本發(fā)明屬于異甘草素深加工的應用技術領域，尤其涉及一種異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物及組合物及制備方法及新用途。

背景技術：

運動性疲勞是運動醫(yī)學和運動生理學研究的永恒主題。關于運動性疲勞的形成機制，人們提出了各種假說，如能源物質耗竭學說、自由基傷害學說、神經遞質學說、乳酸堆積學說及ca²⁺穩(wěn)態(tài)異常學說等。

能源物質耗竭學說提出，能源物質包括各種糖原、atp、磷酸肌酸等，機體在短時間高強度運動時，會大量的動用糖原等能源物質分解，以提供能量，如果其中的一些含量下降，又得不到及時的補充，從而會引發(fā)運動性疲勞。

異甘草素，分子式:(e)-1-(2,4-二羥基苯基)-3-(4-羥基苯基)-2-丙烯-1-酮；4,2',4'-三羥基查耳酮。異甘草素的化學結構通式為：

甘草中的黃酮類成分可分為水溶性黃酮和脂溶性黃酮，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗?jié)?、抗腫瘤、保護胃黏膜作用。近年來又發(fā)現甘草黃酮能夠抑制癌細胞的增殖。

異甘草素具有消除自由基，抗氧化的藥理活性，但是在水中的溶解性較差，服用是吸收較差，所以需要解決異甘草素溶解性差、人體吸收較差的問題。

關于異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備技術，及其包合物及組合物用于抗運動性疲勞的研究，尚未見報道。

技術實現要素：

本發(fā)明提出了異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物。

本發(fā)明還提出了異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備方法。

本發(fā)明還提出了異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物藥物組合物。

本發(fā)明還提出了異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的新用途。

一種異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物，含有異甘草素和環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，所述異甘草素與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的摩爾數比為1:1～1:100，所述環(huán)糊精衍生物選自羥乙基-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、麥芽糖-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、磺乙基-β-環(huán)糊精、磺丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精的一種。

一種異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備方法，取環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，加水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入異甘草素，加入的異甘草素摩爾數與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的摩爾數的比例為1:1～1:100，繼續(xù)攪拌，使所述環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物和異甘草素完全反應，待反應完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預冷凍4h，再用冷凍干燥機在-80℃干燥過夜得固體異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物；

所述環(huán)糊精衍生物選自羥乙基-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、麥芽糖-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、磺乙基-β-環(huán)糊精、磺丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精的一種。

一種藥物組合物，包含一種異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物和制藥學上可接受的輔料，所述藥物組合物是以異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物為活性成分，所述輔料為藥劑上任意可以接受的賦形劑，所述異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物和輔料的重量比為10:90～90:10；

所述異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物含有異甘草素和環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，所述異甘草素與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的摩爾數比為1:1～1:100；

所述環(huán)糊精衍生物選自羥乙基-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、麥芽糖-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、磺乙基-β-環(huán)糊精、磺丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精的一種，所述環(huán)糊精為β-環(huán)糊精。

異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物在制備治療和/或預防抗運動性疲勞藥物中的應用。

本發(fā)明通過環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的包合行為，提高異甘草素的水溶性，進而提高人體對異甘草素的吸收能力；

異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備方法還可以采用超聲法和研磨法：

超聲法：精密稱取異甘草素和環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物加入水溶解，在環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物水溶液中加入異甘草素后，立即超聲至溶解透明，加入的異甘草素摩爾數與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的摩爾數的比例為1:1～1:100，超聲完成后，將上述溶液過微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預冷凍4h，再用冷凍干燥機在-80℃干燥過夜得固體異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物。

研磨法：

精密稱取精密稱取環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，加入適量蒸餾水將環(huán)糊精研勻，在研磨條件下，緩慢分次加入異甘草素，充分研磨，將獲得的糊狀物在-80℃冰箱預冷凍4h，再用冷凍干燥機在-80℃干燥過夜得固體異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物，加入的異甘草素摩爾數與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的摩爾數的比例為1:1～1:100。

包含一種異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物和制藥學上可接受的輔料的藥物組合物，是以異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物為活性成分，所述輔料為藥劑上任意可以接受的賦形劑，賦形劑可以為蔗糖、乳糖、葡萄糖的一種或幾種任意組合而成的穩(wěn)定劑。在具體實施例中，所述異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物和輔料的重量比可以為10:90、20:80、25:85、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、60:60、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10。

