本發(fā)明涉及一種軟骨組織工程修復(fù)支架及其制備方法。

背景技術(shù)：

軟骨組織工程是一種采用組織工程學(xué)方法構(gòu)建軟骨組織的技術(shù)。軟骨組織工程的核心要素包括種子細(xì)胞、軟骨組織工程修復(fù)支架和生長(zhǎng)因子。

軟骨組織工程修復(fù)支架能夠提供三維空間結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的黏附、增殖，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，通常將組織工程修復(fù)支架置于骨軟骨缺損區(qū)，用于缺損的填充修補(bǔ)，來促進(jìn)軟骨組織和軟骨下骨的再生修復(fù)。常用的組織工程修復(fù)支架主要采用天然生物支架材料制備而成，其不僅能夠促進(jìn)正常細(xì)胞外基質(zhì)的生成及重塑，且在生物相容性、生物降解及成軟骨分化(即軟骨誘導(dǎo)能力)方面具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

生長(zhǎng)因子可以調(diào)控軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成、代謝以及軟骨形成。生長(zhǎng)因子的緩釋是治療骨性關(guān)節(jié)炎中恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨功能的一個(gè)重要組成部分。在組織修復(fù)時(shí)必須考慮生物活性因子的類型，釋放的方法，時(shí)間和空間釋放所需達(dá)到的效果。而從促進(jìn)軟骨修復(fù)的生長(zhǎng)因子的研究現(xiàn)狀來看，多種生長(zhǎng)因子共同釋放難以完全超越單一生長(zhǎng)因子釋放的優(yōu)勢(shì)在于需要改進(jìn)生長(zhǎng)因子在促軟骨再生過程中隨時(shí)間變化的表達(dá)。人們開始認(rèn)識(shí)到，生長(zhǎng)因子在空間和時(shí)間的精確調(diào)控緩釋方式應(yīng)該可以引起更好的治療效果。

類似的利用乙酸-羥基乙酸共聚物(plga)微球不同共聚合物比例和微球直徑尺寸能夠達(dá)到多重突發(fā)釋放的方式已經(jīng)在硫酸軟骨素治療骨性關(guān)節(jié)炎中應(yīng)用。最近一項(xiàng)研究聯(lián)合類似聚丙烯腈預(yù)氧化纖維(opf)的復(fù)合材料，使用胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-likegrowthfactor，igf)中的igf-1和轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β3(transfrominggrowthfactorβ3，tgf-β3在骨軟骨缺損部位聯(lián)合釋放進(jìn)行組織修復(fù)，通過改變生長(zhǎng)因子釋放動(dòng)力學(xué)變化從而促進(jìn)骨軟骨缺損區(qū)的修復(fù)。先前的研究已經(jīng)證明軟骨細(xì)胞自身修復(fù)的能力，在損傷后的急性恢復(fù)其自身能夠增加內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的表達(dá)。初始階段細(xì)胞內(nèi)tgf-β1和igf-1增加表明自分泌和旁分泌的代謝的刺激，而后期通過持續(xù)增加tgf-β1的表達(dá)維持修復(fù)過程。這種釋放方式組合可以看作是一種軟骨修復(fù)控制下的生長(zhǎng)因子釋放策略。

聚磷腈是一種醫(yī)用合成高分子材料，具有很好的生物相容性，可在大范圍內(nèi)形成性能不同的共聚物藥物微球，可提高藥物的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)藥物控釋或緩釋，具有很好的操作性，且無毒副作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可緩釋生長(zhǎng)因子的軟骨組織工程修復(fù)支架及其制備方法。

第一方面，本發(fā)明提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架，包括：

多孔支架本體和附著在所述多孔支架上的包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球。

優(yōu)選地，所述多孔支架本體由生物天然材料制成。

更優(yōu)選地，所述生物天然材料包括：蠶絲蛋白、纖維蛋白、膠原蛋白、明膠、瓊脂糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸和殼聚糖中的至少一種。

優(yōu)選地，所述多孔支架本體為脫鈣骨基質(zhì)。

具體地，所述生長(zhǎng)因子為轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子中的至少一種。

優(yōu)選地，所述生長(zhǎng)因子為轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1和胰島素樣生長(zhǎng)因子。

優(yōu)選地，所述聚磷腈微球選自聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和/或聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。

優(yōu)選地，所述包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球?yàn)榘d有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。

更優(yōu)選地，所述包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球?yàn)榘d有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球和包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球。

具體地，所述包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的制備方法為：

先將聚磷腈分散于二氯甲烷中；

之后向含有聚磷腈的二氯甲烷中加入油性表面活性劑，以及含有生長(zhǎng)因子的水，形成初乳液，加入含有生長(zhǎng)因子的水的體積小于二氯甲烷的體積；

然后對(duì)所述初乳液進(jìn)行超聲處理；

再向超聲處理后的初乳液中加入穩(wěn)定劑、水性表面活性劑以及水，攪拌處理，直至二氯甲烷揮發(fā)殆盡，得到含有包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的懸浮液；

