本發(fā)明屬于高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

納米材料的生物利用率在生物應(yīng)用材料的應(yīng)用中扮演著重要角色。為了提高納米材料的生物功能，開發(fā)了各種策略來提高納米材料在目標(biāo)位置的積累和滯留，例如，高通透性和滯留(epr)效應(yīng)，主動(dòng)靶向機(jī)制，長(zhǎng)效血液循環(huán)等等?；谝陨细拍睿藗冎铝τ谠O(shè)計(jì)并合成物理化學(xué)性能易于控制的納米材料，例如，尺寸、形態(tài)、電荷、表面化學(xué)、有效負(fù)載量和穩(wěn)定性。然而，精確制備大體積的納米材料仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

除了發(fā)展可控制備納米材料的新策略，也開發(fā)了一種在活體水平探索功能材料的新策略。這種策略的主要思想是在特殊生理或病理環(huán)境下通過小分子的自組裝來構(gòu)筑有特殊功能的納米結(jié)構(gòu)。

由于溫度響應(yīng)性聚合物的溫度誘導(dǎo)的線-球轉(zhuǎn)換特性，溫度響應(yīng)性聚合物在藥物/蛋白遞送系統(tǒng)，免疫佐劑，人工抗體，造影劑等發(fā)面有極大應(yīng)用。為了在生物體應(yīng)用溫度響應(yīng)性聚合物，溫度的改變并不總是在生理?xiàng)l件范圍內(nèi)。因此，迫切需要開發(fā)更智能，更溫和的生物相容性的觸發(fā)而不是溫度的改變。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料及其制備方法和應(yīng)用。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料，所述材料包括響應(yīng)性多肽和穿膜肽組成的多肽序列以及溫敏聚合物，所述多肽序列的響應(yīng)性多肽連接在溫敏聚合物上。

本發(fā)明的材料可以通過穿膜肽輔助材料進(jìn)胞，進(jìn)入細(xì)胞后對(duì)胞內(nèi)特定刺激信號(hào)做出響應(yīng)，移除親水性的多肽(即響應(yīng)性多肽部分)，改變材料的相轉(zhuǎn)化溫度到生理溫度37℃以下，最終導(dǎo)致材料的塌縮聚集，形成納米聚集體。

傳統(tǒng)的方法是將大的納米顆粒遞送到需要的位置(如腫瘤)，但是這種方法會(huì)導(dǎo)致材料在肝腎富集產(chǎn)生毒性。本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料是親水性較強(qiáng)的材料，其通過舒展的狀態(tài)以水溶液的形式進(jìn)入活體，改善生物分布，在需要的位置(如腫瘤)在某種條件觸發(fā)下原位聚集或組裝，可以提高材料的利用度，同時(shí)因?yàn)椴粫?huì)導(dǎo)致肝腎毒性，并且可以改善藥物或熒光分子的生物分布，增加其在作用部位的滯留時(shí)間，增加利用度，降低給藥次數(shù)等。

優(yōu)選地，所述溫敏聚合物為聚n-異丙基丙烯酰胺、聚n,n-二乙基丙烯酰胺、聚n-羥甲基丙基甲基丙烯酰胺、聚n-2,2-二甲基1,3-二氧戊環(huán)甲基丙烯酰胺、聚n-2-甲氧基1,3-二氧乙環(huán)甲基丙烯酰胺、聚n-2-乙氧基1,3-二氧乙環(huán)甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯、聚n-乙烯基異丁酰胺、聚甲基乙烯基醚、聚n-乙烯基己內(nèi)酰胺或聚2-乙基惡唑啉中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選聚n-異丙基丙烯酰胺。

優(yōu)選地，所述溫敏聚合物的合成方法為活性/可控自由基聚合，優(yōu)選raft聚合(可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合)。

優(yōu)選地，所述raft聚合的鏈轉(zhuǎn)移試劑為n,n'-二甲基n,n'-二(4-吡啶基)秋蘭姆二硫化物、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸、雙(十二烷基硫烷基硫代羰基)二硫化物、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯、氰甲基甲基(苯基)氨基二硫代甲酸酯、甲基-2-丙酸甲基(4-吡啶)氨基二硫代甲酸酯、甲基-2-(十二烷基三硫代碳酸酯)-2-甲基丙酸酯或2-苯基-2-丙基苯并二硫中任意一種或至少兩種的組合，進(jìn)一步優(yōu)選2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯。