上述異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物作為制備改善或治療抗運動性疲勞藥物中的應用及藥物組合物是發(fā)明人在研究異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的過程中，經過建立動物模型，檢測試驗小鼠樣本中的肝糖原、血乳酸、尿素氮的變化水平，證實了異甘草素具有抗運動性疲勞的作用，并制備出了抗運動性疲勞藥物組合物。

附圖說明

圖1為異甘草素、異甘草素-β-環(huán)糊精包合物以及異甘草素和β-環(huán)糊精混合物的紅外圖譜。

圖2為異甘草素、異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物以及異甘草素和羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的紅外圖譜。

具體實施方式

以下為異甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備方法實施例

實施例一：異甘草素-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取1mmolβ-環(huán)糊精，加60g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol異甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述β-環(huán)糊精和異甘草素完全反應，待反應完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預冷凍4h，再用冷凍干燥機在-80℃干燥過夜得固體異甘草素-β-環(huán)糊精包合物。

實施例二：異甘草素-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取10mmolβ-環(huán)糊精，加600g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol異甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述β-環(huán)糊精和異甘草素完全反應，待反應完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預冷凍4h，再用冷凍干燥機在-80℃干燥過夜得固體異甘草素-β-環(huán)糊精包合物。

實施例三：異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取1mmol羥丙基-β-環(huán)糊精，加10g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol異甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述羥丙基-β-環(huán)糊精和異甘草素完全反應，待反應完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預冷凍4h，再用冷凍干燥機在-80℃干燥過夜得固體異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。

實施例四：異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取10mmol羥丙基-β-環(huán)糊精，加100g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol異甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述羥丙基-β-環(huán)糊精和異甘草素完全反應，待反應完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預冷凍4h，再用冷凍干燥機在-80℃干燥過夜得固體異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。

實施例五：異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取100mmol羥丙基-β-環(huán)糊精，加500g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol異甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述羥丙基-β-環(huán)糊精和異甘草素完全反應，待反應完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預冷凍4h，再用冷凍干燥機在-80℃干燥過夜得固體異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。

實施例六：異甘草素-羧甲基-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取10mmol羧甲基-β-環(huán)糊精，加100g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol異甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述羧甲基-β-環(huán)糊精和異甘草素完全反應，待反應完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預冷凍4h，再用冷凍干燥機在-80℃干燥過夜得固體異甘草素-羧甲基-β-環(huán)糊精包合物。

對上述實施例一、實施例三制得的異甘草素-β-環(huán)糊精包合物、異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物進行紅外光譜測定，進而驗證是否生成包合物。

紅外測定方法為：各取微量異甘草素、異甘草素-β-環(huán)糊精包合物、異甘草素和β-環(huán)糊精混合物、異甘草素-hp-β-環(huán)糊精包合物以及異甘草素和hp-β-環(huán)糊精混合物，加入適量固體kbr，充分研磨均勻并壓片,分辨率為2cm^-1，3500～500cm^-1全譜掃描。對異甘草素、異甘草素-β-環(huán)糊精包合物、異甘草素和β-環(huán)糊精混合物、異甘草素-hp-β-環(huán)糊精包合物以及異甘草素和hp-β-環(huán)糊精混合物分別進行紅外測定，結果如圖1、圖2所示。

由圖1可見，異甘草素與β-環(huán)糊精各有自身的紅外特征吸收峰?；旌衔锏墓庾V圖具有加和性，表現為兩組分的疊加；包合物則表現不同，包合物有部分峰發(fā)生紫移，部分峰發(fā)生紅移,部分峰消失。包合物與環(huán)糊精的圖譜比較，包合物以環(huán)糊精的圖譜為主，而異甘草素的光譜特征部分消失。這可以說明實驗結果和理論預期幾乎一致，環(huán)糊精空腔孔徑與客體分子相匹配，異甘草素分子包埋于β-環(huán)糊精的空腔內，其分子振動受到限制而不能完全顯現其原有的紅外特性。異甘草素與β-環(huán)糊精之間形成了超分子包合物。

由圖2可見，異甘草素與hp-β-環(huán)糊精各有自身的紅外特征吸收峰?；旌衔锏墓庾V圖具有加和性，表現為兩組分的疊加；包合物則表現不同，包合物有部分峰發(fā)生紫移，部分峰發(fā)生紅移,部分峰消失。包合物與環(huán)糊精的圖譜比較，包合物以環(huán)糊精的圖譜為主，而異甘草素的光譜特征部分消失。這可以說明實驗結果和理論預期幾乎一致，環(huán)糊精空腔孔徑與客體分子相匹配，異甘草素分子包埋于hp-β-環(huán)糊精的空腔內，其分子振動受到限制而不能完全顯現其原有的紅外特性。異甘草素與hp-β-環(huán)糊精之間形成了超分子包合物。