最后對(duì)所述懸浮液反復(fù)進(jìn)行洗滌和分離處理，之后冷凍干燥，得到包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球。

第二方面，本發(fā)明提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，所述制備方法包括：

將所述包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球和所述多孔支架本體置于磷酸緩沖液中預(yù)設(shè)時(shí)間，之后過濾處理，冷凍干燥，得到第一軟骨組織工程修復(fù)支架。

優(yōu)選地，所述制備方法還包括：

向所述第一軟骨組織工程修復(fù)支架內(nèi)注射含有包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的磷酸緩沖液，之后冷凍干燥，得到第二軟骨組織工程修復(fù)支架。

本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案的有益效果是：本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架中的多孔支架本體不但用于填充修補(bǔ)軟骨缺損區(qū)，還為包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球提供三維空間，使包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球滯留在軟骨缺損區(qū)，通過聚磷腈微球的降解，調(diào)控釋放其中的生長(zhǎng)因子，改變生長(zhǎng)因子釋放動(dòng)力學(xué)變化來促進(jìn)骨軟骨缺損區(qū)的修復(fù)。并且聚磷腈微球還具有生物相容性和降解無毒副作用。

附圖說明

圖1為實(shí)施例4制備的包載轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的掃描電鏡照片；

圖2為實(shí)施例4制備的包載轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的粒徑直方圖；

圖3為實(shí)施例5制備的包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球的掃描電鏡照片；

圖4為實(shí)施例5制備的包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球的粒徑直方圖；

圖5為實(shí)施例4制備的tgf-β1+pagp70微球釋放tgf-β1的動(dòng)力學(xué)曲線圖；

圖6為實(shí)施例5制備的igf-1+pagp30微球釋放igf-1的動(dòng)力學(xué)曲線圖；

圖7為實(shí)施例4和實(shí)施5分別制備的tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球降解的掃描電鏡照片；

圖8為實(shí)施例7制備的pagp70微球與細(xì)胞活性關(guān)系圖；

圖9為實(shí)施例8制備的pagp30微球與細(xì)胞活性關(guān)系圖；

圖10為實(shí)施例7和實(shí)施例8分別制備的pagp70微球和pagp30微球與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的激光共聚焦顯微照片；

圖11為實(shí)施例11制備的tgf-β1+pagp70微球支架和igf-1+pagp30微球支架的掃描電鏡圖；

圖12為實(shí)施例11制備的四種支架與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的掃描電鏡圖；

圖13為實(shí)施例11制備的四種支架修復(fù)的新西蘭兔的軟骨缺損的照片；

圖14-1至圖14-3為實(shí)施例11制備的四種支架修復(fù)的新西蘭大白兔的軟骨缺損的組織切片圖；

圖14-4為圖14-1至圖14-3中新西蘭大白兔的軟骨缺損的虛線框中的組織切片的局部放大圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供一種軟骨組織工程修復(fù)支架，包括：

多孔支架本體和附著在所述多孔支架上的包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球。

本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架中的多孔支架本體不但用于填充修補(bǔ)軟骨缺損區(qū)，還為包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球提供三維空間，使包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球滯留在軟骨缺損區(qū)，通過聚磷腈微球的降解，調(diào)控釋放其中的生長(zhǎng)因子，改變生長(zhǎng)因子釋放動(dòng)力學(xué)變化來促進(jìn)骨軟骨缺損區(qū)的修復(fù)。并且聚磷腈微球還具有生物相容性和降解無毒副作用。

本發(fā)明實(shí)施例中的多孔支架本體由生物天然材料制成，由生物天然材料制成的多孔支架本體不但生物相容性好，而且降解產(chǎn)物無毒副作用。生物天然材料包括：蠶絲蛋白、纖維蛋白、膠原蛋白、明膠、瓊脂糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸和殼聚糖中的至少一種，優(yōu)選為蠶絲蛋白、纖維蛋白或膠原蛋白與明膠的混合制成的多孔支架本體，通過調(diào)節(jié)蠶絲蛋白、纖維蛋白或膠原蛋白與明膠的質(zhì)量比，可以制作出不但機(jī)械強(qiáng)度高，而且降解速率與軟骨的再生速率相當(dāng)?shù)亩嗫字Ъ鼙倔w。

本發(fā)明實(shí)施例中的多孔支架本體也可以為脫鈣骨基質(zhì)。脫鈣骨基質(zhì)脫除了免疫原性，具有很好的生物相容性，而且機(jī)械強(qiáng)度高，并且孔隙率高，可為包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球提供更多的附著空間。