優(yōu)選地，所述響應(yīng)性多肽為谷胱甘肽響應(yīng)性多肽、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3響應(yīng)性多肽、半胱氨酸蛋白酶atg4響應(yīng)性多肽、基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性多肽或磷酸酶響應(yīng)性多肽中的任意一種，優(yōu)選谷胱甘肽響應(yīng)性多肽、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3響應(yīng)性多肽或半胱氨酸蛋白酶atg4響應(yīng)性多肽。

優(yōu)選地，所述谷胱甘肽響應(yīng)性多肽為cys-lys-(s-s)-asp。

優(yōu)選地，所述半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3響應(yīng)性多肽為cys-lys-asp-glu-val-asp。

優(yōu)選地，所述半胱氨酸蛋白酶atg4響應(yīng)性多肽為cys-lys-thr-phe-gly-phe。

優(yōu)選地，所述基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性多肽為cys-lys-gly-pro-leu-gly-val-arg-gly-lys或cys-lys-pro-leu-gly-leu-ala-gly。

優(yōu)選地，所述磷酸酶響應(yīng)性多肽為cys-lys-leu-val-phe-tyr(hpo3)或cys-lys-leu-val-phe-tyr(hpo3)-lys-leu-val-phe-tyr(hpo3)。

優(yōu)選地，所述穿膜肽為grkkrrqrrrpq(gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-pro-gln)、rqikwfqnrrmkwkk(arg-gln-ile-lys-trp-phe-gln-asn-arg-arg-met-lys-trp-lys-lys)、ygrkkrrqrrr(tyr-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg)、rggrlsysrrrfststgr(arg-gly-gly-arg-leu-ser-tyr-ser-arg-arg-arg-phe-ser-thr-ser-thr-gly-arg)、rrlsysrrrf(arg-arg-leu-ser-tyr-ser-arg-arg-arg-phe)、pirrrkklrrlk(pro-ile-arg-arg-arg-lys-lys-leu-arg-arg-leu-lys)、rrqrrtsklmkr(arg-arg-gln-arg-arg-thr-ser-lys-leu-met-lys-arg)、rrrrnrtrrnrrrvr(arg-arg-arg-arg-asn-arg-thr-arg-arg-asn-arg-arg-arg-val-arg)、kmtraqrraaarrnrwtar(lys-met-thr-arg-ala-gln-arg-arg-ala-ala-ala-arg-arg-asn-arg-trp-thr-ala-arg)、trrqrtrrarrnr(thr-arg-arg-gln-arg-arg-ala-arg-arg-asn-arg)、rrrrrrrr(arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg)或grrrrrrrrrppq(gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-pro-pro-gln)中的任意一種。

優(yōu)選地，所述材料還包括信號(hào)分子和/或藥物分子，所述信號(hào)分子和/或藥物分子連接在響應(yīng)性多肽上。信號(hào)分子可以用于觀察材料在細(xì)胞內(nèi)的滯留以及材料的形態(tài)變化等，藥物分子可以用于腫瘤化療或系統(tǒng)免疫激活用于免疫治療。

優(yōu)選地，所述信號(hào)分子為具有光聲成像效應(yīng)的分子、具有極性響應(yīng)熒光效應(yīng)分子或具有近紅外熒光效應(yīng)的分子中的任意一種。

優(yōu)選地，所述具有光聲成像效應(yīng)的分子為紫紅素-18卟啉類化合物。

優(yōu)選地，所述具有極性響應(yīng)熒光效應(yīng)分子為4-(n,n-二甲氨基磺酰)-7-氟-2,1,3-苯并惡二唑(dbd)類化合物。

優(yōu)選地，所述具有近紅外熒光效應(yīng)的分子為花菁類化合物，優(yōu)選cy5、cy6或cy7中的任意一種或至少兩種的組合進(jìn)一步優(yōu)選cy7。

優(yōu)選地，所述藥物分子為苯達(dá)莫斯汀、苯丁酸氮芥或甲氨蝶呤中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，所述響應(yīng)性多肽和穿膜肽通過酰胺鍵連接在一起。

優(yōu)選地，所述多肽序列作為側(cè)鏈接枝在溫敏聚合物的骨架上。

優(yōu)選地，所述接枝通過邁克爾加成法實(shí)現(xiàn)，即通過溫敏聚合物中的雙鍵與響應(yīng)性多肽中巰基進(jìn)行邁克爾加成，從而實(shí)現(xiàn)將多肽序列接枝在溫敏聚合物的骨架上。

