制備該提取物，將胚胎放置于冰上解凍，將其溶解，并采用杜恩斯玻璃-玻璃勻漿器(dounceglass-glasshomogenator)在少量的hbss或海水(最好小于50％液體v/v)中進(jìn)行勻漿。該溶解產(chǎn)物經(jīng)一個(gè)無菌的亞麻布過濾，并且在采用了sx4250轉(zhuǎn)子的貝克曼x-22r離心機(jī)中，4℃，以5,000的轉(zhuǎn)速離心20min。收集該細(xì)胞質(zhì)提取物(上清液)，且添加蛋白酶抑制劑(10μg/ml)。該提取物可以被微孔過濾(0.22微米的milliq除菌過濾器)。該提取物被置于-80℃。該提取物的ph采用石蕊試紙來檢測(cè)，其蛋白濃度通過bradford檢測(cè)法來測(cè)定，滲透度通過滲壓計(jì)來測(cè)定。
該通用程序適用于制備來源于海膽、蝦、魚蛋/卵或青蛙卵的提取物。簡略地講，妊娠的雌魚剛產(chǎn)下卵不久，通常在黎明(2-4am)，收集它們的卵，該妊娠的雌魚處于產(chǎn)卵程序中，在產(chǎn)卵之前的6-8小時(shí)注射hcg激素(1ml/kg)，或者來自妊娠的青蛙。將卵/蛋冷凍干燥或冷凍至-20℃或新鮮使用。從不同種類的魚收集卵。對(duì)于海膽，0.5mkcl注射到嘴巴周邊以引發(fā)卵的脫落。通過將蛋/卵破碎(細(xì)胞破碎儀或dounce-勻質(zhì)器)來制備該提取物或在不同的速度離心以分離全部含量的細(xì)胞質(zhì)，帶有/不帶有卵殼(透明帶)，帶有/不帶有核/胞液，帶有/不帶有細(xì)胞器，帶有/不帶有脂質(zhì)?？梢赃M(jìn)行進(jìn)一步的分餾來分離一個(gè)或多個(gè)mrna、蛋白質(zhì)、小肽、碳水化合物和脂質(zhì)。卵中的脂肪酸的主要成分是油酸、亞油酸和ω-3脂肪酸。
采用上述的操作程序來獲得鮭魚卵提取物，該鮭魚卵提取物具有非常高的蛋白質(zhì)含量，該蛋白質(zhì)含量范圍100-380mg/ml，ph在6.4-6.8之間，并且滲透度大約為350mosm。該提取物應(yīng)當(dāng)是清澈的和粘稠的，并且不可過濾的(通過0.45微米的milliq過濾器)。該提取物中的蛋白質(zhì)，因其高蛋白含量和低ph，其可以通過添加水或具有低緩沖容量的含水的溶液被沉淀下來。提取物可以通過添加堿性物(每ml提取物種添加1-3μl1mnaoh)來調(diào)節(jié)ph值至7.0，因此，其在水或含水溶液中稀釋是可以的。斑馬魚提取物的蛋白質(zhì)濃度范圍23-26mg/ml，ph在6.4-6.8之間，并且滲透度在80-150mosm。該提取物是清澈的和不粘稠的，可過濾的且在水中能容易地以各種稀釋比例被稀釋。
實(shí)施例4
凝膠過濾-純化加上親和性-純化得到的鮭魚的魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)通過一個(gè)最終的色譜分析程序可以被進(jìn)一步純化達(dá)到序列級(jí)的純度。該程序用的是pbe94柱子，tris-醋酸緩沖液(10mm,ph9.0)，隨后的洗脫液是具有鹽梯度(高達(dá)1mnacl鹽)的該緩沖液。該步驟增加了魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)的催化活性達(dá)高出7.6倍，714倍的整體純化，和起始材料的28％的產(chǎn)率。該純化步驟使得魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)的蛋白特性保持完整，作為一個(gè)28kda的半族(moiety)。因此，該步驟不從該魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)制備中去除無關(guān)的、主要蛋白污染物。對(duì)于存在于孵化液和“魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)粗產(chǎn)品”中的魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)半族，純化的魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)的分子量與通過westernblotting技術(shù)檢測(cè)得到的相同。