在本發(fā)明實(shí)施例中，生長(zhǎng)因子優(yōu)選為調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成、代謝以及軟骨形成的生長(zhǎng)因子，包括：轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子中的至少一種。生長(zhǎng)因子更優(yōu)選為轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1和胰島素樣生長(zhǎng)因子，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子包括：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1和胰島素樣生長(zhǎng)因子-2，優(yōu)選為胰島素樣生長(zhǎng)因子-1。轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1和胰島素樣生長(zhǎng)因子可以在軟骨修復(fù)的過程中，根據(jù)軟骨形成的不同階段，在時(shí)間上調(diào)控軟骨修復(fù)，并且可以根據(jù)軟骨形成的機(jī)制，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1和胰島素樣生長(zhǎng)因子的比例，通常二者的質(zhì)量比可以為1:10-1:3，優(yōu)選為1:5。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述聚磷腈微球選自聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和/或聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球相對(duì)于聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球具有較強(qiáng)的疏水性，聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球相對(duì)于聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球在體內(nèi)的降解速率慢，持續(xù)釋放生長(zhǎng)因子的時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)，使得在體內(nèi)包載在聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球中的生長(zhǎng)因子可以長(zhǎng)期地發(fā)揮促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)的作用。

甘氨酸乙酯與丙氨酸乙酯共取代制備聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]，其中0.1≤x≤0.4的方法如下：

(1)通過六氯環(huán)三磷腈單體在無水無氧條件下，220-280℃開環(huán)聚合48-192小時(shí)，制備平均分子量為10³-10⁵da、聚合度為50～5000的線性聚二氯磷腈。將線性聚二氯磷腈溶于干燥四氫呋喃中得溶液a，其中-pncl2-單元的濃度為0.01-0.25毫摩爾/毫升。

(2)將丙氨酸乙酯鹽酸鹽溶于干燥四氫呋喃中，溶液濃度為0.01-0.25毫摩爾/毫升，向其中加入三乙胺，丙氨酸乙酯鹽酸鹽與三乙胺的摩爾比為1:2，回流6小時(shí)后減壓抽濾，得溶液b。

(3)將甘氨酸乙酯鹽酸鹽溶于干燥四氫呋喃中，溶液濃度為0.01-0.25毫摩爾/毫升，向其中加入三乙胺，甘氨酸乙酯鹽酸鹽與三乙胺的摩爾比為1:2，回流6小時(shí)后減壓抽濾，得溶液c。

(4)將步驟(2)準(zhǔn)備的溶液b逐滴加入步驟(1)制備的溶液a，丙氨酸乙酯與-pncl2-單元的摩爾比為0.8:1-1.2:1，機(jī)械攪拌下，在35-60℃反應(yīng)12-48hr，得反應(yīng)混合物溶液d。

(5)將步驟(3)準(zhǔn)備的溶液c逐滴加入步驟(4)制備的溶液d，甘氨酸乙酯與-pncl2-單元的摩爾比為0.3:1-0.7:1，機(jī)械攪拌下，在35-60℃反應(yīng)12-48hr，得反應(yīng)混合物溶液e。

(8)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物溶液e過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除一部分四氫呋喃后得到粘稠狀液體，將此粘稠液體置于透析袋(截留分子量3500da)中，用四氫呋喃透析純化3天，每6-12小時(shí)更換一次溶劑。透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液自然揮發(fā)、真空干燥即得聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]，其中0.1≤x≤0.4。

制備聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]，其中0.6≤y≤0.9的方法與上述聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]，其中0.1≤x≤0.4的區(qū)別僅在于，在步驟(4)中甘氨酸乙酯與-pncl2-單元的摩爾比為0.1:1-0.5:1，在步驟(5)中甘氨酸乙酯與-pncl2-單元的摩爾比為1:1-1.4:1。即可制備成聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]，其中0.6≤y≤0.9。

將聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]，其中0.1≤x≤0.4，聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]，其中0.6≤y≤0.9，分別制備成聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4和聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.6≤y≤0.9的方法請(qǐng)參見實(shí)施例7和實(shí)施例8。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球優(yōu)選為包載有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。由于轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1可誘導(dǎo)充質(zhì)干細(xì)胞，持續(xù)作用于軟骨修復(fù)過程，而胰島素樣生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、刺激細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)及抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，在軟骨修復(fù)的前期發(fā)揮著重要的作用。因此，將轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1包載在降解速率相對(duì)緩慢的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球，形成包載有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，將胰島素樣生長(zhǎng)因子-1包載在降解相對(duì)快速的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球中，形成包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.6≤y≤0.9，在時(shí)間和空間精確控制轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的釋放，以達(dá)到更好的修復(fù)軟骨缺損的效果。

進(jìn)一步地，包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球?yàn)榘d有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球和包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球。包載有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球和包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球具有相對(duì)的疏水性和親水性，使二者在體內(nèi)表現(xiàn)出不同的降解速率，這樣的降解速率差異更符合轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1和胰島素樣生長(zhǎng)因子對(duì)軟骨的修復(fù)機(jī)制，從而更利于修復(fù)軟骨缺損。

