本發(fā)明涉及腫瘤診斷放射性藥物，特別涉及一種卟啉脂質(zhì)體放射性藥物^99mtc-texaphyrinnps及其制備方法。

背景技術(shù)：

分子探針是分子影像技術(shù)的核心研究內(nèi)容之一。近年來，用放射性核素、熒光染料、順磁和超順磁材料等標(biāo)記的用于不同顯像模態(tài)的分子探針的研究成幾何量級增長。與傳統(tǒng)小分子探針相比，納米分子探針具有整合多元化功能與設(shè)計、藥物包裹于運載、體內(nèi)循環(huán)時間長及能夠通過epr(enhancedpermeabilityandretentioneffect)效應(yīng)被動靶向腫瘤等特點，從而可以增加藥物的抗癌功效并減小毒副作用。基于納米分子探針的多功能特性可以為臨床醫(yī)學(xué)提供一個集早期診斷、實時監(jiān)測、定位診斷與個性化干預(yù)于一體的診治系統(tǒng)。納米探針的研究已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要方向之一，但是過去的納米材料絕大多數(shù)是無機的，不僅難以降解，而且對人體會有微量毒性。脂質(zhì)分子作為生物體組成的主要成分具有無可比擬的生物相容性，其自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)無論從均一性、穩(wěn)定性，以及重復(fù)性方面，都有很大的優(yōu)勢。在美國食品與藥物管理局(fda)現(xiàn)已批準(zhǔn)使用和投入市場的若干種類的納米材料中，脂質(zhì)體是目前應(yīng)用最為普及的納米藥物制劑形式。

2011年，加拿大多倫多大學(xué)的鄭崗教授研究組構(gòu)建了一種全新的、無毒的、可生物降解、具有高度靈敏度、由卟啉雙分子層自組裝形成的新型脂質(zhì)體-卟啉納米囊泡（命名為porphysome）。porphysome的內(nèi)層和外層都是由磷脂類物質(zhì)構(gòu)成，具有極好的酶生物降解性；而中間夾層中起作用的是天然卟啉衍生物，無毒可降解，對人體無害。porphysome的多功能特征體現(xiàn)在：一方面它本身是一種光敏劑，可用于pdt治療（光動力治療），當(dāng)這種有機納米藥物到達腫瘤部位后，用激光照射腫瘤部位，這種藥物可以讓腫瘤組織中存在的基態(tài)氧轉(zhuǎn)為殺傷力極強的激發(fā)態(tài)氧，對腫瘤產(chǎn)生殺傷。另一方面，這種納米顆粒由8萬多個分子組成，密度很高，本身又具有光熱性功能，能用于光熱治療。此外，porphysome還可以用于癌癥的早期診斷。其組成成分之一的卟啉分子（此處為四氮環(huán)卟啉），一方面有熒光特征，能進行熒光成像。另一方面它也是優(yōu)良的金屬螯合劑，其中心的四個氮原子可以與許多二價金屬離子結(jié)合生成非常穩(wěn)定的有機絡(luò)合物。鄭崗課題組將porphysome標(biāo)記了放射性核素⁶⁴tc，并在原位前列腺腫瘤小鼠模型成功進行了pet顯像（positronemissioncomputedtomography，正電子發(fā)射計算機斷層顯像）。porphysome有非常良好的生物安全性及理化性質(zhì)，在開發(fā)診治結(jié)合的多功能分子探針方面有極大的應(yīng)用前景。但是目前所用的porphyrin（四氮環(huán)卟啉）不能與核磁增強劑gd及放射性核素¹⁷⁷lu等3價金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，限制了它在核磁成像以及核醫(yī)學(xué)顯像和治療等領(lǐng)域的進一步開發(fā)。

