本發(fā)明屬于細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種治療早老癥或早衰癥的方法，特別是涉及一種用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，特別是涉及一種包括gd2+基質(zhì)細(xì)胞和kdr+造血干細(xì)胞的治療劑。進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及gd2+基質(zhì)細(xì)胞和kdr+造血干細(xì)胞二者組合在制備用于治療早老癥或早衰癥或者用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明治療劑可以有效地用于治療早老癥或早衰癥，特別是用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退。

背景技術(shù)：

衰老可以分為生理性衰老和病理性衰老，生理性衰老是機(jī)體發(fā)育成熟后，隨時(shí)間推移，發(fā)生漸進(jìn)性的生物體結(jié)構(gòu)和組織功能的退化，而病理性衰老是疾病或異常因素所導(dǎo)致的衰老加速，比如早衰癥等。

早衰癥(兒童早老癥)屬遺傳病，身體衰老的過(guò)程較正?？?至10倍，患者樣貌像老人，器官亦很快衰退，造成生理機(jī)能下降。病征包括身材瘦小、脫發(fā)和較晚長(zhǎng)牙?；疾和话阒荒芑畹?至20歲，大部分都會(huì)死于衰老疾病，如心血管病，現(xiàn)未有有效的治療方法，只靠藥物針對(duì)治療.

1999年《science》雜志評(píng)選出的10大科學(xué)進(jìn)展中，干細(xì)胞的研究工作格外令人矚目。一方面揭示了許多有關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的基礎(chǔ)理論難題；另一方面，干細(xì)胞可望將其用于創(chuàng)傷修復(fù)、神經(jīng)再生和抗衰老等臨床醫(yī)學(xué)研究。2007年英國(guó)科學(xué)家anastasia在自然雜志撰文指出成體干細(xì)胞對(duì)人體自我修復(fù)和組織再生至關(guān)重要，成體干細(xì)胞減少是人體衰老的主要原因。

作為成體干細(xì)胞之一的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，msc)來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)和自我復(fù)制等特點(diǎn)，日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。

間充質(zhì)干細(xì)胞能增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的表達(dá)，在抗衰老方面起重要作用。大量研究表明成年人干細(xì)胞類(lèi)型和功能特性的變化可能隨著年齡的增長(zhǎng)有病變發(fā)生。特別是氧化代謝應(yīng)激和慢性抑郁作用增加端粒的消耗及在dna修復(fù)方面的消耗，會(huì)引起dna的破壞和基因的不穩(wěn)定，導(dǎo)致在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生衰老和死亡。修復(fù)衰老可以用來(lái)預(yù)防與衰老相關(guān)的紊亂，包括造血免疫紊亂，心力衰竭及心血管病神經(jīng)功能降低癥、肌肉和腸道疾病、動(dòng)脈粥樣硬化及惡性腫瘤等疾病。

目前認(rèn)為衰老是細(xì)胞活性的降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞、組織和器官的衰老，因此衰老即是細(xì)胞的衰老。在機(jī)體中衰老和再生同時(shí)在生物體內(nèi)存在，衰老的進(jìn)程大于再生的能力即會(huì)衰老。如果細(xì)胞能永生化，那組織衰老的進(jìn)程將被延緩甚至阻斷。干細(xì)胞目前已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得以印證具有抗衰老的作用，并且部分干細(xì)胞已經(jīng)應(yīng)用于臨床抗衰老中，這些干細(xì)胞具有提高組織功能，改善組織形態(tài)等方面已經(jīng)取得確切療效，考慮到干細(xì)胞有抗原識(shí)別作用，干細(xì)胞提升機(jī)體抗自由基能力，從整體上調(diào)控機(jī)體的功能狀態(tài)，是一種全身性、系統(tǒng)性、根本性的延年益壽。間充質(zhì)干細(xì)胞不僅安全、可靠，而且無(wú)免疫排斥，也無(wú)不良反應(yīng)。可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)，尤其對(duì)治療衰老和組織器官損傷修復(fù)有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

早在2009年韓忠朝教授的研究小組發(fā)現(xiàn)gd2+間充質(zhì)干細(xì)胞較未分選的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，gd2+間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力明顯增強(qiáng)，另外，在gd2+間充質(zhì)干細(xì)胞中胚胎干細(xì)胞標(biāo)志ssea-4、oct-4、sox-2、nanog的表達(dá)也明顯提高。

造血干細(xì)胞(通?？s寫(xiě)為hsc)，是指具有自我更新和多向分化能力的一類(lèi)細(xì)胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即經(jīng)過(guò)一個(gè)細(xì)胞周期活動(dòng)之后，可以產(chǎn)生兩個(gè)與分裂前性質(zhì)相同的造血干細(xì)胞，同時(shí)又具有多向分化能力，即在一定的環(huán)境條件下，造血干細(xì)胞具有向各系血細(xì)胞分化的能力。

一般來(lái)說(shuō)，造血干細(xì)胞存在于三個(gè)部位，分別是骨髓、外周血和臍帶血，根據(jù)其來(lái)源分別稱之為骨髓造血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì)胞和臍帶血造血干細(xì)胞。隨著醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)足月胎盤(pán)存在大量的造血干細(xì)胞，胎盤(pán)血內(nèi)含有豐富的各種階段早期造血干細(xì)胞，其含量大約是臍帶血的十幾倍，一個(gè)胎盤(pán)中的造血干細(xì)胞可完全滿足于兩個(gè)成年人的需求，若能和臍帶血細(xì)胞一起應(yīng)用于病人，無(wú)疑大大增加了造血干細(xì)胞的含量，這使造血干細(xì)胞可完全應(yīng)用于所有的適用人群。而且這些胎盤(pán)造血干細(xì)胞在冷凍儲(chǔ)存前后都可以分離出來(lái)。胎盤(pán)造血干細(xì)胞菌落形成單位(cfu)的活性是確定的，在免疫缺陷鼠中的移植實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明胎盤(pán)造血干細(xì)胞在移植中的潛力。另外,移植胎盤(pán)造血干細(xì)胞的配型要求不需要很?chē)?yán)格，且移植后反應(yīng)較輕且不需要采用藥物。此外，作為胎盤(pán)造血干細(xì)胞來(lái)源-胎盤(pán)，來(lái)源廣泛，孕婦生產(chǎn)后往往成為廢棄物，其采集不會(huì)引起母親和新生兒任何不適的感覺(jué)或產(chǎn)生任何不良的影響。諸多優(yōu)點(diǎn)使胎盤(pán)造血干細(xì)胞有望取代骨髓造血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì)胞和臍帶血造血干細(xì)胞用于造血干細(xì)胞移植中。這些結(jié)果有力地表明，人類(lèi)足月胎盤(pán)有可能成為一種新型的用于移植的造血干細(xì)胞的來(lái)源。