本發(fā)明實(shí)施例中的包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球，可以通過以下制備方法制得：

先將聚磷腈分散于二氯甲烷中；

之后向含有聚磷腈的二氯甲烷中加入油性表面活性劑，以及含有生長(zhǎng)因子的水，形成初乳液，加入含有生長(zhǎng)因子的水的體積小于二氯甲烷的體積；

然后對(duì)所述初乳液進(jìn)行超聲處理；

再向超聲處理后的初乳液中加入穩(wěn)定劑、水性表面活性劑以及水，攪拌處理，直至二氯甲烷揮發(fā)殆盡，得到含有包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的懸浮液；

最后對(duì)所述懸浮液反復(fù)進(jìn)行洗滌和分離處理，之后冷凍干燥，得到包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球。

從上述的包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的制備過程中可以看出，生長(zhǎng)因子是在聚磷腈形成聚磷腈微球的過程中，同時(shí)包埋在聚磷腈微球中的，使聚磷腈微球作為生長(zhǎng)因子的載體，在其降解的過程中，將生長(zhǎng)因子緩慢釋放出來，促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)。

本發(fā)明實(shí)施例中的聚磷腈的分子式為：

其中，r1可以為氯、氨基酸酯，氨基酸酯，可以是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸的甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯和丁酯中的任意一種；

r2可以為氯、氨基酸酯，氨基酸酯，可以是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸的甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯和丁酯中的任意一種；

r1與r2可以相同也可以不同，r1與r2的摩爾比相加為1。

本發(fā)明實(shí)施例中所使用的生長(zhǎng)因子為如前文所提及的生長(zhǎng)因子，在此不作贅述。

下面對(duì)包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的制備過程進(jìn)行解釋說明。如下：

聚磷腈與二氯甲烷的比例可以為2％-5％(w/v)；

所使用的油性表面活性劑可以降低二氯甲烷的表面張力，油性表面活性劑具體可以為失水山梨醇單油酸酯溶液(俗稱司班80溶液)；

加入含有生長(zhǎng)因子的水，并且加入的體積小于二氯甲烷的體積，是為了使二氯甲烷包住水和其中的生長(zhǎng)因子，含有生長(zhǎng)因子的水團(tuán)聚成一個(gè)個(gè)小球；

對(duì)初乳液進(jìn)行超聲處理，超聲處理的目的是使形成的小球的粒徑比較均勻，超聲處理的功率可以為150-250w，超聲處理的時(shí)間可以為8-3min；

向超聲處理后的初乳液中加入穩(wěn)定劑、水性表面活性劑以及水，降低水表面的張力，形成外水向，即水包住二氯甲烷，穩(wěn)定劑可以為聚乙烯醇或明膠，水性表面活性劑可以為聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬酸酯(俗稱吐溫60)；

攪拌的速率可以為1000轉(zhuǎn)/min，待二氯甲烷揮發(fā)殆盡后可以停止攪拌，對(duì)所含有雜質(zhì)的包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球反復(fù)水洗，水洗次數(shù)可以為3至5次，將殘留在包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的試劑清除。

在本發(fā)明第二方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，所述制備方法包括：將所述包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球和所述多孔支架本體置于磷酸緩沖液中預(yù)設(shè)時(shí)間，之后過濾處理，冷凍干燥，得到第一軟骨組織工程修復(fù)支架。

在本發(fā)明實(shí)施例中，磷酸緩沖液(pbs)的ph值可以為6.8-7.4。此處所提及的預(yù)設(shè)時(shí)間可以為5分鐘以上，使包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球與多孔支架本體充分接觸，盡可能地使更多的包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球附著在多孔支架本體的孔隙中。

為了使多孔支架本體上附著更多的包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球，所述制備方法還包括：向所述第一軟骨組織工程修復(fù)支架內(nèi)注射含有包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的磷酸緩沖液，之后冷凍干燥，得到第二軟骨組織工程修復(fù)支架。

在實(shí)施的過程中，可以利用注射器吸取含有包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的磷酸緩沖液注射到多孔支架本體的孔隙中，增加多孔支架本體對(duì)包載有生長(zhǎng)因子的聚磷腈微球的負(fù)載量，更多的生長(zhǎng)因子更有利于軟骨的形成。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種甘氨酸乙酯與丙氨酸乙酯共取代聚膦腈的方法。該方法如下：

(1)通過六氯環(huán)三磷腈單體在無水無氧條件下，220-280℃開環(huán)聚合48-192小時(shí)，制備平均分子量為10³-10⁵da、聚合度為50～5000的線性聚二氯磷腈。將線性聚二氯磷腈溶于干燥四氫呋喃中得溶液a，其中-pncl2-單元的濃度為0.01-0.25毫摩爾/毫升。

