本發(fā)明涉及銀杏黃酮提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從銀杏葉中高效率提取黃酮的發(fā)酵生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

銀杏黃酮即銀杏葉提取物，它能夠增加腦血管流量，改善腦血管循環(huán)功能，保護腦細(xì)胞，擴張冠狀動脈，防止心絞痛及心肌梗塞，防止血栓形成，提高機體免疫能力。對冠心病、心絞痛、腦動脈硬化、老年性癡呆、高血壓病人均十分有益。但是，在銀杏葉提取物中經(jīng)常會摻雜銀杏酸。銀杏酸具有潛在的致敏和致突變作用、和強烈的細(xì)胞毒性,可引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)、基因突變、神經(jīng)損傷,導(dǎo)致惡心和胃灼熱、過敏性休克、過敏性紫癜、剝脫性皮炎、消化道黏膜過敏、痙攣和神經(jīng)麻痹等不良反應(yīng)。因此，在提取方法中去除這些雜質(zhì)是必須的。

銀杏葉提取物的生產(chǎn)工藝有很多，國外多采用有機溶劑法，有代表性的工藝是德國schwabe公司的一系列專利de2117419、de1767098、de3940092；以及意大利indena公司的專利工藝ep0360556，這些工藝的共同特點是生產(chǎn)過程中使用大量的有機溶劑，如丙酮、乙醇、四氯化碳、正己烷、甲乙酮、正丁醇等，工藝的優(yōu)點是產(chǎn)品質(zhì)量好且穩(wěn)定，缺點是生產(chǎn)成本極高，生產(chǎn)工藝安全性差、對環(huán)境影響大。

國內(nèi)外目前都主要以銀杏葉為原料提取銀杏黃酮。分離純化銀杏黃酮的方法很多，包括溶劑浸提法、超臨界法、超聲波法、微波輔助提法、微波法、高速逆流法、大孔樹脂吸附法法、聚酰胺柱層析法、和酶法等，其中最成熟和最常用的提取工藝是溶劑浸提法。

例如cn102805755a涉及一種從從銀杏葉中提取高品質(zhì)銀杏黃酮的制備方法。用去離子水從銀杏葉中提取粗提液，經(jīng)過濾后醇沉除雜、澄清劑除雜、富集銀杏黃酮和內(nèi)酯，利用極性、弱極性的大孔樹脂進行初分離。樹脂脫除銀杏酸最終銀杏提取物產(chǎn)品。該發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢在于：a)聯(lián)合使用不同性能的大孔樹脂來富集銀杏黃酮和內(nèi)酯、脫出銀杏酸，使產(chǎn)品品質(zhì)明顯提高，保證了產(chǎn)品。b)簡化生產(chǎn)工藝，縮短生產(chǎn)周期，使生產(chǎn)成本有所降低。c)使用了無毒無害的有機溶劑及天然澄清劑，大大降低了產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)的殘留量，提高了產(chǎn)品的品質(zhì)。但是在分離過程中需要醇沉除雜、澄清劑除雜步驟復(fù)雜。

cn101463051a中公開了一種用碳酸鈣提取銀杏黃酮的制備工藝，包括：(1)稱取原料銀杏葉，將其粉碎；加水為銀杏葉重量的6～8倍，同時加入銀杏葉重量0.5～1.5％的碳酸鈣，煮沸1～1.5小時后過濾，得一次水提液，即為一次提取；同樣方法，進行二次提取，得二次水提液；合并一次、二次水提液，即得合并液；(2)將合并液在60～70℃溫度下真空濃縮至合并液體積的0.5～0.6倍，加入乙醇，至乙醇度為40～50％，充分?jǐn)嚢?，靜置3～4小時后過濾；加水稀釋過濾液，使得乙醇度為15～20％，用稀硫酸調(diào)至ph值為3.0，得稀釋濾液，將稀釋濾液用dm131樹脂柱吸附；(3)將乙醇度為20％的乙醇水溶液用稀硫酸調(diào)至ph值為3.0，洗脫樹脂柱雜質(zhì)，再用水沖洗至中性；(4)最后，用乙醇度為70％的乙醇水溶液洗脫有效成分，然后將洗脫液在60～70℃溫度下真空濃縮、干燥，即得銀杏黃酮提取物。該方法需要大量使用酸液，同時產(chǎn)量也不是很高，而且工藝復(fù)雜不利于工業(yè)化規(guī)模化生產(chǎn)。