早在2014年哈佛大學(xué)干細(xì)胞研究所amywagers研究小組，發(fā)現(xiàn)年輕的小數(shù)血液可以使年老的小鼠返老還童，這項(xiàng)令世人矚目的研究成果被《科學(xué)》雜志評(píng)為十大科學(xué)突破之一。2017年《自然》雜志發(fā)表的最新研究表明年輕人的血液中存在一種可以抗衰老的蛋白質(zhì)，可以逆轉(zhuǎn)衰老癥狀，包括記憶力減退、肌肉功能減弱、新城代謝的減少以及骨骼結(jié)構(gòu)的喪失。這些研究表明造血干細(xì)胞具有抗衰老的功能。

人骨髓、臍血、正?；騽?dòng)員的外周血來(lái)源的cd34+細(xì)胞中的0.1％～0.5％表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascularendothelialgrowthfacrorreceptor2，vegfr2)，這種受體亦被稱為kdr或flk-1。在1999年zieglar研究小組發(fā)現(xiàn)，在在造血干細(xì)胞移植中，只有kdr+造血干細(xì)胞可以成功植入，而cd34+kdr-細(xì)胞無(wú)法植入。限制性稀釋實(shí)驗(yàn)表明：能長(zhǎng)期持續(xù)植入的細(xì)胞均為kdr+，骨髓中的cd34+kdr+細(xì)胞有20％為hsc。hsc存在于cd34+kdr+亞群，而造血祖細(xì)胞存在于cd34+kdr-亞群，因而應(yīng)用kdr可將造血干/祖細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

機(jī)體機(jī)能老化和臟器功能衰退較為特殊且典型的表現(xiàn)為早老癥(人們通常亦稱為早衰癥)。修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化以及延緩臟器功能衰退是治療早老癥的必要手段。令人遺憾的是，迄今為止臨床上尚無(wú)有效的治療早老癥的方法。

因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切期待有一種有效的方法來(lái)治療早老癥或早衰癥，從而實(shí)現(xiàn)修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化以及延緩臟器功能衰退的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種有效的方法來(lái)延緩和治療早老癥或早衰癥，從而實(shí)現(xiàn)修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化以及延緩臟器功能衰退的目的。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞可以有效地修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化以及延緩臟器功能衰退，從而達(dá)到治療早老癥或早衰癥的目的。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。

為此，本發(fā)明一方面提供了間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞組合在制備用于治療早老癥或早衰癥或者用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是gd2+基質(zhì)細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤(pán)和/或臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤(pán)和/或臍帶的gd2+基質(zhì)細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤(pán)和/或臍帶的gd2+基質(zhì)細(xì)胞，且gd2陽(yáng)性表達(dá)率大于90％，例如大于95％。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液中，添加有維生素c和表皮生長(zhǎng)因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液中添加有維生素c和表皮生長(zhǎng)因子，每10⁶個(gè)細(xì)胞添加的0.1μmol維生素c和2500iu表皮生長(zhǎng)因子。已經(jīng)出人意料的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在注射的間充質(zhì)干細(xì)胞中添加適量的維生素c和表皮生長(zhǎng)因子，在明顯降低間充質(zhì)干細(xì)胞的情況下可以得到與高間充質(zhì)干細(xì)胞用量基本相同的生物學(xué)效果，這一意義是非同尋常的，原因在于間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源稀缺。上述維生素c和表皮生長(zhǎng)因子可以預(yù)先就添加到間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液中，亦可以在間充質(zhì)干細(xì)胞注射到生物體內(nèi)之前添加到細(xì)胞懸液中。表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor，egf)，亦稱表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，又名寡肽-1，是人體內(nèi)的一種活性小肽物質(zhì)，由53個(gè)氨基酸殘基組成的活性多肽，借由刺激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體之酪氨酸磷酸化，達(dá)到修補(bǔ)增生肌膚表層細(xì)胞，據(jù)說(shuō)對(duì)受傷、受損之表皮肌膚擁有絕佳之療效。其最大特點(diǎn)是能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，從而以新生的細(xì)胞代替衰老和死亡的細(xì)胞。egf還能止血，并具有加速皮膚和粘膜創(chuàng)傷愈合，消炎鎮(zhèn)痛，防止?jié)兊墓πАgf的穩(wěn)定性能極好，在常溫下不易失散流動(dòng)，能與人體內(nèi)各種酶形成良好的協(xié)調(diào)效應(yīng)。最初的egf主要被運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，主要用于促進(jìn)受損表皮的修復(fù)與再生，如治療燒傷、燙傷等。表皮生長(zhǎng)因子egf可直接從市售途徑購(gòu)得，例如經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)生產(chǎn)銷(xiāo)售的表皮生長(zhǎng)因子。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細(xì)胞來(lái)源于：臍帶血、骨髓、胎盤(pán)血、和/或動(dòng)員外周血。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細(xì)胞是kdr陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細(xì)胞是kdr陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞，該kdr陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞中kdr陽(yáng)性表達(dá)率大于85％，例如大于90％。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細(xì)胞中cd34陽(yáng)性表達(dá)率大于80％，例如大于85％。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨(dú)密封包裝的間充質(zhì)干細(xì)胞和單獨(dú)密封包裝的造血干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物，例如人時(shí)所述間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量每次用量是每公斤患者體重用量為(0.1～20)×10⁵個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.1～10)×10⁵個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.2～1.0)×10⁵個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為0.5×10⁵個(gè)基質(zhì)細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物，例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量每次是每公斤患者體重用量為(1～5)×10⁷個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2～4)×10⁷個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為3×10⁷個(gè)單個(gè)核細(xì)胞?；蛘?，在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物，例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量每次是每公斤患者體重用量為(2～10)×10⁵個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2～5)×10⁵個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤體重用量為(2～4)×10⁵個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)，先使用間充質(zhì)干細(xì)胞，在1個(gè)月之后使用造血干細(xì)胞。