(2)將丙氨酸乙酯鹽酸鹽溶于干燥四氫呋喃中，溶液濃度為0.01-0.25毫摩爾/毫升，向其中加入三乙胺，丙氨酸乙酯鹽酸鹽與三乙胺的摩爾比為1:2，回流6小時(shí)后減壓抽濾，得溶液b。

(3)將甘氨酸乙酯鹽酸鹽溶于干燥四氫呋喃中，溶液濃度為0.01-0.25毫摩爾/毫升，向其中加入三乙胺，甘氨酸乙酯鹽酸鹽與三乙胺的摩爾比為1:2，回流6小時(shí)后減壓抽濾，得溶液c。

(4)將步驟(2)準(zhǔn)備的溶液b逐滴加入步驟(1)制備的溶液a，丙氨酸乙酯與-pncl2-單元的摩爾比為1:1，機(jī)械攪拌下，在35-60℃反應(yīng)12-48hr，得反應(yīng)混合物溶液d。

(5)將步驟(3)準(zhǔn)備的溶液c逐滴加入步驟(4)制備的溶液d，甘氨酸乙酯與-pncl2-單元的摩爾比為0.5:1，機(jī)械攪拌下，在35-60℃反應(yīng)12-48hr，得反應(yīng)混合物溶液e。

(8)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物溶液e過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除一部分溶劑后得到粘稠狀液體，將此粘稠液體置于透析袋(截留分子量3500da)中，用四氫呋喃透析純化3天，每6-12小時(shí)更換一次溶劑。透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液自然揮發(fā)、真空干燥，即得聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，丙氨酸乙酯與-pncl2-單元的摩爾比為0.3:1，甘氨酸乙酯與-pncl2-單元的摩爾比為1.2:1，制得的產(chǎn)物為聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]。

實(shí)施例3

分別對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例2制得的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]和聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]進(jìn)行核磁共振(nuclearmagneticresonance，簡(jiǎn)稱nmr)檢測(cè)。將聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]和聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]分別溶解于氘代氯仿(cdcl3)中，結(jié)果如表1所示：

表1磷元素和氫元素核磁共振檢測(cè)

其中，pagp70代表聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]，pagp30代表聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]；gly代表甘氨酸乙酯，ala代表丙氨酸乙酯。

實(shí)施例4

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種雙乳液法制備包載有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的方法。方法如下：

稱取實(shí)施例1制得的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]0.6g溶于20ml二氯甲烷中，磁力攪拌以保證溶解完全；

然后加入2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的司班80溶液、2ml含有40微克/毫升轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1的去離子水，配制成初乳液；

將配制好的初乳液進(jìn)行超聲處理，超聲功率為200w，超聲時(shí)間為3min；

向超聲處理后的初乳液中加入200ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的聚乙烯醇溶液和2ml10％吐溫60溶液，攪拌1000轉(zhuǎn)/分，待二氯甲烷揮發(fā)4h后，停止攪拌，先用去去離子水洗滌、過濾后再離心，如此反復(fù)操作5遍，直至將殘留在包載有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1(tgf-β1)的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球中的聚乙烯醇清除掉，之后冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥36小時(shí)，得到如圖1所示的包載有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1(tgf-β1)的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球，記為tgf-β1+pagp70微球。

圖2為包載轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1(tgf-β1)的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的粒徑直方圖，由圖2可知，tgf-β1+pagp70微球的平均粒徑為54.22±19.19μm。

實(shí)施例5

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種雙乳液法制備包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球的方法。方法如下：

稱取實(shí)施例2制得的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]0.6g溶于20ml二氯甲烷中，磁力攪拌以保證溶解完全；

然后加入2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的司班80溶液、2ml含有200微克/毫升胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(igf-1)的去離子水，配制成初乳液；

將配制好的初乳液進(jìn)行超聲處理，超聲功率為200w，超聲時(shí)間為3min；

向超聲處理后的初乳液中加入200ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的聚乙烯醇溶液和2ml10％吐溫60溶液，攪拌1000轉(zhuǎn)/分，待二氯甲烷揮發(fā)4h后，停止攪拌，先用去去離子水洗滌、過濾后再離心，如此反復(fù)操作5遍，直至將殘留在包載有igf-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球中的聚乙烯醇清除掉，冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥36小時(shí)，得到如圖3所示的包載有igf-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球，記為igf-1+pagp30微球。

圖4為包載有胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球的粒徑直方圖，由圖4可知igf-1+pagp30微球的平均粒徑為34.11±18.82μm。

實(shí)施例6

分別對(duì)實(shí)施例4和實(shí)施例5制備的tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。