顯然，在第三次和最后的色譜分析程序中發(fā)生的是小的、污染的多肽被去除了。這些多肽似乎是周圍帶有很多殘基的寡肽，最可能來源于卵殼和/或來源于鮭魚胚胎。這些多肽污染物似乎在魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)的催化中發(fā)揮了抑制性作用，因?yàn)樗麄兊娜コ黾恿唆~卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)的催化活性。并且，他們的存在干擾了該魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)產(chǎn)品的edman-測(cè)序的第一步。在這第三個(gè)純化步驟中，兩種形式的魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)結(jié)合到柱子基質(zhì)上的方式似乎有一些不同。然而，兩種形式在它們的n-末端都有相似的氨基酸序列。
來源于cnbr-產(chǎn)生的多肽的部分氨基酸序列確定了魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)作為獨(dú)立的蛋白。從結(jié)構(gòu)分析獲得的啟示：魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)可能具有明顯的催化和底物結(jié)合域，這些能解釋它們對(duì)鈣-螯合劑的敏感性，當(dāng)其作用于大分子(生理學(xué)的)底物(結(jié)合到被抑制的，因此催化被間接地抑制)，也解釋了它們對(duì)于絲氨酸蛋白抑制劑的敏感性，當(dāng)其作用于小的底物(催化被直接抑制)。
實(shí)施例5
魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)和白細(xì)胞凝集素(leukolectin)都從鮭魚孵化液中純化得到。為了提高孵化液的蛋白濃度，鮭魚卵在孵化之前被轉(zhuǎn)移到最少量的水中?？梢酝ㄟ^提高(室)溫度或者通過脫氧作用(oppen-berntsenetal.1990,aquaculture,86,pp.417-430)來誘導(dǎo)高度同步的孵化，其產(chǎn)生了粗制魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)和相關(guān)蛋白高度濃縮的配制品。
魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)的初始純化涉及通過紗布(cheesecloth)過濾孵化的鮭魚卵。該濾液在被解凍和應(yīng)用于進(jìn)一步的蛋白純化之前，可以被冷凍數(shù)年，且不會(huì)有魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)顯著的降解。這一事實(shí)大大地簡化了起始材料的生產(chǎn)，該起始材料用于純化鮭魚的魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)和相關(guān)蛋白，包括白細(xì)胞凝集素(leukolectin)。
下一個(gè)、任選的步驟涉及到將蛋白過濾物加入到4m尿素進(jìn)行調(diào)節(jié)，以分離鮭魚卵殼的碎片，這使得可以通過低速度離心(15,000g的轉(zhuǎn)速，兩次，離心15min)將鮭魚卵殼的碎片連同外源的碎片一起去除。該材料沒有顯示出堵塞柱子的現(xiàn)象，這是經(jīng)與上述的不同的方法制備得到的粗產(chǎn)品的特性。該粗制的蛋白配制品適用于通過傳統(tǒng)的色譜技術(shù)來純化。
孵化液體中的白細(xì)胞凝集素(leukolectin)可以連同魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)被分離。從被部分純化的魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)配制品(如上述)，白細(xì)胞凝集素(leukolectin)可以通過排阻色譜法(exclusionchromatography)被分離出來，因?yàn)轸~卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)的天然形式遠(yuǎn)大于白細(xì)胞凝集素(leukolectin)。第一次分離，使用了superdex16/60柱子，隨后，可以通過親和色譜法過芐脒-瓊脂糖柱子(benzamidine-sepharosecolumns)來去除魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)。