進(jìn)一步的，本發(fā)明第二方面提供了一種用于治療早老癥或早衰癥或者用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，其呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨(dú)密封包裝的間充質(zhì)干細(xì)胞和單獨(dú)密封包裝的造血干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是gd2+基質(zhì)細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤(pán)和/或臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤(pán)和/或臍帶的gd2+基質(zhì)細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤(pán)和/或臍帶的gd2+基質(zhì)細(xì)胞，且gd2陽(yáng)性表達(dá)率大于90％，例如大于95％。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液中，添加有維生素c和表皮生長(zhǎng)因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液中添加有維生素c和表皮生長(zhǎng)因子，每10⁶個(gè)細(xì)胞添加的0.1μmol維生素c和2500iu表皮生長(zhǎng)因子。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細(xì)胞來(lái)源于：臍帶血、骨髓、胎盤(pán)血、和/或動(dòng)員外周血。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細(xì)胞是kdr陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細(xì)胞是kdr陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞，該kdr陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞中kdr陽(yáng)性表達(dá)率大于85％，例如大于90％。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細(xì)胞中cd34陽(yáng)性表達(dá)率大于80％，例如大于85％。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物，例如人時(shí)所述間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量每次用量是每公斤患者體重用量為(0.1～20)×10⁵個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.1～10)×10⁵個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.2～1.0)×10⁵個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為0.5×10⁵個(gè)基質(zhì)細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量每次是每公斤患者體重用量為(1～5)×10⁷個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2～4)×10⁷個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為3×10⁷個(gè)單個(gè)核細(xì)胞?；蛘?，在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量每次是每公斤患者體重用量為(2～10)×10⁵個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2～5)×10⁵個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2～4)×10⁵個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)，先使用間充質(zhì)干細(xì)胞，在1個(gè)月之后使用造血干細(xì)胞。

本發(fā)明所用的間充質(zhì)干細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備。

例如，對(duì)于通過(guò)胎盤(pán)獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210292509.9中的方法獲得，例如通過(guò)該文獻(xiàn)方法獲得的gd2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90％的gd2+基質(zhì)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，獲得該gd2+基質(zhì)細(xì)胞的方法包括以下步驟：

(1)胎盤(pán)組織清洗：胎盤(pán)組織是在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行處理，根據(jù)胎盤(pán)大小使用適量pbs緩沖液對(duì)胎盤(pán)組織進(jìn)行沖洗2-3遍，使胎盤(pán)組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤(pán)表面無(wú)血液凝塊；

(2)胎盤(pán)組織消化處理：使用手術(shù)剪從步驟(1)得到的胎盤(pán)組織上剪下胎盤(pán)小葉，把小葉轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿上，加入25mlpbs緩沖液并把胎盤(pán)小葉盡量剪碎，加入25ml0.25％胰酶(gibco)(胰酶跟pbs緩沖液體積比例為1:1)并混勻組織，把培養(yǎng)皿放進(jìn)37℃的恒溫?fù)u床里消化20分鐘；

(3)胎盤(pán)組織過(guò)濾處理：往培養(yǎng)皿里加入5mlfbs(gibco)并混勻以達(dá)到終止消化的目的，把消化過(guò)后的胎盤(pán)組織碎片轉(zhuǎn)移到200目金屬過(guò)濾器上，對(duì)胎盤(pán)組織碎片進(jìn)行研磨并利用另一培養(yǎng)皿收集過(guò)濾完的液體，分開(kāi)兩次往金屬過(guò)濾器加入10ml的pbs緩沖液清洗組織并繼續(xù)研磨，將收集的濾液轉(zhuǎn)移至50ml離心管，以速度1400rpm離心10分鐘，去除上清液并加入pbs緩沖液重懸細(xì)胞，以速度1400rpm離心10分鐘，去除上清液，加入pbs緩沖液重懸細(xì)胞，抽取小量樣本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以速度1400rpm離心10分鐘以達(dá)到清洗細(xì)胞的效果；

(4)配制胎盤(pán)全細(xì)胞凍存液：所述胎盤(pán)全細(xì)胞凍存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的dmso(二甲基亞砜)和65重量份的dmem-f12，配好的凍存液放在4℃冰箱保存直至使用；

(5)胎盤(pán)全細(xì)胞凍存：將步驟(3)得到的胎盤(pán)組織過(guò)濾液離心后去除上清液，在4℃的低溫環(huán)境下，加入步驟(4)得到的全細(xì)胞凍存液，然后以每一管每毫升4×10⁷到1×10⁸的細(xì)胞密度加入凍存管里，此過(guò)程需在4℃的低溫條件下進(jìn)行，將凍存管放入程序降溫盒里，先在4℃的溫度條件下低溫冷藏0.5小時(shí)，再-80℃的溫度條件下冷凍1天，然后將凍存管于液氮中冷凍，備用；

必要時(shí)，可以進(jìn)一步地包括與凍存方法配套使用的復(fù)蘇方法：

(6)凍存胎盤(pán)全細(xì)胞復(fù)蘇:將步驟(4)冷凍的胎盤(pán)全細(xì)胞從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開(kāi)始融化，利用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(其例如包含15％fbs+1％l-glutamine+0.05％gentamicin+84％dmem-f12)進(jìn)行點(diǎn)滴法清洗胎盤(pán)全細(xì)胞，解凍獲得的細(xì)胞懸液與間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的體積比為1∶3(1ml:3ml)，將混合有間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，以速度1400rpm離心10分鐘清洗dmso，去除上清液，加入pbs緩沖液重懸細(xì)胞，并以1份細(xì)胞懸液比2-3份紅細(xì)胞裂解液的比例加入紅細(xì)胞裂解液(roche)，在15-25℃的環(huán)境下培養(yǎng)10-15分鐘，放進(jìn)離心機(jī)以速度1400rpm離心10分鐘進(jìn)行離心，離心后去除上清液，觀察紅細(xì)胞裂解情況，如有需要再重復(fù)紅細(xì)胞裂解的步驟進(jìn)行裂解，最后加入pbs緩沖液重懸細(xì)胞并抽取小量樣本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，放進(jìn)離心機(jī)以速度1400rpm離心10分鐘進(jìn)行離心以清洗細(xì)胞，去除上清液；

必要時(shí)，可以進(jìn)一步地包括復(fù)蘇后間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴(kuò)增的方法：