分別稱取5毫克tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球分別浸入1mlph值為7的磷酸緩沖溶液(pbs)中，并置于溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為40rpm的搖床中。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)(1，2，4，7，10，14，21，28，35和42天)，通過離心分離分別采集上清液后，再補(bǔ)充pbs對(duì)兩種微球進(jìn)行再懸浮。通過elisa檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定上清液中tgf-β1和igf-i的含量，結(jié)果分別如圖5和圖6所示。同時(shí)，通過掃描電鏡監(jiān)測(cè)兩種微球長(zhǎng)達(dá)90天的降解形態(tài)，結(jié)果如圖7所示。

由圖5的結(jié)果可知，tgf-β1+pagp70微球釋放tgf-β1主要有兩個(gè)的階段，在第1天，tgf-β1+pagp70微球累積釋放tgf-β1占其所包載的tgf-β1總量的33.09％±7.24％，隨后緩慢持續(xù)釋放，在第42天，tgf-β1+pagp70微球累積釋放tgf-β1占其所包載的tgf-β1總量的82.63％±5.08％。

由圖6的結(jié)果可知，在第1天igf-1+pagp30微球累積釋放igf-1為61.74％±8.57％，在第28天，igf-1+pagp30微球累積釋放igf-1為98.24％±1.43％，也就是說，igf-1+pagp30微球包載的igf-1幾乎釋放完畢。說明igf-1+pagp30微球釋放igf-1快于tgf-β1+pagp70微球釋放tgf-β1。

由圖7的結(jié)果可知，tgf-β1+pagp70微球的外表面較光滑，有許多不規(guī)則的孔，在15天內(nèi)的降解過程中，外形保持完整，在第30天形態(tài)發(fā)生變化，外表面出現(xiàn)較多的裂紋，孔徑也在變大；igf-1+pagp30微球相對(duì)于tgf-β1+pagp70微球具有粗糙的表面和更密集的孔，15天以后其表面粗糙度明顯增加，在第90天球形結(jié)構(gòu)完全破裂，其降解速率明顯快于tgf-β1+pagp70微球。

綜合圖5、圖6和圖7的結(jié)果可知，生長(zhǎng)因子的釋放動(dòng)力學(xué)與上述微球的降解速率正相關(guān)。igf-1+pagp30微球具有較快降解速率，因此，igf-1在其降解前期表現(xiàn)出火山噴發(fā)般地釋放，而tgf-β1+pagp70微球相對(duì)于igf-1+pagp30微球具有疏水性，因而降解速率相對(duì)較慢，可以緩慢地釋放tgf-β1。這樣的釋放方式與軟骨修復(fù)過程中對(duì)tgf-β1和igf-1的需要相符合，可以更好地促進(jìn)受損軟骨的修復(fù)。

通過tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球分別在制備過程中tgf-β1和igf-1的用量，以及在二者降解過程中tgf-β1和igf-1的釋放量，分別計(jì)算這兩種微球中tgf-β1和igf-1的加載量，結(jié)果為tgf-β1+pagp70微球中tgf-β1的加載量為90.34納克/毫克，igf-1+pagp30微球中igf的加載量為569.57納克/毫克。

實(shí)施例7

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種雙乳液法制備聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的方法。

實(shí)施例7與實(shí)施例4的區(qū)別僅在于實(shí)施例7中去離子水不含有轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1，從而制成了聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球，記為pagp70微球。

實(shí)施例8

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種雙乳液法制備聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球。

實(shí)施例8與實(shí)施例5的區(qū)別僅在于實(shí)施例8中的去離子水不含有胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，從而制成了聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球，記為pagp30微球。

實(shí)施例9

測(cè)定實(shí)施例7制備的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球和實(shí)施例8制備的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球?qū)?xì)胞毒性和與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的的生物相容性。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bmscs)源自于六周大的spragueedawley(sd)大鼠，并經(jīng)過兩次繼代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

繼代培養(yǎng)的具體操作為：

將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在α-dmem培養(yǎng)基含10％(v/v)血清和誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(rasmx-90041；賽業(yè)生物公司、森尼維耳、ca、美國(guó))于37℃5％濃度的co2條件下孵育。

細(xì)胞活性檢測(cè)：

于96孔中每個(gè)孔接種5×10³個(gè)bmscs，分為pagp70微球組和pagp30微球組，其中兩組中的各自微球的濃度梯度均為0.125、0.25、0.5、1.0和2.0mg/ml，并且分別在孵育第1天、第3天和第5天加入10μlcck-8(dojindo美國(guó))和200μlα-dmem培養(yǎng)基，利用的酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，結(jié)果如圖8和圖9所示：采用cck-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，隨著pagp70微球和pagp30微球用量增加，pagp70微球組和pagp30微球組的細(xì)胞存活率均略有下降，5天培養(yǎng)后這兩組的細(xì)胞存活率均在70％以上。此結(jié)果證明，本發(fā)明實(shí)施例中的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9，不會(huì)增加bmscs細(xì)胞毒性反應(yīng)，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，2毫克/毫升以下濃度為安全濃度。