對(duì)于大批量的制備，使用超濾也是適用的，因?yàn)轸~卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)的天然形式不像白細(xì)胞凝集素(leukolectin)基本上不穿過體積排阻為100kda的超濾膜。
使用的緩沖液是毫克分子(millimolar)的tris，其ph大約為中性或弱堿性(ph7.5-8.5)，其含有5mmnacl。白細(xì)胞凝集素(leukolectin)被發(fā)現(xiàn)與魚卵的內(nèi)蛋白酵素(zonase)一同共-純化。該新蛋白質(zhì)的體積，在天然條件下經(jīng)過色譜法估算，僅不足30kda。
該凝集素的mw估計(jì)在25-30kda左右。類似的鮭魚的凝集素的ph估計(jì)大約為6.5。觀察到的pis(riste,未出版)，其在鮭魚的卵周凝集素(salmonperivitellinelectins)的ph值范圍為6.5-6.9，其在鮭魚白細(xì)胞的凝集素(salmonleukocyticlectins)(該凝集素通過westernblotting的技術(shù)被識(shí)別)中的ph值范圍在6.4-6.6。
實(shí)施例6
評(píng)價(jià)采用了上述的配方的日霜和眼霜形式的化妝品的安全性和有效性的研究歷時(shí)12個(gè)星期?？偣蔡暨x了40個(gè)女性受試者，年齡范圍在37-60歲。這40個(gè)參與者全部完成了該研究。
在該研究的條件下，測(cè)試材料以日霜和眼霜的方式被識(shí)別，顯示其改善面部細(xì)線、皺紋、色素沉著、膚色均勻、皮膚透明度、皮膚松弛度和粗糙的觸感，經(jīng)過12個(gè)星期的使用期。另外，該測(cè)試材料能很好地被接受，當(dāng)應(yīng)用到皮膚上，其沒有顯示出導(dǎo)致明顯真皮刺激的可能性。
每天使用兩次，在隨后的第2、6和12周進(jìn)行觀測(cè)，采用packman和gans計(jì)分來測(cè)定面部的表面線條在統(tǒng)計(jì)上顯著的改善，采用直觀類比標(biāo)度(visualanalogscale(vas))計(jì)分來測(cè)定面部色素沉著，膚色均勻，皮膚透明度、皮膚松弛度和粗糙的觸感在統(tǒng)計(jì)上顯著的改善。
在任何后處理期間，從統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性來說，沒有觀測(cè)到刺激(紅斑、水腫、干燥、刺痛、燃燒的和緊繃/干的感覺)的增加。
實(shí)施例7
評(píng)價(jià)抗微生物防腐劑抵抗在采用了上述公開的配方的日霜和眼霜形式的化妝產(chǎn)品中的微生物污染的有效性的研究，在2個(gè)4周的研究周期中進(jìn)行。研究方法采用了ctfa微生物指南，第20部分，m-3，水溶性個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的保藏測(cè)試方法和usp34，第61部分，中和/去除抗菌活性。試驗(yàn)菌包括金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，大腸桿菌(escherichiacoli)，綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)，白色念珠菌(candidaalbicans)和黑曲霉(aspergillusniger)。對(duì)于第2類產(chǎn)品，該防腐劑被認(rèn)為在受試樣品中是有效的，如果a)活菌含量在第7天顯示出不低于3.0log級(jí)數(shù)(99.9％)的降低，相對(duì)于初始計(jì)數(shù)，并且在整段測(cè)試期沒有增加，和b)活菌和霉菌的含量在第7天不低于1.0log級(jí)數(shù)的降低(90％)，相對(duì)于初始計(jì)數(shù)，并且在整段測(cè)試期沒有增加。