(7)細(xì)胞培養(yǎng)：向步驟(6)得到的全細(xì)胞中補(bǔ)加適量的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到t25培養(yǎng)瓶，再將t25培養(yǎng)瓶放進(jìn)co2濃度為5％的37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6天時(shí)將t25培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，進(jìn)行第一次半換液，繼續(xù)培養(yǎng)，在第9天時(shí)將t25培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，進(jìn)行第二次半換液，在第12天把平皿里面的培養(yǎng)基抽走，加入15ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，往后每2天進(jìn)行一次全換液；

(8)細(xì)胞傳代：當(dāng)t25培養(yǎng)瓶里面的貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到80％左右，可利用消化酶(trypleexpress)將貼壁細(xì)胞脫離t25培養(yǎng)瓶底部，離心后移除上清液，并加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代，并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；此后每?jī)商鞊Q液一次直至融合率達(dá)到80％后，即得(可在其中補(bǔ)充維生素c和表皮生長(zhǎng)因子，以用于生物體注射治療；或者在其經(jīng)傳代、凍存等處理后，在用于生物體注射治療之前向其中補(bǔ)充維生素c和表皮生長(zhǎng)因子)，必要時(shí)再進(jìn)行傳代。

必要時(shí)，可以進(jìn)一步地針對(duì)以上步驟(8)所得胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)：細(xì)胞活性、細(xì)胞污染、遺傳病、hla-abc/dr配型；

必要時(shí)，可以進(jìn)一步地將以上步驟(8)所得傳代后的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存，備用。

在上述獲得的gd2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90％的gd2+基質(zhì)細(xì)胞的這種胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)程中，對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行g(shù)d2陽(yáng)性表達(dá)率檢測(cè)，選取gd2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90％例如不低于95％的gd2+基質(zhì)細(xì)胞作為本發(fā)明使用的間充質(zhì)干細(xì)胞。

又例如，對(duì)于通過(guò)臍帶獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210159916.2中的方法獲得，例如通過(guò)該文獻(xiàn)方法獲得的gd2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90％的gd2+基質(zhì)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，獲得該gd2+基質(zhì)細(xì)胞的方法包括以下步驟：

(1)配制臍帶組織凍存液：所述臍帶組織凍存液中包含80重量份的人血白蛋白和10重量份的dmso(二甲基亞砜，dimethylsulfoxide)，配好的冷存液放在4℃冰箱保存直至使用；

(2)消毒和清洗：在生物安全柜中，用酒精對(duì)臍帶組織表面進(jìn)行消毒，將臍帶從中間剪開(kāi)，平鋪在無(wú)菌10cm細(xì)胞培養(yǎng)平皿上，利用pbs清洗組織，以減小組織上面的紅細(xì)胞；

(3)臍帶組織處理：將步驟(2)得到的臍帶組織轉(zhuǎn)移至另一個(gè)10cm細(xì)胞培養(yǎng)平皿中，將臍帶組織剪成大小1cm3的正方形狀；

(4)臍帶組織冷存：在4℃的低溫環(huán)境下，將組織塊和凍存液加入凍存管中，然后將凍存管放入程序降溫盒，先在4℃的溫度條件下低溫冷藏0.5小時(shí)，再-80℃的溫度條件下冷凍1天，然后將凍存管于液氮中冷凍，備用；

必要時(shí)，可以進(jìn)一步地包括與凍存方法配套使用的復(fù)蘇方法：

(5)凍存臍帶組織復(fù)蘇：將步驟(4)冷凍的臍帶組織從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開(kāi)始融化，利用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(其例如包含15％fbs+1％l-glutamine+0.05％gentamicin+84％dmem-f12)進(jìn)行點(diǎn)滴法清洗臍帶組織，利用100um過(guò)濾器將廢液去掉；

必要時(shí)，可以進(jìn)一步地包括復(fù)蘇后間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴(kuò)增的方法：

(6)臍帶組織貼壁處理：將復(fù)蘇的凍存臍帶組織平鋪于另一個(gè)10cm細(xì)胞培養(yǎng)平皿中，每個(gè)平皿中的組織塊數(shù)量維持在10-15塊，使組織塊風(fēng)干10-15分鐘直至組織貼在平皿上；

(7)臍帶組織培養(yǎng)：沿平皿邊緣慢慢加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(其例如包含15％fbs+1％l-glutamine+0.05％gentamicin+84％dmem-f12)至組織淹沒(méi)即可；將平皿置于co2濃度為5％的37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第五天時(shí)將平皿從培養(yǎng)箱取出，補(bǔ)加5ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基；在第十天將平皿內(nèi)的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移，加入15ml新鮮的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基；在第十二天清除所有臍帶組織塊并繼續(xù)培養(yǎng)，此后每?jī)商爝M(jìn)行一次全換液；

(8)細(xì)胞傳代：當(dāng)平皿里面的貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到60％左右，可利用消化酶(trypleexpress)將貼壁細(xì)胞脫離平皿底部，離心后移除上清液，并加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代，并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；此后每?jī)商鞊Q液一次直至融合率達(dá)到80％后，即得(可在其中補(bǔ)充維生素c和表皮生長(zhǎng)因子，以用于生物體注射治療；或者在其經(jīng)傳代、凍存等處理后，在用于生物體注射治療之前向其中補(bǔ)充維生素c和表皮生長(zhǎng)因子)，必要時(shí)再進(jìn)行傳代；

必要時(shí)，可以進(jìn)一步地針對(duì)以上步驟(8)所得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)：細(xì)胞活性、細(xì)胞污染、遺傳病、hla-abc/dr配型；

必要時(shí)，可以進(jìn)一步地將以上步驟(8)所得傳代后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存，備用。

在上述獲得的gd2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90％的gd2+基質(zhì)細(xì)胞的這種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)程中，對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行g(shù)d2陽(yáng)性表達(dá)率檢測(cè)，選取gd2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90％例如不低于95％的gd2+基質(zhì)細(xì)胞作為本發(fā)明使用的間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明所用的造血干細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備。

例如，對(duì)于通過(guò)胎盤(pán)獲得的造血干細(xì)胞，可以參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?014104050724中的方法獲得，例如通過(guò)該文獻(xiàn)方法獲得的造血干細(xì)胞中cd34陽(yáng)性表達(dá)率大于80％，例如大于85％；并且，通過(guò)該文獻(xiàn)方法獲得的造血干細(xì)胞中kdr陽(yáng)性表達(dá)率大于85％，例如大于90％。在一個(gè)實(shí)例中，獲得該kdr陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞的方法包括以下步驟：胎盤(pán)的收集、胎盤(pán)的初檢、胎盤(pán)的預(yù)消毒、胎盤(pán)及母血檢測(cè)、胎盤(pán)造血干細(xì)胞的灌洗、造血干細(xì)胞的濃縮純化。各步驟具體為：