生物相容性檢測(cè)：

6×10⁵個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bmscs)分別與2毫克pagp70微球和pagp30微球接種在激光共聚焦小皿內(nèi)單層共培養(yǎng)24h，與羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色(160nm；細(xì)胞骨架的公司，丹佛、co、美國(guó))1小時(shí)37℃、復(fù)染用hoechst33258(1:800；西格瑪，圣路易斯，穆村，美國(guó))，在激光共聚焦顯微鏡(sp2倒置顯微鏡；徠卡，曼海姆，德國(guó))下觀察，結(jié)果如圖10所示：pagp70微球和pagp30微球的多孔的表面適合細(xì)胞粘附。也就是說，本發(fā)明實(shí)施例中的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9生物相容性好。

實(shí)施例10

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，該制備方法如下：

將股骨上附著的肌肉、筋膜、脂肪等軟組織剔去，僅保留骨性成分。修整的股骨進(jìn)行切割，選取骨骺端，利用生理鹽水沖洗殘留的骨髓3次。將沖洗后的骨骺切割成4×4×2cm³大小的骨塊，懸浸于脫脂液(甲醇∶氯仿＝1:1v/v)內(nèi)，進(jìn)行脫脂處理48小時(shí)；

脫鈣液配制：用去離子水配制0.5m乙二胺四乙酸脫鈣液，控制其ph＝8.3，脫鈣液保存及脫鈣過程均在4℃下用塑料容器盛載(避免玻璃容器)；

生理鹽水沖洗脫脂后骨塊，浸泡于脫鈣液中，脫鈣液每日更換。脫鈣完全度檢測(cè)：每日換下的脫鈣液用原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)鈣離子濃度以監(jiān)測(cè)脫鈣進(jìn)程，當(dāng)脫鈣液中的鈣(ca)螯合物濃度<0.5g/l，即為完全脫鈣，得到脫鈣骨基質(zhì)。

實(shí)施例11

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，該制備方法如下：

分別將磷酸緩沖液，含有2mg/ml的tgf-β1+pagp70微球的磷酸緩沖液、含有2mg/ml的igf-1+pagp30微球的磷酸緩沖液，以及含有1mg/ml的tgf-β1+pagp70微球和1mg/ml的igf-1+pagp30微球的磷酸緩沖液，其中磷酸緩沖液的ph值均為7.4，滴加到脫鈣骨基質(zhì)上，并冷凍干燥，從而制備出脫鈣骨基質(zhì)支架、tgf-β1+pagp70微球支架、igf-1+pagp30微球支架、以及tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架。tgf-β1+pagp70微球支架、igf-1+pagp30微球支架的掃描電鏡圖如圖11所示，表明包載有tgf-β1的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4可粘附在脫鈣骨基質(zhì)上，包載有igf-1的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.6≤y≤0.9可粘附在脫鈣骨基質(zhì)上，軟骨組織工程修復(fù)支架制備成功。

對(duì)上述這四種支架在含有1×10⁶個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bmscs)的懸浮液培養(yǎng)三天后，添加鈣黃綠和乙二聚體試劑(invitrogen公司、美國(guó))30分鐘后利用tcs-sp8共焦顯微鏡分別在488nm和568nm的激發(fā)光下觀察四種支架上細(xì)胞的整體分布情況，并從不同的層面得到的三維結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果如圖12所示，其中，綠色熒光表明活細(xì)胞，而紅色熒光表明死細(xì)胞；每個(gè)區(qū)域的總體積為1740×1740×240μm³(x，y，z軸)。可見，脫鈣骨基質(zhì)支架的綠色熒光最少，說明其上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附和存活的少，而tgf-β1+pagp70微球支架、igf-1+pagp30微球支架、以及tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架上的綠色熒光較多，說明這三種支架可有效地支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附和增殖。

實(shí)施例12

本發(fā)明實(shí)施例提供了對(duì)實(shí)施例11制備的四種支架進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨缺損重建實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下：