優(yōu)選地，所述溫敏聚合物的分子量為20-80kd，例如20kd、25kd、30kd、35kd、40kd、45kd、50kd、55kd、60kd、65kd、70kd、75kd或80kd，優(yōu)選40kd。當(dāng)溫敏聚合物的分子量小于20kd時(shí)，會(huì)使得本發(fā)明所述的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料的響應(yīng)性變差，并且分子量太小或太大，均會(huì)使得材料對(duì)細(xì)胞的毒性增大。

優(yōu)選地，所述多肽連接比例為0.5-3％，例如0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％或3％，優(yōu)選1％。在本發(fā)明中，所述多肽連接比例指的是多肽連接在溫敏聚合物骨架上的量，具體的是：多肽與構(gòu)成溫敏聚合物的單體或單體混合物(當(dāng)聚合物由兩種以上單體聚合得到時(shí)，單體混合物指兩種以上單體的總和)的摩爾百分比。

優(yōu)選地，所述信號(hào)分子通過酰胺鍵與響應(yīng)性多肽連接在一起。

在本發(fā)明中，所述細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)手段進(jìn)行制備，例如可以通過本領(lǐng)域已知的聚合手段例如raft聚合來合成所需的溫敏聚合物，通過多肽固相合成法合成多肽序列，任選地在多肽序列上連接上信號(hào)分子和/或藥物分子，并通過邁克爾加成將多肽序列的響應(yīng)性多肽端接枝在溫敏聚合物的骨架上得到所述的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料。

另一方面，本發(fā)明提供了一種成像劑，所述成像劑包括如上所述的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料。

在本發(fā)明中可以利用所述細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料作為成像劑，以觀察材料在細(xì)胞內(nèi)的滯留以及材料的形態(tài)變化等。

另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物遞送材料，所述藥物遞送材料包括如上所述的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料。

在本發(fā)明中可以利用所述的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料作為藥物遞送材料，將該材料攜帶的藥物遞送至細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到靶向遞送目的，并且提高在細(xì)胞內(nèi)的滯留。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料通過穿膜肽輔助進(jìn)胞，進(jìn)入細(xì)胞后對(duì)胞內(nèi)特定刺激信號(hào)做出響應(yīng)，移除親水性的多肽，改變材料的相轉(zhuǎn)化溫度到生理溫度37℃以下，最終導(dǎo)致材料的塌縮聚集，形成納米聚集體。該策略可以實(shí)現(xiàn)材料在細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)時(shí)間滯留，對(duì)于活細(xì)胞成像或高滯留率的藥物遞送，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的步驟(1)制備得到的多肽序列的hplc譜圖；

圖2為實(shí)施例1的步驟(1)制備得到的多肽序列的maldi-tof譜圖；

圖3是實(shí)施例1的步驟(2)制備得到的雙鍵功能化的聚合物以及步驟(3)制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料的核磁氫譜；

圖4為實(shí)施例1制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料在半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3切割前后的最低臨界溶解溫度曲線圖；

圖5為實(shí)施例1中制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料在半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3切割后的聚集體的掃描電子顯微鏡圖，其標(biāo)尺為2μm；

圖6為實(shí)施例3的步驟(1)制備得到的多肽序列的hplc譜圖；

圖7為實(shí)施例3的步驟(1)制備得到的多肽序列的maldi-tof譜圖；

圖8為實(shí)施例4的步驟(1)制備得到的多肽序列的hplc譜圖；

圖9為實(shí)施例4的步驟(1)制備得到的多肽序列的maldi-tof譜圖；

圖10為實(shí)施例1制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料在荷瘤小鼠腫瘤部位形成聚集體后的熒光長(zhǎng)效成像圖；

圖11為實(shí)施例1制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料在荷瘤小鼠腫瘤部位形成聚集體后的熒光成像量化圖；

圖12為實(shí)施例1制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料在荷瘤小鼠體內(nèi)形成聚集體后熒光強(qiáng)度與腫瘤大小的關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。

實(shí)施例1

在本實(shí)施例中，所述細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料中多肽序列(包括響應(yīng)性多肽和穿膜肽)為cys-lys-asp-glu-val-asp-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-pro-gln，溫敏性聚合物為聚n-異丙基丙烯酰胺，合成方法如下：

(1)合成響應(yīng)性多肽cys-lys-asp-glu-val-asp-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-pro-gln，即