以下為異甘草素-β-環(huán)糊精包合物及異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的藥理實驗：

本發(fā)明中，發(fā)明人經過建立動物模型，檢測試驗小鼠樣本中的肝糖原、血乳酸、尿素氮的變化水平，證實了異甘草素-β-環(huán)糊精包合物，及異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物具有抗運動性疲勞的作用，并制備出了抗運動性疲勞藥物組合物。

一、實驗動物：實驗小鼠購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心，雄性、四周齡、體重(22±2g)、spf級，動物生產許可證號:syxk(寧)。喂養(yǎng)條件包括標準飼料，自來水，室溫保持在(24士2)℃，濕度50-60％，每日光照與黑暗時間各12h。實驗準備前，將動物置于實驗環(huán)境適應3天。

二、實驗藥品及儀器

藥品：采用上述方法制備得到的異甘草素-β-環(huán)糊精包合物，異甘草素-羥丙基β-環(huán)糊精包合物，三氯醋酸(ar，麥克林試劑公司)，葡萄糖(ar，阿拉丁試劑公司)，羧甲基纖維素鈉(ar，麥克林試劑公司)，蒽酮(ar，阿拉丁試劑公司)，硫脲(ar，阿拉丁試劑公司)，氟化鈉(ar，阿拉丁試劑公司)，鎢酸鈉(ar，麥克林試劑公司)，三氯乙酸(ar，麥克林試劑公司)，硫酸銅(ar，阿拉丁試劑公司)，對羥基聯苯(ar，阿拉丁試劑公司)，乳酸鈣(ar，阿拉丁試劑公司)，濃硫酸(寧夏美信生物試劑公司)，乙醇(寧夏美信生物試劑公司)，naoh(寧夏美信生物試劑公司)。

儀器：sps202f型分析天平(中州電子衡器有限公司)，model1510型超聲波清洗器(沃瓏儀器設備)，l-530型低溫離心機(塞維亞科技發(fā)展公司)，uv-2901型紫外可見分光光度計(hitachi公司)，bs-220型邁瑞全自動生化分析儀(武漢盛世達設備)。

三、實驗方法

1.試驗用藥的配制：異甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液、異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物溶液。

每隔三天按照試驗小鼠的實際重量按10mg·kg^-1的藥量分別配制異甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液和異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物溶液儲存于4℃的冰箱中備用；

所述異甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液配制的操作為：每1ml0.5％羧甲基纖維素鈉中加入含1mg異甘草素的異甘草素-β-環(huán)糊精包合物，用于對以下c組實驗小鼠灌胃使用；

所述異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物溶液配制的操作為：每1ml0.5％羧甲基纖維素鈉中加入含1mg異甘草素的異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，用于對以下d組實驗小鼠灌胃使用。

2.實驗分組

實驗小鼠80只、雄性、四周齡、體重(22±2g)、spf級、正常飼養(yǎng)以及每天適應性游泳20分鐘，三天后，按體重隨機分為四組：

a(安靜對照組)、b(耐力訓練組)、c(耐力訓練+異甘草素-β-環(huán)糊精包合物組)、d(耐力訓練+異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物組)每組20只。

每組實驗小鼠每日下午1：00給藥，給藥的量為為按照小鼠的體重每千克灌10mg·kg^-1；10mg·kg^-1為小鼠每千克體重灌的異甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液中異甘草素的量為10mg，或者，10mg·kg^-1為小鼠每千克體重灌的異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物溶液中異甘草素的量為10mg，a組和b組小鼠用等體積0.5％羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，連續(xù)6周，室溫為25±2℃。每日更換清潔墊料，每日更換清潔飲水瓶.每天稱小鼠體重一次并記錄。

3.小鼠耐力訓練

a組只灌胃不進行游泳訓練，b、c、d組小鼠在實驗動物游泳池中分別進行每日遞進式游泳鍛煉，水深為40～50cm，水溫為25士2℃。每周進行5天訓練，每天上午和下午各1次，上午9:00am開始訓練，下午3：00pm開始訓練，訓練量如下表1：