1988年美國德克薩斯大學(xué)(奧斯汀)的j.l.sessler教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組合成出一種稱為texaphyrin(原意為德克薩斯卟啉)的擴展卟啉。texaphyrin是一類三吡咯五氮雜環(huán)的卟啉衍生物（也可簡稱為5n卟啉），它能與三價金屬gd³⁺螯合獲得一種螯合有g(shù)d的卟啉衍生物gadoliniumtexaphyrin（gd-tex）。gd-tex可以選擇性地在腫瘤組織聚集，能用于磁共振成像（mri，magneticresonanceimaging）進行體內(nèi)組織定位。相對之前提到的4n卟啉，texaphyrin具有五氮雜環(huán)，能夠與超過28種金屬離子形成穩(wěn)定的1:1化合物，其中不但包括許多二價過渡金屬，也包括許多特別是三價的鑭系金屬離子。最近，一種新型錳(ii)-5n卟啉-磷脂脂質(zhì)體被用于mri的成像研究，同時5n卟啉磷脂也被證實可以與多種金屬離子形成穩(wěn)定的化合物。目前，尚沒有5n卟啉-磷脂脂質(zhì)體使用單光子發(fā)射核素直接標(biāo)記方法，也沒有5n卟啉-磷脂脂質(zhì)體放射性標(biāo)記物在單光子斷層成像（single-photonemissioncomputedtomography，spect）領(lǐng)域中的的體內(nèi)應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種卟啉脂質(zhì)體放射性藥物^99mtc-texaphyrinnps及其制備方法，所述放射性藥物以德克薩斯卟啉-磷脂化合物、膽固醇、大豆氫化磷脂和磷脂-聚乙二醇2000為原料，且該藥物的制備過程中不需要連接在常規(guī)標(biāo)記中所需要的任何雙功能螯合劑，如dtpa（二乙基三胺五乙酸）、hynic（6-叔丁氧羰肼基煙酸）等，放射性核素^99mtc標(biāo)記在不需要連接任何小分子多功能螯合劑的情況下實現(xiàn)自身標(biāo)記形成^99mtc-texaphyrinnps。該藥物能夠以被動靶向的方式濃聚到具有epr效應(yīng)的腫瘤部位中，利用核醫(yī)學(xué)的spect顯像技術(shù)，可對腫瘤或其他具有epr效應(yīng)的疾病進行顯像診斷和檢測。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種卟啉脂質(zhì)體放射性藥物^99mtc-texaphyrinnps，包括納米材料和放射性核素^99mtc，所述納米材料是由texaphyrin-lipid組成的脂質(zhì)體納米脂質(zhì)體，即texahyrinnps，所述放射性核素^99mtc標(biāo)記在不需要連接任何小分子多功能螯合劑的情況下實現(xiàn)自身標(biāo)記形成^99mtc-texaphyrinnps，所述texaphyrinnps放射性藥物為淡黃色透明注射針劑。

所述的卟啉脂質(zhì)體放射性藥物^99mtc-texaphyrinnps的制備方法，包括以下步驟：

1）texaphyrinnps納米材料的制備

將德克薩斯卟啉-溶血磷脂（texaphyrin-lipid）、膽固醇、氫化大豆磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（dspe-peg2000）充分溶于三氯甲烷中，通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀緩慢蒸干溶劑并在茄型瓶內(nèi)壁上均勻形成磷脂薄膜，在真空干燥器中過夜除去任何有機溶劑，在瓶中加入ph為5.5的醋酸銨緩沖溶液，水化在55攝氏度的水浴超聲中進行，直至脂膜溶解，制備粗制的脂質(zhì)體溶液，將所述粗制的脂質(zhì)體溶液通過裝有雙層100nm孔徑聚碳酸酯膜的morgecle-15脂質(zhì)體擠出器進行多次擠出，擠出溫度為55攝氏度，擠出液用ph為5.5的醋酸銨緩沖溶液配置成濃度為0.4mg/ml的texaphyrinnps溶液，最后經(jīng)過pvdf濾膜過濾進行無菌分裝，即得到所述texaphyrinnps納米材料；