多肽合成采用fmoc固相合成法合成：合成選用0.35mm修飾密度的wang樹脂，其中第一個(gè)氨基酸(谷酰胺)c端被固定于樹脂上，n端被fmoc保護(hù)。用20％(v/v)的六氫吡啶的dmf溶液脫去fmoc保護(hù)，然后用茚三酮測(cè)試法測(cè)試去保護(hù)結(jié)果。然后將下一個(gè)氨基酸的羧基用0.4m的4-甲基嗎啉(nmm)和0.4m的苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)的dmf溶液活化，并加入到脫去保護(hù)的樹脂中反應(yīng)1小時(shí)。完成所有序列氨基酸的反應(yīng)后，用含有2.5％水、2.5％三異丙基硅烷和2.5％1,2-乙二硫醇的三氟乙酸溶液將合成好的多肽從樹脂上脫除，同時(shí)脫除氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)。將三氟乙酸用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除，然后多肽的粗產(chǎn)物用無水乙醚沉淀，洗滌并干燥。最后選用反相制備液相色譜，將多肽純化。純化過程的條件是：流動(dòng)相是含有0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的雙蒸水；參數(shù)是梯度洗脫從5％乙腈/95％水到60％乙腈/40％水，流速為10ml/min，處理時(shí)間為30min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波段為220nm。

(2)溫敏聚合物聚n-異丙基丙烯酰胺的制備

稱取39.6mmol的n-異丙基丙烯酰胺、0.4mmol的n-(2-羥乙基)丙烯酰胺、0.1mmol的2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸和0.02mmol的偶氮二異丁腈，并溶解在5ml的n，n'-二甲基甲酰胺中。通氮?dú)?0分鐘后在氮?dú)夥諊?5℃反應(yīng)10小時(shí)后將反應(yīng)暴露在空氣中并迅速放入冰浴中停止反應(yīng)。反應(yīng)得到的溶液用少量四氫呋喃稀釋并用預(yù)冷的己烷沉淀。得到的沉淀通過離心收集，再次溶解在2ml的四氫呋喃中并用己烷沉淀，該純化過程重復(fù)五次。最后冷凍干燥得到聚合物。

稱取1g聚合物和過量的異氰酸酯丙烯酸乙酯、0.9wt％的4,4'-亞甲基雙(2,6-二叔丁基苯酚)和0.1wt％的二月桂酸二丁基錫，并溶解在1ml的n，n'-二甲基甲酰胺中，40℃反應(yīng)36小時(shí)后用預(yù)冷的乙醚沉淀兩次，抽濾并真空干燥2小時(shí)得到雙鍵功能化的聚合物。

(3)溫度響應(yīng)性聚合物-多肽接合物的制備

稱取30mg的雙鍵功能化的聚合物和7mg多肽，并溶解在300l的二甲基亞砜中，加入兩滴三乙胺后37℃反應(yīng)24小時(shí)，透析后冷凍干燥得到溫度響應(yīng)性聚合物-多肽接合物，即所述細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料。

在本實(shí)施例中，步驟(1)制備得到的響應(yīng)性多肽的hplc譜圖如圖1所示，由該圖可知，多肽在流動(dòng)相中的保留時(shí)間為15.3分鐘。步驟(1)制備得到的響應(yīng)性多肽的maldi-tof譜圖如圖2所示，由該圖可知，多肽的分子量為2310.8。

步驟(2)制備得到的雙鍵功能化的聚合物以及步驟(3)制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料的核磁氫譜如圖3所示，化學(xué)位移值δ＝3.43ppm和δ＝3.18ppm分別對(duì)應(yīng)-och2-跟-ch2-；δ＝3.85ppm和δ＝1.05ppm對(duì)應(yīng)n-異丙基丙烯酰胺中的-ch-以及-ch3。δ＝9.0-8.0對(duì)應(yīng)多肽上的-conh-?；瘜W(xué)位移δ＝6.4-5.8ppm處的消失表示多肽成功連接到聚合物骨架上。

步驟(3)制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料在添加響應(yīng)性刺激半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3前后的相轉(zhuǎn)變溫度曲線如圖4所示，在酶加入之前，材料的相轉(zhuǎn)變溫度在生理溫度37℃之上，保證材料為單鏈?zhǔn)嬲範(fàn)顟B(tài)，在酶加入后，材料的相轉(zhuǎn)變溫度降到37℃之下，材料變的疏水而發(fā)生聚集，得到較為均一的聚集體，如圖5所示，聚集體大小為670±160nm。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1不同之處僅在于，在步驟(1)合成的過程中，最后一個(gè)氨基酸采用boc-cys(trt)-oh，與該cys相連的lys側(cè)鏈氨基由dde保護(hù)。當(dāng)用2％的水合肼脫除dde后，將信號(hào)分子cy5的羧基與此lys側(cè)鏈氨基以酰胺鍵相連。而后經(jīng)過與實(shí)施例1相同的步驟(2)和步驟(3)制備得到帶有信號(hào)分子的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料。