表1耐力訓練時間表

4.小鼠力竭游泳運動

按上述時刻表每天對各b、c、d組小鼠進行兩次游泳訓練，在訓練第六周后進行力竭游泳運動并記錄小鼠力竭游泳的時間，如下表2：

表2為試驗小鼠力竭游泳時間

注：δ組與b組比較p＜0.01。

由表2中可得出，c組、d組試驗小鼠的力竭游泳時間比其他組都長，可見，甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液、及甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物能夠明顯延長小鼠力竭游泳的時間，而游泳時間的長短可以直接反映小鼠疲勞的程度，因此，說明異甘草素能夠改善耐力訓練小鼠的疲勞癥狀，提高小鼠的運動能力，延緩運動性疲勞的發(fā)生，具有抗運動性疲勞的效果。

5.小鼠取材

宰殺小鼠前對使用器械進行消毒滅菌。每組小鼠隨機取出10只小鼠不進行游泳，直接取眼球血，立即預留80μl全血，剩余離血清。

再將小鼠處死，即刻用75％酒精為小鼠皮膚消毒，取肝臟，用4℃的生理鹽水清洗血液，用濾紙吸干生理鹽水，再稱重，將其迅速放于液氮中速凍。

每組小鼠中剩下10只小鼠進行游泳訓練100min，訓練后取眼球血，每一只小鼠取血以后，預留80μl的全血，剩下的全血必須立即在3000rpm/min條件下，用低溫離心機(4℃)，離心15min，小心吸取血清保存于-80℃的冰箱。

6.檢測指標

本實施例主要檢測異甘草素-環(huán)糊精包合物對耐力訓練小鼠的抗運動性疲勞的有關指標。其中檢測指標主要包括：肝糖原、血乳酸(bla)、尿素氮(bun)。

(1)酮一硫酸法測定小鼠肝糖原

試劑配制：

配制葡萄糖標準溶液：稱取0.01g的葡萄糖，溶解于10ml蒸餾水中。

配制5％三氯醋酸(tca)：準確稱取5.0g三氯醋酸，溶解于100ml蒸餾水中。

配制蒽酮試劑：先配制72％的濃硫酸溶液，72％的濃硫酸溶液配制時，先在燒杯中加入140ml蒸餾水，邊攪邊緩緩加入比重為1.84的濃硫酸360ml，等到h2so4的溫度降到80-90℃時加入0.25g的蒽酮和5g的硫脲，搖勻，待冷卻后儲存于冰箱。

檢測步驟：以c組為例

對c組試驗小鼠的肝糖原的提取計算：精確稱取c組的不游泳的10只小鼠的肝臟組織各100mg，分別加入8mltca，然后勻漿1min，以3000轉/min的速度離心15min，轉移上清液至另一支試管內；取上清液1ml于10ml的離心管中，每管加入4ml95％乙醇，充分混勻，蓋緊離心管，保持豎立，常溫下過夜，以3000轉/min的速度離心15min；小心棄去上清液，倒立離心管10min至管內無液滴存在；加入2ml蒸餾水，確保洗下管壁糖原，振蕩離心管使糖原完全溶解；向各管加入10ml蒽酮試劑，充分混合，待溫度降至涼水溫度后，再浸于沸水中加熱15min，轉移到冷水浴冷卻，在620nm波長下，測定吸光度，得到第一組吸光度值。

為了數據更加精確，做三組平行實驗，即，第二組平行試驗為：繼續(xù)精確稱取c組的不游泳的10只小鼠的剩余肝臟組織各100mg，重復上述步驟，測定吸光度，得到第二組吸光度值；第三組平行試驗為：再次精確稱取c組的不游泳的10只小鼠的剩余肝臟組織各100mg，重復上述步驟，測定吸光度，得到第三組吸光度值；

將上述三組平行試驗的三組吸光度值分別代入肝糖原公式計算，得到c組的三組肝糖原數，再將三組肝糖原數求均值得到c組的肝糖原數。

作為對比試驗方案，也可以分別配制空白管、標準管：

空白管：取2ml蒸餾水于干凈的試管中。

標準管：取葡糖糖標準液0.5ml和蒸餾水1.5ml于標準管中，混勻。

然后在空白管和標準管中分別加入10ml蒽酮試劑，充分混合，待溫度降至涼水溫度后，再浸于沸水中加熱15min，轉移到冷水浴冷卻，在620nm波長下，分別測定空白管吸光度和標準管吸光度。