cn1166675a中公開了一種生產(chǎn)高活性銀杏葉提取物的工藝，其特征在于所述的工藝包括以下步驟：(1)在待處理的銀杏葉中加入萃取劑亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉，添加量按w/w比例為0.001-0.5，并補充水至100；(2)按w/w，將干凈的銀杏葉按原料與萃取劑之比為1∶5-20，投料浸提萃取，浸提溫度30-100℃，處理30分鐘-20小時，浸提過程中間歇攪拌原料，控制降溫速度1-10℃/小時，然后留取料液，再加入5-20倍于銀杏葉的萃取劑進行第二次提取，合并兩次料液；(3)將步驟(2)得到的料液過濾，去除200目以下的雜質(zhì)，料液冷卻至30℃以下；(4)將步驟(3)得到的料液流經(jīng)樹脂吸附柱精制純化，用水洗滌去除雜質(zhì)后，再用30％-95％的低級醇沖洗樹脂柱，得到洗脫液；(5)將步驟(4)所述的洗脫液在溫度50℃以下真空濃縮，回收溶劑，得到濃縮液；(6)將步驟(5)得到的濃縮液干燥，和(7)將步驟(6)得到的產(chǎn)品采用反相高效液相色譜法定量分析銀杏黃酮、萜內(nèi)酯、原花青素和銀杏酚酸。該方法同樣產(chǎn)量不高，在制備工藝上也較為復(fù)雜，有巨大的改進空間。

另外，在現(xiàn)有技術(shù)中提取劑通常具有較大的毒性，對人的身體也有較大危害，在生產(chǎn)過程中也有潛在的危險。。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種從銀杏葉中效率提取黃酮的發(fā)酵生產(chǎn)方法，主要包括粉碎，滅菌，蒸汽爆破，發(fā)酵，酶解，提取，乙醇處理，濃縮，干燥等這幾個步驟。

具體的，本發(fā)明提供了一種從銀杏葉中效率提取黃酮的發(fā)酵生產(chǎn)方法，取銀杏葉清潔干凈，粉碎成為20-100目，銀杏葉加水混合，加水量40％-60％；混合物裝入發(fā)酵罐，在121℃殺菌，隨后進行蒸汽爆破；接種黑曲霉，108個/ml種子液接種量為100ml/100kg，發(fā)酵條件為30℃3d；而后加入混合酶液，加入量為反應(yīng)底物的2％-5％，在25-30℃條件下反應(yīng)時間為3-6小時，隨后加入蛋白酶1％，25-30℃條件下，反應(yīng)時間為3-4小時；升溫95℃10min，隨后加入提取劑進行黃酮的提取，12000g離心20min，取上清濃縮后，采用乙醇浸提提取，收得乙醇洗脫液，濃縮，采用冷凍干燥，得到產(chǎn)品。

本發(fā)明另外一方面，所述蒸汽爆破采用飽和水蒸氣為工作介質(zhì)，壓力為0.73mpa，保壓時間為70秒；

本發(fā)明另外一方面，所述酶液為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶這三種酶液的組合；具體的組成比例為纖維素酶：半纖維素酶：果膠酶＝2:1:5。

本發(fā)明另外一方面，所述的提取劑為4％檸檬酸鈉，ph為8.0。提取條件為按照銀杏葉重量與萃取劑之比為1∶2-4，投料浸提提取，提取溫度30-100℃，處理1-5小時，浸提過程中間歇10min攪拌原料即可。