36只新西蘭大白兔，體重2.5～3.0kg，隨機(jī)分為四組，即脫鈣骨基質(zhì)支架組、tgf-β1+pagp70微球支架組、igf-1+pagp30微球支架組、以及tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架組。在兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髕旁行縱向切口切開關(guān)節(jié)囊，髕骨外翻后顯露膝關(guān)節(jié)。在兔股骨滑車溝區(qū)使用角膜環(huán)鉆制造軟骨缺損(直徑為4毫米，深度3毫米)，利用微骨折技術(shù)釋放缺損區(qū)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后分別填充上述四種支架。分別在術(shù)后6周，12周和24周，對(duì)組織修復(fù)進(jìn)行大體觀察，結(jié)果如圖13所示，術(shù)后6周時(shí)脫鈣骨基質(zhì)支架組的軟骨缺損未有效填補(bǔ)，缺損仍很明顯。而在tgf-β1+pagp70微球支架組、igf-1+pagp30微球支架組、以及tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架組雖然軟骨缺損仍然存在，但其表面均覆蓋有白色半透明再生組織。隨著時(shí)間的推移，12周時(shí)脫鈣骨基質(zhì)支架缺損區(qū)中心部仍存在，而tgf-β1+pagp70微球支架組、igf-1+pagp30微球支架組、以及tgf-β1+pagp70微球聯(lián)合igf-1+pagp30微球支架組修復(fù)的再生組織光滑并且與周圍正常軟骨有明顯的連接。第24周時(shí)，tgf-β1+pagp70微球支架組、igf-1+pagp30微球支架組、以及tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架組均有一個(gè)模糊的邊界，再生軟骨組織的表面類似于相鄰的正常軟骨，由此可以看出，tgf-β1+pagp70微球支架、igf-1+pagp30微球支架、以及tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架對(duì)受損軟骨的修復(fù)效果均優(yōu)于脫鈣骨基質(zhì)支架，并且tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架對(duì)受損軟骨的修復(fù)效果最好。

分別對(duì)術(shù)后6，12周和24周的軟骨缺損進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。新西蘭大白兔的股骨遠(yuǎn)端置于4％多聚甲醛溶液中固定48小時(shí)，再置于實(shí)施例10提及的脫鈣液中7天，通過脫水，石蠟包埋，制成切片，進(jìn)行h&e染色、番紅-o染色和ii型膠原免疫組化染色，其結(jié)果分別如圖14-1至14-3所示。在術(shù)后6周，軟骨缺損組織修復(fù)如圖14-1所示，在脫鈣骨基質(zhì)支架組軟骨缺損區(qū)的邊緣仍存在間隙，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)粘多糖(gag)紅染在番紅-o染色中并未發(fā)現(xiàn)新生組織，而在其他三組均可見新生組織填塞缺損區(qū)。經(jīng)過12周的愈合，如圖14-2所示，h&e染色觀察軟骨下骨再生結(jié)構(gòu)，其他三組明顯比脫鈣骨基質(zhì)支架組新生骨組織多，并且微球支架組均有明顯的軟骨下骨橋連接，這在tgf-β1-pagp70微球組以及tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架組更為明顯，說明包載有生長(zhǎng)因子的支架更有利于促進(jìn)軟骨下骨新生骨組織修復(fù)，并且二型膠原免疫組化染色提示含有微球的支架組中新生軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)中二型膠原含量更高。如圖14-3所示在24周，脫鈣骨基質(zhì)支架組的缺損區(qū)填充一層薄薄的纖維軟骨，并且新生軟骨表層多出現(xiàn)無軟骨細(xì)胞區(qū)域，tgf-β1-pagp70微球組以及tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架組中的缺損區(qū)的修復(fù)組織表現(xiàn)為均勻的番紅-o紅染新生軟骨，新生軟骨組織中g(shù)ag含量明顯較脫鈣骨基質(zhì)支架組的高。

圖14-4對(duì)番紅-o染色切片的再生修復(fù)組織邊緣進(jìn)行高倍圖像采集(n代表缺損區(qū)邊緣的正常軟骨；r代表缺損區(qū)的新生軟骨組織)，在第6周時(shí)，脫鈣骨基質(zhì)支架組的正常軟骨與再生軟骨之間仍存在裂隙，而其他三組的再生軟骨和正常軟骨區(qū)整合度比脫鈣骨基質(zhì)支架組高。在12周時(shí)，脫鈣骨基質(zhì)支架組的新生軟骨組織和正常區(qū)軟骨組織仍然存在結(jié)構(gòu)上的差異，番紅-o染色為綠染，而其他三組的再生骨組織可見清晰的軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且細(xì)胞外基質(zhì)染色為紅染，表明軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中粘多糖含量明顯增多，這對(duì)新生軟骨組織的抗壓縮能力及軟骨細(xì)胞微環(huán)境的建立均有明顯促進(jìn)作用。最后在24周時(shí)其他三組新生軟骨組織和周圍正常軟骨組織結(jié)構(gòu)更為相似，這其中tgf-β1+pagp70微球和tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架組表現(xiàn)出更佳的新生軟骨組織完整性，尤其是tgf-β1+pagp70微球和igf-1+pagp30微球支架組。

由上述實(shí)施例可知，本發(fā)明提供的軟骨組織工程修復(fù)支架能夠明顯促進(jìn)骨軟骨缺損的修復(fù)速度和軟骨再生效果，能夠在一期手術(shù)治療中同時(shí)發(fā)揮生長(zhǎng)因子時(shí)空緩釋刺激促進(jìn)軟骨組織修復(fù)，可為組織工程提供新的思路，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

以上所述僅是為了便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解本發(fā)明的技術(shù)方案，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。