研究結(jié)果顯示，該日霜和眼霜符合第2類別產(chǎn)品的接受標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例8
進(jìn)行了一項(xiàng)研究以確定采用上述公開的配方的日霜和眼霜形式的測(cè)試材料的導(dǎo)致黑頭粉刺的能力，通過評(píng)價(jià)該測(cè)試材料是否導(dǎo)致黑頭粉刺，經(jīng)過四周的在閉合的貼劑條件下重復(fù)地應(yīng)用，相對(duì)于陰性對(duì)照(未涂覆的區(qū)域)。為了驗(yàn)證本研究，乙酰化的羊毛脂醇用作陽性對(duì)照。該測(cè)試在4周的研究周期過程中進(jìn)行?？偣?5個(gè)受試者，年齡介于22到45歲之間，被選中參加本研究。15個(gè)受試者都完成了本研究。毛囊的活檢標(biāo)本從測(cè)試位置收集的的評(píng)價(jià)表明，測(cè)試材料和對(duì)照材料被引出0.5的整體評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)(1-24％小角質(zhì))。測(cè)試材料和陰性對(duì)照的每個(gè)毛囊的微黑頭粉刺的平均比率是1％，陽性對(duì)照的是6％。測(cè)試材料和陰性對(duì)照的毛囊的微黑頭粉刺的比例沒有顯著性差異，然而陽性對(duì)照相對(duì)于陰性對(duì)照顯示出顯著的更高比率。
該研究表明在研究期間沒有報(bào)道負(fù)面的體驗(yàn)。測(cè)試材料沒有展示出導(dǎo)致黑頭粉刺的能力。用每一種測(cè)試材料處理的位點(diǎn)和未經(jīng)處理的陰性對(duì)照的貼劑所應(yīng)用的位點(diǎn)，每一個(gè)毛囊的微黑頭粉刺的比率沒有統(tǒng)計(jì)差異。
實(shí)施例9
進(jìn)行了一項(xiàng)研究以確定采用上述公開的配方的日霜和眼霜形式的測(cè)試材料的真皮刺激和敏感的可能性。測(cè)試在8周的研究期內(nèi)進(jìn)行。該研究啟用了225位受試者。11位受試者沒有完成研究，未完成的原因與測(cè)試材料無關(guān)。總共215位受試者完成了該研究。
通過將帶有測(cè)試材料的貼劑應(yīng)用到經(jīng)異丙醇擦拭且被允許進(jìn)行干燥的測(cè)試區(qū)域來進(jìn)行測(cè)試。該測(cè)試材料被應(yīng)用于上背(肩胛骨之間)且使其保持直接的皮膚接觸達(dá)24小時(shí)。在周一、周三和周五，貼劑被應(yīng)用于同樣的位點(diǎn)，在誘導(dǎo)期間總9次使用。這個(gè)時(shí)間安排可以被修改以允許錯(cuò)過的拜訪或假期。如果受試者不能在指定的測(cè)試日期匯報(bào)，該測(cè)試材料在誘導(dǎo)期間連續(xù)兩天使用和/或在誘導(dǎo)期間的最后增加一個(gè)化妝日。這些位點(diǎn)的真皮敏感程度受到監(jiān)督技術(shù)人員的打分，在周二和周四受試者去除了貼劑后的24小時(shí)，和在周日去除貼劑后48小時(shí)，除非如上述的貼劑的時(shí)間安排被改變。
根據(jù)下述的計(jì)分系統(tǒng)對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行打分：
真皮計(jì)分量表
0沒有明顯的皮膚反應(yīng)
+勉強(qiáng)察覺紅斑
1+溫和的紅斑
2+清晰的紅斑
3+嚴(yán)重的紅斑和水腫
4+帶有起泡的紅斑和水腫
如果“2+”反應(yīng)或更強(qiáng)的發(fā)生了，那么將該測(cè)試材料應(yīng)用于臨近的未使用過的位置。如果在新的位置發(fā)生了“2+”反應(yīng)或更強(qiáng)的，那么受試者在該誘導(dǎo)期間不會(huì)被再次貼涂，但是在該研究的適當(dāng)時(shí)候會(huì)被挑戰(zhàn)。貼涂位置的得分低于“2+”可能已經(jīng)被改變，任憑研究主管處理。
之后約2周的測(cè)試期間，挑戰(zhàn)的貼劑被應(yīng)用于背上的之前未處理的測(cè)試位點(diǎn)。24小時(shí)后，貼劑被crl技術(shù)人員去除且評(píng)價(jià)測(cè)試位點(diǎn)的真皮反應(yīng)。24小時(shí)和48小時(shí)，測(cè)試位點(diǎn)被重新評(píng)價(jià)。在該研究的挑戰(zhàn)期間，顯示了反應(yīng)的受試者可能被召回，觀察96小時(shí)。