本發(fā)明另外一方面，所述的生產(chǎn)原料可以是銀杏鮮葉或經(jīng)干燥的銀杏葉，所述的葉不需要經(jīng)過粉碎。

本發(fā)明另外一方面，黑曲霉可以為保藏號cctccm2012515。

本發(fā)明另外一方面，將乙醇洗脫液在真空條件下濃縮。

本發(fā)明另外一方面，所述的生產(chǎn)工藝采用冷凍干燥或噴霧干燥或真空干燥將濃縮液進行干燥。

本發(fā)明另外一方面，用高效液相色譜法(hplc)檢測提取物中銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯和銀杏酚酸含量的方法分別為:銀杏黃酮的檢測方法為:流動相:甲醇:磷酸:水＝57:0.2:42.8，流速為1.0ml/min，檢測波長為370nm，色譜柱溫:25℃，進樣量:20μl；銀杏內(nèi)酯的檢測方法為:流動相為甲醇:水＝25:75，流速1.0ml/min，檢測器為elsd；原花青素檢測方法為檢測波長：280nm；柱溫30℃；流動相流速為1.0ml/min；流動相：a，20.0％乙酸；b:80％乙腈；采用梯度洗脫：0min-85min，100％-20％a；6min-85min，4％-80％b，進樣量：10μl；銀杏酚酸檢測方法為甲醇:水＝90:10，流速為1.0ml/min，檢測波長為310nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述提取黃酮的方法有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明采用黑曲霉以及復(fù)合酶溶液對銀杏葉組織進行了前期處理，改善了物料細(xì)胞內(nèi)成分的傳質(zhì)特性；植物細(xì)胞壁起保護作用，防止細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的隨意出入，主要由纖維素和果膠物質(zhì)組成，因此采用纖維素酶和果膠酶溶解細(xì)胞壁，可有效地促進植物細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出；特別是黑曲霉發(fā)酵與復(fù)合酶處理二者結(jié)合起來，效果比現(xiàn)有技術(shù)的有顯著的提高。

2、采用蒸汽爆破進行特異性的處理方式，特別是針對銀杏葉組織進行了爆破的條件優(yōu)化，能夠快速釋放組織內(nèi)的黃酮物質(zhì)。

3、通過大量的實驗最終選擇了檸檬酸鈉作為提取劑，比現(xiàn)有技術(shù)的比如亞硫酸氫鈉具有無毒的效果，使用起來效率更高，具有更好的提取效果。最為重要的是能夠有效的去除銀杏酸。

4、本發(fā)明提取過程不需要使用大孔樹脂，節(jié)約成本，同時用乙醇作為浸提，提取率較高，且提取溫度較低，無有機溶劑殘留，降低了對雜質(zhì)的溶解能力，使黃酮提取物的一次加工純度達到98.6％以上，因此，本發(fā)明具有提取物純度高和提取率好、安全性高的優(yōu)點；

5、采用冷凍干燥，保持黃酮有效成分不被破壞，生物活性高，工藝過程中從未使用有毒有害的有機溶劑，得到的最終產(chǎn)品無有機溶劑殘留；適宜人類放心使用。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳述。具體實施方式只是展示最佳的實施方式，但是不能限定本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

取清潔干凈的干燥的銀杏葉100kg，粉碎成為20目，銀杏葉加水混合，加水量50％；混合物裝入發(fā)酵罐，在121℃殺菌，隨后進行蒸汽爆破，蒸汽爆破采用飽和水蒸氣為工作介質(zhì)，壓力為0.73mpa，保壓時間為70秒；接種黑曲霉，108個/ml種子液接種量為100ml，發(fā)酵條件為30℃3d；而后加入混合酶液：纖維素酶：半纖維素酶：果膠酶＝2:1:5，加入量為反應(yīng)底物的2％，在30℃條件下反應(yīng)時間為6小時，隨后加入蛋白酶1％，30℃條件下，反應(yīng)時間為4小時；升溫95℃10min，隨后加入ph為8.0、4％的檸檬酸鈉，提取條件為按照銀杏葉重量與萃取劑之比為1∶3，投料浸提提取，提取溫度60℃，處理3小時，浸提過程中間歇10min50r/min攪拌原料即可。12000g離心20min，取上清采用濃縮塔進行濃縮濃縮比為1:10，濃縮液用無水乙醇浸提，乙醇的最終濃度為90％，收得乙醇浸提液，濃縮塔進行濃縮濃縮比為1:15，采用噴霧冷凍干燥機進行冷凍干燥，得到得4.36kg淡黃色銀杏葉提取物產(chǎn)品。