(1)胎盤(pán)的收集：在手術(shù)室無(wú)菌環(huán)境下收集胎盤(pán)及母血，存放于無(wú)菌的胎盤(pán)儲(chǔ)運(yùn)盒中，貼好標(biāo)簽、條碼，胎盤(pán)儲(chǔ)運(yùn)盒的溫度保持在4-10℃，24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；

(2)胎盤(pán)的初檢：檢查胎盤(pán)儲(chǔ)運(yùn)盒盒內(nèi)溫度、標(biāo)簽、送達(dá)日期、儲(chǔ)運(yùn)盒是否有滲漏、是否有母血血樣；

(3)胎盤(pán)的預(yù)消毒：將胎盤(pán)的胎兒面展開(kāi)放置于胎盤(pán)沖洗盒的底部，用生理鹽水沖洗胎盤(pán)表面，打開(kāi)胎盤(pán)沖洗盒底面的排水孔，去掉沖洗的生理鹽水，檢查胎盤(pán)表面鈣化情況；

(4)胎盤(pán)及母血檢測(cè)：對(duì)所取的胎盤(pán)和母血樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的項(xiàng)目包括肝炎病毒檢測(cè)、艾滋病毒檢測(cè)、性病檢測(cè)、組織配型(hla)檢測(cè)、造血干/祖細(xì)胞定性檢測(cè)(cfu-gm)；

(5)胎盤(pán)造血干細(xì)胞的灌洗：將胎盤(pán)在無(wú)菌條件下用無(wú)菌生理鹽水清洗掉胎盤(pán)上的血凝塊及積血，采用消毒劑消毒后，將灌洗液針頭插入胎盤(pán)臍動(dòng)脈中，胎盤(pán)灌注回收瓶針頭插入臍靜脈中，止血鉗夾緊，緩慢開(kāi)啟恒流泵，灌洗液經(jīng)膠管、開(kāi)關(guān)、蠕動(dòng)泵、針頭、胎盤(pán)動(dòng)脈、胎盤(pán)、胎盤(pán)靜脈、胎盤(pán)灌注回收瓶針頭，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；

(6)造血干細(xì)胞的濃縮純化：將灌洗出來(lái)的灌洗液，在離心機(jī)中以1500-2000rpm離心15-20分鐘，去掉上清液，收集沉淀和下層的液體，將收集到的沉淀和下層的液體與生理鹽水按2：1-1：2的比例混勻得混合液，然后將混合液和淋巴細(xì)胞分離液按2：1-1：2的比例分別加入到離心管中，添加的順序?yàn)橄仍陔x心管中加入淋巴細(xì)胞分離液，再緩慢加入混合液，加入過(guò)程中注意保持淋巴細(xì)胞分離液的液面平整，加完后以2200-2500rpm離心20-25分鐘，離心時(shí)慢加速慢減速，離心結(jié)束后，收集中間白膜層到新的離心管中，以2：1-1：2的比例加生理鹽水混勻，1200-1500rpm離心10-15分鐘；離心結(jié)束后去掉上清液，加入10-20ml生理鹽水吹打沉淀，再1200-1500rpm離心10-15分鐘，離心結(jié)束后，去掉上清液，用dmem培養(yǎng)基重懸沉淀，收集造血干細(xì)胞群，將重懸的細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)胞和霉菌培養(yǎng)，造血干細(xì)胞定量檢測(cè)(cd34)，造血干細(xì)胞活性檢測(cè)(臺(tái)盼藍(lán)染色)，造血干細(xì)胞定性檢測(cè)(cfu-gm)。

在上述獲得的cd34陽(yáng)性表達(dá)率大于80％例如大于85％，且kdr陽(yáng)性表達(dá)率大于85％例如大于90％的造血干細(xì)胞過(guò)程中，對(duì)所獲得的造血干細(xì)胞進(jìn)行cd34陽(yáng)性表達(dá)率檢測(cè)和kdr陽(yáng)性表達(dá)率，選取cd34陽(yáng)性表達(dá)率大于80％例如大于85％且kdr陽(yáng)性表達(dá)率大于85％例如大于90％的造血干細(xì)胞過(guò)作為本發(fā)明使用的造血干細(xì)胞。

或者，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的造血干細(xì)胞可照如下方法獲得：取造血干細(xì)胞來(lái)源組織(包括但不限于臍帶血、骨髓、胎盤(pán)血、動(dòng)員外周血)，按8：1～1：8比例加入羥乙基淀粉，混合均勻后，轉(zhuǎn)移到axp造血干細(xì)胞分離系統(tǒng)配套處理耗材內(nèi)，裝入axp造血干細(xì)胞分離系統(tǒng)，放入離心機(jī)，以離心率(rcf)1200～1600離心10～30min，再以rcf50～200離心5～15min后取出，自動(dòng)分離得到單個(gè)核細(xì)胞，導(dǎo)出axp數(shù)據(jù)得到造血干細(xì)胞的分離數(shù)量。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離的到的細(xì)胞的cd34和kdr含量。然后將分離得到的細(xì)胞按8：1～1：8比例加入dmso，程序降溫至-90℃后放入液氮環(huán)境下凍存。使用前，放在37度水浴中復(fù)蘇。使用上述方法獲得的cd34陽(yáng)性表達(dá)率大于80％例如大于85％，且kdr陽(yáng)性表達(dá)率大于85％例如大于90％的造血干細(xì)胞。

進(jìn)一步的，在凍存前，可以將本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞和kdr+造血干細(xì)胞各自獨(dú)立地分裝于瓶子中，接著將兩個(gè)瓶子置于本發(fā)明所述藥盒中，得到本發(fā)明用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，接著將該治療劑在凍存條件下保存。