2）^99mtc-texaphyrinnps的制備

將步驟1）制備得到的texaphyrinnps納米材料置于1.5ml的小管中，加入tppts和na[^99mtco4]，將反應(yīng)液置于60℃的空氣浴或金屬浴加熱器中反應(yīng)15-20分鐘，反應(yīng)結(jié)束后室溫冷卻10分鐘，加入1ml磷酸鹽緩沖液，制成所述的卟啉脂質(zhì)體放射性藥物^99mtc-texaphyrinnps，通過超濾方法進行純化，經(jīng)過放射性薄層層析或放射性高效液相色譜鑒定標(biāo)記物的放射化學(xué)純度。

進一步的，步驟1）中所述德克薩斯卟啉-溶血磷脂（texaphyrin-lipid）、膽固醇、氫化大豆磷脂和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000，各組分的摩爾比例分別為30%：30%：35%：5%。

進一步的，步驟2）中所述放射性薄層層析的方法為：展開紙選用長10cm、寬1.5cm的agilentitlc-sg硅膠玻璃纖維快速展開紙，樣品點于1cm處，用生理鹽水溶液進行展開，展開至9cm處將紙條取出自然晾干，展開后的紙條用bioscanar-2000進行檢測，其中，原點為^99mtc的標(biāo)記物，前沿為游離的^99mtc離子。

進一步的，步驟2）中所述放射性高效液相色譜檢測方法為：使用安捷倫1260infinityhplc系統(tǒng)配備superose-12排阻柱，流動相為1ml/min的0.01m，ph為7.0的醋酸銨緩沖液，淋洗時間為30min，^99mtc標(biāo)記的納米標(biāo)記物的保留時間為7分鐘，游離的^99mtc的保留時間為15分鐘。

這里報道的5n卟啉-磷脂（texaphyrin-lipid）結(jié)構(gòu)及5n卟啉脂質(zhì)體的組成為（圖1a），在本發(fā)明中設(shè)計的5n卟啉具有親脂性，溶血磷脂上的羥基與5n卟啉上的羧基共價連接，形成一頭親水一頭親脂的雙親結(jié)構(gòu)。5n卟啉磷脂具有類似一般磷脂的特點，可以形成類似脂質(zhì)體的自組裝結(jié)構(gòu)并且也可以作為脂質(zhì)體的原料之一形成不同的脂質(zhì)體。5n卟啉脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)示意圖及粒徑和電位為（圖1b）。5n卟啉具有多種金屬核素螯合的潛力并在制備成texaphyrinnps納米探針后可實現(xiàn)^99mtc的固有直接標(biāo)記并用于體內(nèi)研究。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：

1、本發(fā)明所述的卟啉脂質(zhì)體放射性藥物，在制備過程中不需要連接在常規(guī)標(biāo)記中所需要的任何雙功能螯合劑（如dota、hynic等），放射性核素^99mtc標(biāo)記在不需要連接任何小分子多功能螯合劑的情況下實現(xiàn)自身標(biāo)記形成^99mtc-texaphyrinnps；

2、本發(fā)明所述的卟啉脂質(zhì)體放射性藥物用于具有epr效應(yīng)的疾病中spect顯像，實現(xiàn)該新型納米材料診治一體化中“診”的目的；

3、本發(fā)明所述的卟啉脂質(zhì)體放射性藥物可藥盒化，在德克薩斯卟啉脂質(zhì)體中加入還原劑三苯基膦三間磺酸鈉鹽（3,3′,3″-phosphanetriyltris(benzenesulfonicacid)trisodiumsalt，tppts）和放射性核素^99mtc后進行加熱即可實現(xiàn)固有標(biāo)記；

4、本發(fā)明所述的卟啉脂質(zhì)體放射性藥物能夠以被動靶向的方式濃聚到具有epr效應(yīng)的腫瘤部位中，利用核醫(yī)學(xué)的spect顯像技術(shù)，可對腫瘤或其他具有epr效應(yīng)的疾病進行顯像診斷和檢測。