基于214受試者的測(cè)試人群且在該研究的條件下，眼霜測(cè)試材料沒有顯示出引發(fā)真皮刺激或敏感的能力。
實(shí)施例10
進(jìn)行了一系列的研究以確定采用上述公開的配方且在該配方中添加了額外的防曬指數(shù)(spf)成分的日霜和眼霜形式的測(cè)試材料的真皮刺激和敏感的能力。spf被定義為在被防護(hù)的皮膚上產(chǎn)生最小紅疹所需要的能量數(shù)量與在未處理的皮膚上產(chǎn)生最小紅疹所需的能量數(shù)量的比例，計(jì)算式如下：
i.進(jìn)行了一項(xiàng)研究以評(píng)價(jià)組合了采用上述方法配制的日霜的防曬產(chǎn)品的效率，通過采用國際防曬指數(shù)(spf)測(cè)試方法(2006年5月)在統(tǒng)計(jì)學(xué)條件下來確定防曬指數(shù)(spf)。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的防曬配方與測(cè)試材料同時(shí)被檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)是二甲胺基苯甲酸戊酯氧/氧苯酮spf標(biāo)準(zhǔn)(padimateo/oxybenzonespfstandard(colipap2))(colipap2)。測(cè)試/對(duì)照材料應(yīng)用的位點(diǎn)是在背部，且被隨機(jī)設(shè)置以使得接受到單獨(dú)的測(cè)試材料的治療背部區(qū)域?qū)τ谒惺茉囌邅碚f是不同的?？偣?0位男性和女性受試者，年齡在25歲到57歲之間且基本上身體健康，被選中參與這項(xiàng)研究。在整個(gè)研究期間，沒有不良事件的報(bào)道。
ii.進(jìn)行了一項(xiàng)研究以評(píng)價(jià)組合了采用上述方法配制的日霜的spf30的防曬產(chǎn)品的效率，根據(jù)日本化妝品行業(yè)協(xié)會(huì)(jcia)的uva防護(hù)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(01/01196)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)條件下，確定紫外線a(uva)防曬因子(pfa)?？偣?0位成年受試者參與了這項(xiàng)研究。一個(gè)疝氣弧多端口陽光模擬器(xenonarcmulti-portsolarsimulator)(150w,model15s,solarlightcompany,philadelphia,pa)，具有uva和uvb波段(290-400nm)的紫外線連續(xù)的放射波譜，其被用于紫外線輻射的來源并且被過濾以提供一個(gè)基本的像陽光一樣的波譜。采用了下面的過濾器以保證合適的波譜輸出：schottwg33513mmandug1111mm。光輸出(lampoutput)在每一個(gè)受試者受到uv強(qiáng)度儀表(uvintensitymeter)(modelpma2100,solarlightcompany,philadelphia,pa)測(cè)試之前被及時(shí)測(cè)量。陽光模擬器的光輸出的波譜分布每年校正一次。
黑化是暴露于uva后在皮膚上觀察到的棕灰色(brown-gray)到棕黑色的反應(yīng)，是因?yàn)楣?氧化反應(yīng)，在該反應(yīng)中無色黑色素前體被氧化以形成著色的黑色素。最小的持久的黑化(mppd)被定義為在未處理的皮膚上誘發(fā)這樣的反應(yīng)所必須的uva光輻射劑量。在測(cè)試階段之前，每個(gè)受試者的mppd是通過uv光曝露的漸進(jìn)的等比數(shù)的確定。uva輻射的劑量的增加倍數(shù)為1.25.輻射后2到4小時(shí)，根據(jù)下面的計(jì)分系統(tǒng)來評(píng)價(jià)這些位點(diǎn)的黑化情況。
0陰性，沒有明顯的反應(yīng)；
±勉強(qiáng)察覺(最小)黑化；
1+明確的(中等的)黑化；
2+顯著的或界限清楚的黑化。