根據(jù)本發(fā)明記載的在動(dòng)物試驗(yàn)中獲得的結(jié)果，本發(fā)明人嘗試將本發(fā)明方法用于人特別是具有早老癥特征的患者以修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退。結(jié)果顯示，本發(fā)明方法不但在動(dòng)物試驗(yàn)中呈現(xiàn)優(yōu)良的結(jié)果，而且在人體中呈現(xiàn)令人鼓舞結(jié)果。盡管cn106074604a亦公開(kāi)了一種治療早衰癥或早老癥的方法，然而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法比之于該cn106074604a所記載的方法更具臨床價(jià)值。

本發(fā)明任一方面或該任一方面的任一實(shí)施方案所具有的任一技術(shù)特征同樣適用其它任一實(shí)施方案或其它任一方面的任一實(shí)施方案，只要它們不會(huì)相互矛盾，當(dāng)然在相互之間適用時(shí)，必要的話可對(duì)相應(yīng)特征作適當(dāng)修飾。下面對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。

本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文，并且如果這些文獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時(shí)，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對(duì)這些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)作更詳盡的說(shuō)明和解釋，提及的術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

通過(guò)下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。

在本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)中，使用到的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞是參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210292509.9之實(shí)施例1、6、7的方法獲得的，并且gd2陽(yáng)性表達(dá)率大于95％。

在本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)中，使用到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞是參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210159916.2之實(shí)施例1、6、7的方法獲得的，并且gd2陽(yáng)性表達(dá)率大于95％。

在本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)中，使用到的胎盤(pán)造血干細(xì)胞是參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?014104050724之實(shí)施例1的方法獲得的，并且cd34標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率大于85％、kdr標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率大于90％。

在本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)中，使用到的臍帶血造血干細(xì)胞其cd34標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率大于85％、kdr/2標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率大于90％，并且是參照如下方法制備的：按8：1～1：8比例加入羥乙基淀粉，混合均勻后，轉(zhuǎn)移到axp造血干細(xì)胞分離系統(tǒng)配套處理耗材內(nèi)，裝入axp造血干細(xì)胞分離系統(tǒng)，放入離心機(jī)，以離心率(rcf)1200～1600離心10～30min，再以rcf50～200離心5～15min后取出，自動(dòng)分離得到單個(gè)核細(xì)胞，導(dǎo)出axp數(shù)據(jù)得到造血干細(xì)胞的分離數(shù)量。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離的到的細(xì)胞的cd34和kdr含量。然后將分離得到的細(xì)胞按8：1～1：8比例加入dmso，程序降溫至-90℃后放入液氮環(huán)境下凍存。使用前，放在37度水浴中復(fù)蘇。在造血干細(xì)胞中添加了維生素c和表皮生長(zhǎng)因子的試驗(yàn)中，各造血干細(xì)胞在注射前添加維生素c和表皮生長(zhǎng)因子，以每10⁶個(gè)細(xì)胞計(jì)添加0.1μmol維生素c和2500iu表皮生長(zhǎng)因子。

實(shí)施例1：使用胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞與臍帶血kdr+造血干細(xì)胞治療衰老小鼠

一、動(dòng)物的選擇和分組

1、動(dòng)物的選擇：模型小鼠為健康c57bl/6j小鼠，雌性，8周齡，重18～22g，60只。

2、動(dòng)物分組：?jiǎn)渭冸S機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組三組，每組20只。

二、建立小鼠衰老模型

模型組和治療組每日頸背部皮下注射5％的d-半乳糖，注射量為0.25ml/10g，連續(xù)給藥8-16周建立衰老動(dòng)物模型。對(duì)照組則給予相同體積的生理鹽水。

三、輸注

衰老模型建成兩周之后，治療組注射gd2+胎盤(pán)msc和kdr+臍帶血hsc。采用表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體標(biāo)記gd2+msc及臍帶血kdr+hsc，以確定gd2+msc及臍帶血kdr+hsc在小鼠各臟器的植入情況。檢測(cè)治療前后衰老相關(guān)指標(biāo)：包括小鼠體重、胸腺、脾臟、血清、肝組織、肺臟、腦組織過(guò)氧化氫酶(cat)、超氧化物歧化酶(sod)活力和丙二醛(mda)含量的變化。

治療組第一個(gè)療程：經(jīng)小鼠尾靜脈輸注人源gd2+胎盤(pán)msc單細(xì)胞懸液2×10⁶/0.2ml/只，每周給藥一次，共給藥4次為一個(gè)療程。第二個(gè)療程：第一周經(jīng)小鼠尾靜脈輸注人源gd2+胎盤(pán)msc單細(xì)胞懸液2×10⁶/0.2ml/只，第二周輸注人源kdr+臍帶血hsc單細(xì)胞懸液2×10⁶/0.2ml/只，以后每療程均輸注gd2+胎盤(pán)msc；對(duì)照組和衰老模型組給予同等劑量的細(xì)胞培養(yǎng)液。

四、方法

l、用尾靜脈注射架固定小鼠。

2、用酒精棉球擦尾巴使血管擴(kuò)張；注射狀態(tài)為尾巴發(fā)白，緊靠白色的尾骨兩側(cè)清晰可見(jiàn)兩根紅色靜脈。

3、用左手的食指，中指，無(wú)名指及大拇指將小鼠尾巴固定。握住1ml注射器前面0.1cm處。右手小指搭在拽著鼠尾的左手拇指處，按此手形進(jìn)針。

4、注射：注射時(shí)左手扯尾，使尾巴緊貼桌面，尾巴與桌邊緊貼轉(zhuǎn)彎處為進(jìn)針部位，一般選擇距離尾尖1/4或l/3處進(jìn)針。針頭入皮膚后馬上把針頭略往上，平行進(jìn)針，針扎入時(shí)有落空感，緩慢推注。

五、結(jié)果：

1.治療組在受體小鼠中定植，治療組小鼠胸腺、脾臟、血清、肝組織、肺臟、腦組織mda及cat含量明顯低于對(duì)照組、sod活力明顯高于對(duì)照組并且存在顯著性差異(p≤0.05)，與模型組相比，則存在極顯著性差異(p≤0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.各組小鼠的組織病理切片顯示，模型組小鼠的各臟器結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，而細(xì)胞治療組小鼠的各臟器損傷有明顯修復(fù)。結(jié)果可見(jiàn)msc對(duì)衰老小鼠的臟器損傷有修復(fù)作用，從而發(fā)揮其抗衰老作用。

六、結(jié)論：gd2+msc與kdr+hsc聯(lián)合治療明顯改善d-半乳糖誘導(dǎo)亞急性衰老模型小鼠的衰老相關(guān)指標(biāo)，表明gd2+msc和kdr+hsc二者組合使用具有顯著的修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和臟器功能衰退的作用。