以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明。

附圖說明

圖1為texaphyrinnps納米材料的組成成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)及摩爾占比（a）及texaphyrinnps納米探針的自組裝示意圖和該探針的粒徑表征和電位表征（b）；

圖2為純化后的texaphyrinnps納米材料與普通脂質(zhì)體為對照品的放射性hplc和itlc結(jié)果圖（a），^99mtc-texaphyrinnps與對照實驗組標(biāo)記情況對比（b）；

圖3為^99mtc-texaphyrinnps在c57b/l6小鼠路易斯肺癌皮下模型中于注射后4h和12h的生物分布；

圖4為^99mtc-texaphyrinnps在c57b/l6小鼠路易斯肺癌皮下模型中注射后2、4、6和8h后的nanospect/ct的3d-mip顯像圖(虛線圈與箭頭指示腫瘤位置)。

具體實施方式

實施例1

1材料：

氫化大豆磷脂（hspc）和膽固醇（cholesterol）購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司(avt)。德克薩斯卟啉磷脂由多倫多大學(xué)醫(yī)學(xué)生物物理學(xué)系提供。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000購自美國avantipolarlipids公司。醋酸和醋酸銨購自美國sigma-aldrich。tris(3-sulfonatophenyl)phosphinesodiumsalt(tppts)購自中國j&k百靈威科技有限公司。na^99mtco4購自中國原子高科股份有限公司。

2方法與結(jié)果

2.1放射化學(xué)純度方法

itlc方法：選用agilentitlc-sg硅膠玻璃纖維紙，裁剪為長為10厘米，寬為1.5厘米的長方形紙條。將樣品點于1cm處，用生理鹽水溶液進行展開，展開至9cm處將紙條取出自然晾干。展開后的紙條用bioscanar-2000進行檢測。

hplc檢測方法：使用安捷倫1260infinityhplc系統(tǒng)配備superose-12排阻柱，流動相為1ml/min的0.01m，ph為7.0的醋酸銨緩沖液。淋洗時間為30min，^99mtc標(biāo)記的納米標(biāo)記物的保留時間為7分鐘，游離的^99mtc的保留實際那為15分鐘。

2.2texaphyrinnps納米材料的制備

將2mg德克薩斯卟啉-溶血磷脂（texaphyrin-lipid），0.86mg膽固醇，1.5mg大豆氫化卵磷脂（hspc）和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（dspe-peg2000）充分溶于5ml三氯甲烷，各組分的摩爾比例分別為30%：30%：35%：5%。圖1-a為texaphyrinnps脂質(zhì)體納米材料的組成成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)及摩爾比例（a）。通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀緩慢蒸干溶劑并在茄型瓶內(nèi)壁上均勻形成磷脂薄膜，在真空干燥器中過夜除去任何有機溶劑。在瓶中加入4mlph為5.5的醋酸銨緩沖溶液（0.1m，經(jīng)過chelex100樹脂除離子）。水化在55攝氏度的水浴超聲中10分鐘，直至脂膜溶解，制備粗制的脂質(zhì)體溶液。將脂質(zhì)體溶液通過裝有雙層100nm孔徑聚碳酸酯膜的morgecle-15脂質(zhì)體擠出器進行多次擠出，擠出溫度為55攝氏度。擠出液用ph為5.5的醋酸銨緩沖溶液（0.1m）配置成濃度為0.4mg/ml的texaphyrinnps溶液，經(jīng)過0.22μm的pvdf濾膜過濾進行無菌分裝，即得到所述的texaphyrinnps納米材料。產(chǎn)物用nanozs90動態(tài)光散射儀進行粒徑和電位的表征。圖1-b為texaphyrinnps脂質(zhì)體納米材料的自組裝示意圖和該探針的粒徑表征和電位表征，其粒徑為100nm，其點位為-29mv。