用手術(shù)記號(hào)筆在受試者肩胛骨和腰圍之間、中線兩側(cè)的后背上畫出尺寸為5*10cm的測(cè)試位點(diǎn)的輪廓。這些區(qū)域被指定為測(cè)試材料或防曬標(biāo)準(zhǔn)。鄰近的位點(diǎn)被指定為在未處理的皮膚上同時(shí)進(jìn)行mppd測(cè)定。經(jīng)產(chǎn)品應(yīng)用后，每個(gè)測(cè)試區(qū)域被再分為大約1平方厘米位點(diǎn)，用于確定連續(xù)的uva光曝露。
測(cè)試材料或標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)0.1ml份被應(yīng)用于合適的測(cè)試位點(diǎn)且使用指套使其平均地延伸到整個(gè)位點(diǎn)(相當(dāng)于2μl/cm2)。使用后，15分鐘到30分鐘之間開始對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行輻射?；谥按_定的未受保護(hù)的皮膚的測(cè)定的mppd和測(cè)試材料或標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)期pfa，為每一個(gè)處理位點(diǎn)選擇曝露時(shí)間。在曝光后2到4小時(shí)對(duì)所有的測(cè)試位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)以測(cè)定最小的持久黑化反應(yīng)。
uva的保護(hù)因子(pfa)被定義為在受防護(hù)的皮膚上產(chǎn)生一個(gè)mppd所需要的時(shí)間量除以在未處理的皮膚上產(chǎn)生一個(gè)mppd所需要的時(shí)間量的比率，計(jì)算式如下：
標(biāo)準(zhǔn)誤差需要在測(cè)試值的10％以內(nèi)。
被輻射處理的位點(diǎn)的pfa值的整數(shù)值確定了uva的防護(hù)級(jí)別。由于所有pfa值都大于或等于2，采用下面的分類方法來確定保護(hù)級(jí)別：
遞交的測(cè)試材料spf30的日霜在10個(gè)受試者中表現(xiàn)出的平均uva防護(hù)值為pfa6.5。
iii.進(jìn)行了一項(xiàng)研究以評(píng)價(jià)采用上述配方配制而成的含有廣譜防曬功能的防曬活性物日霜測(cè)試材料，通過按照fda(聯(lián)邦公報(bào)/vol76,no117/星期五,6月17日，2011年/規(guī)則和規(guī)定)給出的方法測(cè)定其關(guān)鍵的波長。
防曬產(chǎn)品的吸光度是從290nm開始跨越整個(gè)uv波長的總和，直到總和數(shù)達(dá)到90％的該防曬產(chǎn)品在紫外波長范圍(290-400nm)的總吸光度。吸光度的總和達(dá)到總吸光度的90％時(shí)的波長被定義為關(guān)鍵波長(criticalwavelength)并且被認(rèn)為是防曬保護(hù)的寬幅的度量衡。當(dāng)關(guān)鍵波長大于370nm時(shí)，具有它們?cè)趗va中的吸光度的一個(gè)重要部分的防曬產(chǎn)品被歸類為廣譜(broadspectrum)的防曬產(chǎn)品。
測(cè)定每一個(gè)波長在整個(gè)uv光譜區(qū)(290-400納米)的光譜透射率(spectraltransmittance)。每間隔1nm測(cè)量一次透射率的值。
測(cè)試材料帶有spf的日霜的關(guān)鍵的波長是371.00nm，該波長滿足了“廣譜”標(biāo)簽所要求的最低370nm的關(guān)鍵波長標(biāo)準(zhǔn)。
進(jìn)行了一項(xiàng)相似的測(cè)試研究以評(píng)價(jià)采用上述配方配制而成的含有廣譜防曬功能的防曬活性物日霜測(cè)試材料，通過按照colipa的2011年的指南來測(cè)定其體外uva防護(hù)因子(uva-pf)、spf/uva-pf比率和該日霜的關(guān)鍵波長。
本說明書中提及的任何發(fā)明文獻(xiàn)或出版物都在此通過引用的方式并入，并入的程度如同任何一個(gè)單獨(dú)的出版物被特定地和單獨(dú)地說明以通過引用的方式被并入。
上述的說明書是本發(fā)明特定實(shí)施方式的舉例說明，它不應(yīng)當(dāng)成為實(shí)施本發(fā)明的限制。