補(bǔ)充試驗(yàn)1a：參照以上實(shí)施例1，但是在治療時(shí)僅使用gd2+msc以及僅使用kdr+hsc治療，卻發(fā)現(xiàn)均未呈現(xiàn)任何治療作用。

本發(fā)明人在充分的生物學(xué)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用本發(fā)明方法嘗試治療患者早老癥的患者，結(jié)果顯示本發(fā)明方法具有對(duì)早老癥優(yōu)異的治療作用，這種治療作用還體現(xiàn)在其能夠修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退。

補(bǔ)充試驗(yàn)1b：參考實(shí)施例1的方法，使用胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞與kdr+胎盤(pán)造血干細(xì)胞治療衰老小鼠，結(jié)果顯示與實(shí)施例1呈現(xiàn)基本相同的治療效果。

補(bǔ)充試驗(yàn)1c：參考實(shí)施例1的方法，使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞與kdr+胎盤(pán)造血干細(xì)胞治療衰老小鼠，結(jié)果顯示與實(shí)施例1呈現(xiàn)基本相同的治療效果。

補(bǔ)充試驗(yàn)1d：參考實(shí)施例1的方法，使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞與kdr+臍帶血造血干細(xì)胞治療衰老小鼠，結(jié)果顯示與實(shí)施例1呈現(xiàn)基本相同的治療效果。

實(shí)施例2：使用胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞與臍帶血kdr+造血干細(xì)胞治療衰老小鼠

本實(shí)施例2及其補(bǔ)充試驗(yàn)中，如未另外說(shuō)明，所用的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液中添加了維生素c和表皮生長(zhǎng)因子。

一、動(dòng)物的選擇和分組

1、動(dòng)物的選擇：模型小鼠為健康c57bl/6j小鼠，雌性，8周齡，重18～22g，60只。

2、動(dòng)物分組：?jiǎn)渭冸S機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組三組，每組20只。

二、建立小鼠衰老模型

模型組和治療組每日頸背部皮下注射5％的d-半乳糖，注射量為0.25ml/10g，連續(xù)給藥8-16周建立衰老動(dòng)物模型。對(duì)照組則給予相同體積的生理鹽水。

三、輸注

衰老模型建成兩周之后，治療組注射gd2+胎盤(pán)msc和kdr+臍帶血hsc。采用表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體標(biāo)記gd2+msc及臍帶血kdr+hsc，以確定gd2+msc及臍帶血kdr+hsc在小鼠各臟器的植入情況。檢測(cè)治療前后衰老相關(guān)指標(biāo)：包括小鼠體重、胸腺、脾臟、血清、肝組織、肺臟、腦組織過(guò)氧化氫酶(cat)、超氧化物歧化酶(sod)活力和丙二醛(mda)含量的變化。

治療組第一個(gè)療程：經(jīng)小鼠尾靜脈輸注人源gd2+胎盤(pán)msc單細(xì)胞懸液1×10⁴/0.2ml/只，每周給藥一次，共給藥4次為一個(gè)療程。第二個(gè)療程：第一周經(jīng)小鼠尾靜脈輸注人源gd2+胎盤(pán)msc單細(xì)胞懸液1×10⁴/0.2ml/只，第二周輸注人源kdr+臍帶血hsc單細(xì)胞懸液2×10⁶/0.2ml/只，以后每療程均輸注gd2+胎盤(pán)msc；對(duì)照組和衰老模型組給予同等劑量的細(xì)胞培養(yǎng)液。上述經(jīng)小鼠尾靜脈輸注人源gd2+胎盤(pán)msc單細(xì)胞懸液1×10⁴/0.2ml/只，折算成人的劑量(小鼠劑量通常是人用劑量的10倍)時(shí)，約為0.5×10⁵/kg體重。

四、方法

l、用尾靜脈注射架固定小鼠。

2、用酒精棉球擦尾巴使血管擴(kuò)張；注射狀態(tài)為尾巴發(fā)白，緊靠白色的尾骨兩側(cè)清晰可見(jiàn)兩根紅色靜脈。

3、用左手的食指，中指，無(wú)名指及大拇指將小鼠尾巴固定。握住1ml注射器前面0.1cm處。右手小指搭在拽著鼠尾的左手拇指處，按此手形進(jìn)針。

4、注射：注射時(shí)左手扯尾，使尾巴緊貼桌面，尾巴與桌邊緊貼轉(zhuǎn)彎處為進(jìn)針部位，一般選擇距離尾尖1/4或l/3處進(jìn)針。針頭入皮膚后馬上把針頭略往上，平行進(jìn)針，針扎入時(shí)有落空感，緩慢推注。

五、結(jié)果：

1.治療組在受體小鼠中定植，治療組小鼠胸腺、脾臟、血清、肝組織、肺臟、腦組織mda及cat含量明顯低于對(duì)照組、sod活力明顯高于對(duì)照組并且存在顯著性差異(p≤0.05)，與模型組相比，則存在極顯著性差異(p≤0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外，對(duì)于上述結(jié)果，本實(shí)施例2結(jié)果與實(shí)施例1同一參數(shù)的結(jié)果基本相同并且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.各組小鼠的組織病理切片顯示，模型組小鼠的各臟器結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，而細(xì)胞治療組小鼠的各臟器損傷有明顯修復(fù)。結(jié)果可見(jiàn)msc對(duì)衰老小鼠的臟器損傷有修復(fù)作用，從而發(fā)揮其抗衰老作用；另外，對(duì)于上述結(jié)果，本實(shí)施例2結(jié)果與實(shí)施例1同一指標(biāo)的結(jié)果基本無(wú)差異。

六、結(jié)論：gd2+msc與kdr+hsc聯(lián)合治療明顯改善d-半乳糖誘導(dǎo)亞急性衰老模型小鼠的衰老相關(guān)指標(biāo)，表明gd2+msc和kdr+hsc二者組合使用具有顯著的修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和臟器功能衰退的作用；另外，在僅是在細(xì)胞中補(bǔ)充添加微量維生素c和表皮生長(zhǎng)因子而其它試驗(yàn)條件不變的情況下，本實(shí)施例2采用顯著更少量的間充質(zhì)干細(xì)胞就能獲得與實(shí)施例1所用細(xì)胞數(shù)量那樣的生物學(xué)效應(yīng)。