同理，對a組、b組的試驗小鼠的肝糖原的提取計算方法同于c組的方法，也對不游泳的10只小鼠的肝臟組織采用同于c組的方法提取計算肝糖原。如下表4。

肝糖原公式為：

每100克肝(肌)組織中糖原的毫克數＝du/ds×0.5×提取液體積/肝組織克數×100×0.9，式中，

ds：標準管吸光度；

du：樣品管吸光度；

提取液體積為8ml；

肝組織克數為0.1g；

0.9為將葡萄糖換算成糖原的系數；

0.5為0.5ml葡萄糖標準液中葡萄糖的含量。

(2)用自配試劑方法測定小鼠血乳酸含量

試劑配制：

10％鎢酸鈉：稱取10g鎢酸鈉溶解于100ml蒸餾水中。

1/3mol/l硫酸：量取濃硫酸0.8ml于50ml容量瓶，用蒸餾水定容。

1％naf溶液：準確稱取1.125gnaf溶解于100ml蒸餾水中。

10％的三氯醋酸：準確量取三氯醋酸9.9ml，溶解于100ml蒸餾水中。

cuso4溶液：準確稱取0.42gcuso4，溶于10ml蒸餾水中。

蛋白沉淀劑：將1/3mol/l的硫酸、10％的鎢酸鈉、蒸餾水按照體積比為1:1:1的比例混合。

蛋白沉淀劑-naf混合液：按體積分別取10ml1％naf和30ml蛋白沉淀劑混合。

1.5％對羥基聯苯溶液：稱取對羥基聯苯1.5g溶解于100ml熱的0.5％的naoh中。

乳酸標準儲備液(1g/l)：稱取0.171g乳酸鈣，加入10％三氯醋酸中定容至100ml。

乳酸標準應用液(0.01g/l)：吸取1.0ml乳酸標準儲備液，溶解于100ml容量瓶，用蒸餾水定容。

對c組試驗小鼠的血乳酸的檢測步驟：

吸取0.48ml1％naf溶液于5ml離心管中，加入c組游泳的小鼠的全血20μl。混勻后，加入1.5ml蛋白沉淀劑，用力振蕩混勻，在3000轉/min條件下，離心10min，取上清液，30℃水浴中加熱30min，再置于沸水浴中90s，待冷卻后，在560nm波長下，測定吸光度值，即c組的吸光度值a樣品管，然后依據血乳酸含量計算公式計算得到c組血乳酸含量。

作為對比試驗方案，也可以分別配制空白管、標準管，如下表3

表3血乳酸測定試驗方案配制

將標準管至于30℃水浴中加熱30min，再置于沸水浴中90s，待冷卻后，在560nm波長下，測定吸光度值，即c組的吸光度值a標準管，用于計算每一組的血乳酸含量。

同理，對a、b組試驗小鼠的血乳酸的檢測步驟同于c組的檢測步驟，測定a、b組吸光度值，即a組的a樣品管、b組的a樣品管，計算得到a、b組血乳酸含量。如下表4。

血乳酸含量計算公式為：

血乳酸(mg/l)＝a樣品管/a標準管×100×10

(3)生化指標測定

本實驗中，用全自動生化分析儀分別對a、b、c組、d組中游泳的試驗小鼠的血清進行分析測定，進而對各組試驗小鼠的尿素氮(bun)的含量進行測定。如表4。

7.試驗結果

表4肝糖原、尿素氮和血乳酸

注：#與b組肝糖原比較p＜0.01；▼與b組尿素氮比較p＜0.01；■與b組血乳酸比較p＜0.01。

由表4可知，c組和d組的肝糖原含量高于a組、b組的肝糖原含量，可見，從能量代謝的角度可推斷異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、異甘草素-β-環(huán)糊精包合物能減小肝糖原的分解，或者能促進肝糖原的合成，進而提高運動耐力，有良好的抗運動疲勞效果。

c組、d組的血乳酸含量低于b組的血乳酸含量，可見，從乳酸堆積學說角度來推斷，異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、異甘草素-β-環(huán)糊精包合物能抑制或降低血乳酸的產生，或能夠分解血乳酸，進而提高運動耐力，有良好的抗運動疲勞效果。

c組、d組的尿素氮含量低于b組的尿素氮含量，可見，從數據可推斷，異甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、異甘草素-β-環(huán)糊精包合物能抑制或降低尿素氮的產生，或能夠分解尿素氮，進而提高運動耐力，有良好的抗運動疲勞效果。

以上所揭露的僅為本發(fā)明較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發(fā)明之權利范圍，本領域普通技術人員可以理解實現上述實施例的全部或部分流程，并依本發(fā)明權利要求所作的等同變化，仍屬于發(fā)明所涵蓋的范圍。