具體的成分采用了高效液相色譜進行分析，檢驗結(jié)果為：總黃酮甙38.1％，總萜內(nèi)酯10.6％，原花青素12.4％，銀杏酚酸0.1ppm，水中溶解度11.7％，其中銀杏酸含量0.01ppm幾乎檢測不到。

實施例2對照例1

萃取劑的成分及配比(按份量計算)：亞硫酸氫鈉10kg；自來水8000kg；ph5.0。將干燥的銀杏葉300kg清潔干凈，濾水，投入提取罐，加入94℃的萃取劑5000kg，加蓋密閉，升高提取罐內(nèi)溫度使之達到97℃，并保持1個大氣壓，每半小時攪拌1分鐘，控制罐內(nèi)溫度每小時下降2.5℃，浸提16小時后，濾出料液4400kg。再向提取罐中加入3000kg萃取劑溶液，進行第二次浸提，10小時后濾出料液3100kg，合并兩次料液用離心過濾機粗濾出20目以下雜質(zhì)，砂濾機精濾出200目以下雜質(zhì)，并將料液冷卻到30℃。

將料液以1500kg/小時流量流過nka-9樹脂吸附柱，然后用水洗下不被吸附或吸附較小的雜質(zhì)，換2倍柱體積去離子水洗滌，再用70％的乙醇沖洗樹脂吸附柱，收得乙醇洗脫液1500kg，在43℃溫度下采用三效濃縮塔濃縮乙醇洗脫液20倍，濃縮液采用冷凍干燥，得到產(chǎn)品9.75kg。

檢驗結(jié)果：總黃酮甙28.0％，總萜內(nèi)酯9.3％，原花青素10.4％，銀杏酚酸3.8ppm，水中溶解度7.8％。

實施例3對照例2

(1)用粉碎機將100公斤銀杏葉粉碎，倒入提取罐中，加入700公斤水，同時加入1.5公斤的碳酸鈣，加熱，水沸1.2小時后過濾，得一次水提液；同樣的方法再提取一次，合并一次、二次水提液，即得合并液；

(2)將合并液在65度在真空濃縮罐中濃縮至50l，加入乙醇，至乙醇度為45％，充分?jǐn)嚢瑁o置3.5小時后過濾，丟棄醇沉渣；加水稀釋過濾液，使得乙醇度為18％，用稀硫酸調(diào)至ph值為3.0，得稀釋濾液；將稀釋濾液用dm131樹脂柱吸附，樹脂柱徑高比為l:5，流速lbv/h，樹脂用量為樹脂用量為50公斤(體積為50.1l)；

(3)將100l乙醇度為20％的乙醇水溶液用稀硫酸調(diào)至ph值為3.0，洗脫雜質(zhì)2小時，洗脫流速為1bv/h，再用水沖洗至中性；

(4)用400l乙醇度為70％乙醇水溶液洗脫有效成分3小時，流速2bv/h，然后將洗脫液在6(tc溫度下真空濃縮、干燥，得銀杏黃酮提取物2.5公斤，其中總黃酮甙為25.4％，總萜內(nèi)酯為7.3％，原花青素9.1％，銀杏酚酸為3.4ppm。

通過以上實例可以看出，本發(fā)明的提取物具有較好的提取效果，特別是銀杏酚酸具有顯著的降低趨勢，同時提取步驟也簡單，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。