實(shí)施例3

在本實(shí)施例中通過與實(shí)施例2中步驟(1)相同的固相合成法合成了以下結(jié)構(gòu)的多肽序列ck(s-s)dgrkkrrqrrrpq：

圖6為多肽序列ck(s-s)dgrkkrrqrrrpq的hplc譜圖，由該圖可知，多肽在流動(dòng)相中的保留時(shí)間為17.6分鐘。

圖7為多肽序列ck(s-s)dgrkkrrqrrrpq的maldi-tof譜圖，由該圖可知，多肽的分子量為2131.5。

利用該多肽序列ck(s-s)dgrkkrrqrrrpq通過與實(shí)施例1中步驟(2)和步驟(3)相同的步驟最終制備得到細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料。

實(shí)施例4

在本實(shí)施例中通過與實(shí)施例2中步驟(1)相同的固相合成法合成了以下結(jié)構(gòu)的多肽序列cktfgfgrkkrrqrrrppq：

圖8為多肽序列cktfgfgrkkrrqrrrppq的hplc譜圖，由該圖可知，多肽在流動(dòng)相中的保留時(shí)間為14.6分鐘。

圖9為多肽序列cktfgfgrkkrrqrrrppq的maldi-tof譜圖，由該圖可知，多肽的分子量為2304.9。

利用該多肽序列cktfgfgrkkrrqrrrppq通過與實(shí)施例1中步驟(2)和步驟(3)相同的步驟最終制備得到細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料。

實(shí)施例5

對(duì)實(shí)施例2制備的得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料在荷瘤小鼠體內(nèi)的長(zhǎng)效成像：

向荷瘤小鼠體內(nèi)通過尾靜脈注射阿霉素和生理鹽水，每四天注射一次，共注射四次，阿霉素的注射濃度為每千克小鼠注射5毫克的阿霉素。注射完阿霉素和生理鹽水后，向荷瘤小鼠體內(nèi)通過尾靜脈注射熒光分子標(biāo)記的溫度響應(yīng)性聚合物-多肽接合物，接合物的注射濃度為每千克小鼠注射80毫克的接合物。選取0.5、1、3、6、9、12和24小時(shí)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，觀察在不同的時(shí)間點(diǎn)小鼠腫瘤部位的熒光成像。老鼠的影像圖如圖10所示，熒光定量數(shù)據(jù)如圖11所示，數(shù)據(jù)顯示未形成聚集體的材料很快在老鼠體內(nèi)清除，而形成聚集體的材料在腫瘤內(nèi)在3小時(shí)的時(shí)候熒光值達(dá)到最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光有微弱的降低，說明熒光標(biāo)記的聚集體在腫瘤內(nèi)有長(zhǎng)效的滯留。對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例3以及實(shí)施例4制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)測(cè)試，得到同樣的結(jié)果，證明熒光標(biāo)記的聚集體在腫瘤內(nèi)有長(zhǎng)效的滯留。

實(shí)施例6

對(duì)實(shí)施例2制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料聚集對(duì)荷瘤小鼠治療效果的評(píng)價(jià)：

向荷瘤小鼠體內(nèi)通過尾靜脈注射阿霉素和生理鹽水，每四天注射一次，共注射四次，阿霉素的注射濃度為每千克小鼠注射5毫克的阿霉素。注射完阿霉素和生理鹽水后，向荷瘤小鼠體內(nèi)通過尾靜脈注射熒光分子標(biāo)記的溫度響應(yīng)性聚合物-多肽接合物，注射濃度為每千克小鼠注射80毫克的聚合物-多肽接合物。每次在接合物注射后的3小時(shí)節(jié)點(diǎn)讀取熒光數(shù)據(jù)，將熒光數(shù)據(jù)與腫瘤的體積變化擬合如圖12所示，聚集體反映的熒光強(qiáng)度與腫瘤的體積變化成線性相關(guān)，腫瘤體積小對(duì)應(yīng)的熒光值也小，說明細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體可以對(duì)荷瘤小鼠治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例3以及實(shí)施例4制備得到的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)筑溫度響應(yīng)性聚集體的材料進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)測(cè)試，得到同樣的結(jié)果，證明得到的材料可以對(duì)荷瘤小鼠治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。