2.3^99mtc-texaphyrinnps的制備

將含有100μg的所述texaphyrinnps納米材料置于1.5ml的小管中，加入2.5mg的tppts和1.1gbq的na[^99mtco4]，置于60攝氏度的空氣浴加熱器中加熱20分鐘。制備的^99mtc-texaphyrinnps使用超濾的方法進行純化，超濾裝置為15ml的millipore(mwco=100k)的超濾管。樣品用生理鹽水稀釋至2ml后進行超濾除游離^99mtc，相對離心力為3000g，時間為15min。超濾純化共進行2次。對照樣品為使用同樣方法制備并標(biāo)記的普通脂質(zhì)體（65%氫化大豆軟磷脂，30%膽固醇和5%dspe-peg2000）。樣品通過itlc方法進行分析并用hplc方法進行驗證。圖2-a為^99mtc-texaphyrinnps和陰性對照標(biāo)記的普通脂質(zhì)體liposomes的放射性hplc結(jié)果圖和放射性itlc結(jié)果圖。在放射性hplc檢測中，^99mtc-texaphyrinnps的保留時間為7min，對照陰性標(biāo)記物的保留時間為15min。在放射性itlc檢測中，^99mtc-texaphyrinnps的相對遷移率（rf）為0，對照陰性標(biāo)記物的相對遷移率為0.8。圖2-b為陰性對照標(biāo)記的liposomes，^99mtc-texaphyrinnps及兩種原料（texaphyrinnps,tppts）的單獨標(biāo)記對照。結(jié)合對照實驗標(biāo)記結(jié)果表明，^99mtc-texaphyrinnps標(biāo)記效率較高，并且texaphyrinnps是在tppts作為^99mtc還原劑時才能有效標(biāo)記，說明該標(biāo)記結(jié)果不是通過對高锝酸分子^99mtco4^-的包裹造成的。

2.4^99mtc-texaphyrinnps在荷瘤鼠生物分布

將c57b/l6荷lewis小鼠肺癌皮下模型小鼠隨機分成若兩組，每組2只。各組實驗小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射100ml(740kbq)的^99mtc-texaphyrinnps，于注射后4小時和12小時分別處死實驗小鼠，取血及主要臟器，稱重并測量放射性計數(shù)，經(jīng)衰變校正后計算每克組織百分注射劑量率(%id/g)。在小鼠體內(nèi)，肝和脾id%/g最高，符合納米材料的肝脾攝取。在注射后12小時，血液的%id/g仍然保持較高的水平，符合peg2000修飾表面后的隱形脂質(zhì)體的血液長循環(huán)性。在所觀察的時間內(nèi)，腫瘤攝取明顯高于肌肉等正常組織。

2.5^99mtc-texaphyrinnps在荷瘤鼠中的spet/ct成像

將將c57b/l6荷lewis小鼠肺癌皮下模型小鼠隨經(jīng)尾靜脈注射100ml(~37mbq)^99mtc-texaphyrinnps，于注射后于注射后2,4,8和12小時在medisonanospect/ct顯像系統(tǒng)中進行spect/ct顯像。圖4顯示了^99mtc-texaphyrinnps在c57b/l6小鼠路易斯肺癌皮下模型中注射后2、4、8和12小時的3d-mip全身顯像圖。在注射后2小時的顯像圖中，我們可以看到小鼠心臟部位和頸部血管的血池，說明了藥物在體內(nèi)的長循環(huán)性。在小鼠全身3d顯像中，可以看到標(biāo)記物在腫瘤與肝、脾組織有明顯攝取。在全部顯像時間點中，均能清晰看到標(biāo)記物在腫瘤部位有明顯濃聚，能清晰分辨腫瘤位置。

綜上所述，基于新型卟啉納米texaphyrinnps的卟啉脂質(zhì)體放射性藥物^99mtc-texaphyrinnps有用于全身spet/ct檢測腫瘤的應(yīng)用潛力。