補(bǔ)充試驗(yàn)2a：參照以上實(shí)施例2，但是在治療時(shí)僅使用gd2+msc以及僅使用kdr+hsc治療，卻發(fā)現(xiàn)均未呈現(xiàn)任何治療作用。

本發(fā)明人在充分的生物學(xué)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用本發(fā)明方法嘗試治療患者早老癥的患者，結(jié)果顯示本發(fā)明方法具有對(duì)早老癥優(yōu)異的治療作用，這種治療作用還體現(xiàn)在其能夠修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退。

補(bǔ)充試驗(yàn)2b：參考實(shí)施例2的方法，使用胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞與kdr+胎盤(pán)造血干細(xì)胞治療衰老小鼠，結(jié)果顯示與實(shí)施例2呈現(xiàn)基本相同的治療效果。

補(bǔ)充試驗(yàn)2c：參考實(shí)施例2的方法，使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞與kdr+胎盤(pán)造血干細(xì)胞治療衰老小鼠，結(jié)果顯示與實(shí)施例2呈現(xiàn)基本相同的治療效果。

補(bǔ)充試驗(yàn)2d：參考實(shí)施例2的方法，使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞即gd2+基質(zhì)細(xì)胞與kdr+臍帶血造血干細(xì)胞治療衰老小鼠，結(jié)果顯示與實(shí)施例2呈現(xiàn)基本相同的治療效果。

補(bǔ)充試驗(yàn)2e：參考實(shí)施例2的方法，不同的僅是在間充質(zhì)干細(xì)胞懸液中未添加維生素c(但仍添加相應(yīng)量的表皮生長(zhǎng)因子)，結(jié)果在msc單細(xì)胞懸液以3×10⁶/0.2ml/只的劑量時(shí)才能達(dá)到實(shí)施例1的效果，這表明在間充質(zhì)干細(xì)胞懸液中只添加表皮生長(zhǎng)因子而不添加維生素c不能獲得減少間充質(zhì)干細(xì)胞用量的效果。

補(bǔ)充試驗(yàn)2f：參考實(shí)施例2的方法，不同的僅是在間充質(zhì)干細(xì)胞懸液中未添加表皮生長(zhǎng)因子(但仍添加相應(yīng)量的維生素c)，結(jié)果在msc單細(xì)胞懸液以2.5×10⁶/0.2ml/只的劑量時(shí)才能達(dá)到實(shí)施例1的效果，這表明在間充質(zhì)干細(xì)胞懸液中只添加維生素c而不添加表皮生長(zhǎng)因子不能獲得減少間充質(zhì)干細(xì)胞用量的效果。

實(shí)施例3：msc+hsc治療衰老小鼠的機(jī)制研究

對(duì)實(shí)施例1所得生物學(xué)樣本，進(jìn)行衰老相關(guān)b-半乳糖苷酶(sa-β-gal)活性檢測(cè)。

1、細(xì)胞標(biāo)本收集分別取對(duì)照組和治療組治療后ld、3d、5d、7d、14d、28dmsc，以3％中性甲醛室溫固定5min后染色。

2、sa-β-gal染色

先將x-gal以20/l的濃度溶入二甲基甲酰胺配成x-gal儲(chǔ)存液，常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。新鮮染液的配制：1mg/mlx-gal+40mmol/l檸檬酸緩沖液(ph6.0)+5mmol/l亞鐵氰化鉀+5mmol/l鐵氰化鉀+150mmol/lnacl+2mmol/lmgcl2。

染色：將標(biāo)本浸入新鮮染液室溫染色12～16h，蒸餾水漂洗，中性紅或giemsa染液復(fù)染，光鏡下觀察。

3、sa-β-gal顯色結(jié)果觀察

sa-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞比率以顯微鏡下隨機(jī)所選5個(gè)視野/玻片的陽(yáng)性染色細(xì)胞均數(shù)作為每張玻片的陽(yáng)性率，陽(yáng)性率以3張玻片的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。

4、衰老相關(guān)b-半乳糖苷酶(sa-β-gal)活性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組sa-β-gal染色陽(yáng)性率為3.03±0.66％；而gd2+msc和kdr+hsc治療后1d、3d、7d、14d、28d后msc的sa-β-gal染色陽(yáng)性率分別為2.92±0.58％，3.17±0.76％，3.13±0.76％，2.37±0.76％，2.61±0.76％；它們分別與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著差異(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間無(wú)顯著差異，說(shuō)明gd2+msc與kdr+hsc不能引起msc衰老。

5.細(xì)胞衰老相關(guān)基因p16ink4a、p53、p21cipl/wafl的相對(duì)表達(dá)

(1)p16：gd2+msc與kdr++hsc治療后1d、3d、7d、14d的msc的p16未見(jiàn)明顯升高，與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(p>0.05)。gd2+msc與kdr+hsc治療后28d的p16與對(duì)照組間的差異有極顯著意義(p<0.001)，明顯降低。

(2)p21：gd2+msc與kdr+hsc治療后ld、7d、14d、28d的msc的p2l未見(jiàn)明顯升高，與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(p>0.05)。gd2+msc與kdr+hsc治療后3d的p21與對(duì)照組間的差異有顯著意義(p<0.05)，明顯降低。

(3)p53：gd2+msc與kdr+hsc治療后ld、3d、7d、14d、28d的msc的p53與對(duì)照組相比明顯降低，組間差異有顯著意義(p<0.05)。

以上結(jié)果顯示gd2+msc與kdr+hsc組合治療對(duì)于衰老小鼠有顯著的治療作用。

另外，在參照上述實(shí)施例3所進(jìn)行的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)3a中，對(duì)實(shí)施例2所得生物學(xué)樣本，進(jìn)行衰老相關(guān)b-半乳糖苷酶(sa-β-gal)活性檢測(cè)，結(jié)果顯示各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)和指標(biāo)與上述實(shí)施例3的結(jié)果基本相同，無(wú)明顯差異。

產(chǎn)業(yè)實(shí)用性

本發(fā)明屬于細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，特別是涉及一種包括gd2+基質(zhì)細(xì)胞和kdr+造血干細(xì)胞的治療劑。進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及gd2+基質(zhì)細(xì)胞和kdr+造血干細(xì)胞二者組合在制備用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。本發(fā)明治療劑可以有效地用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退。