本發(fā)明涉及納米復(fù)合材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種通過(guò)將短鏈淀粉與胰島素或者短鏈淀粉與胰島素、原花青素混合制備納米復(fù)合物的方法。

背景技術(shù)：

胰島素制劑皮下注射是目前用于糖尿病治療的主要手段，具有更快的降血糖效果和更高的藥物利用度，但由于藥物釋放較快，需要頻繁注射給藥，增加了病人的身體和心理負(fù)擔(dān)。注射給藥這種方式與正常生理狀態(tài)下體內(nèi)的胰島素的分泌也存在著較大的差異；胰島素經(jīng)注射給藥后直接進(jìn)入人體循環(huán)；在正常生理?xiàng)l件下，胰島分泌的胰島素先進(jìn)入肝門靜脈系統(tǒng)，大部分為肝臟攝取，胰島素以口服途徑給藥最接近正常生理狀態(tài)下的分泌模式，因此，無(wú)論從服用的方便程度上，還是從代謝的模式上看，口服都是胰島素最為理想的給藥方式。納米技術(shù)的快速發(fā)展為胰島素口服給藥開辟了新的途徑。以納米顆粒作為藥物載體，可有效地保護(hù)胰島素免受胃酸及胃腸道酶的降解，增加其黏膜吸收；還可以有效地穿過(guò)小腸peyer's結(jié)，經(jīng)淋巴循環(huán)進(jìn)入血液循環(huán)，同時(shí)還具有控制釋放和體內(nèi)靶向分布等特點(diǎn)。在眾多用于制備納米粒的天然大分子中，淀粉是一類重要的具有生物可降解性、可再生、良好生物相容性的天然多糖類高分子材料，來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，廣泛地應(yīng)用于各種藥物的納米粒制劑中，是一種理想的載體材料。

天然產(chǎn)物多酚因具有良好的生物兼容性和諸多生理學(xué)功能，如抗氧化、抗粉樣纖維、抗癌和抑菌等活性，一直是生命領(lǐng)域研究的重要對(duì)象之一。原花青素在抗氧化、清除體內(nèi)自由基、免疫調(diào)節(jié)、治療炎癥以及預(yù)防心腦血管、癌癥和神經(jīng)退行性等重大疾病方面均發(fā)揮了重要作用，因此被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、生物醫(yī)藥、衛(wèi)生保健、日用化工等領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明申請(qǐng)人提供了一種短直鏈淀粉-胰島素或短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明短直鏈淀粉-胰島素或短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物粒徑較小，可以緊密的粘附在小腸的膜粘附層，延長(zhǎng)在胃腸帶停留時(shí)間，同時(shí)可以克服消化道系統(tǒng)中存在的粘液層屏障、酶屏障及上皮屏障，提高口服胰島素的生物利用率。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物通過(guò)如下步驟制得：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為10-25％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100-500u/ml的普魯蘭酶，酶解6-12h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取短直鏈淀粉加入到去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫待用，制得質(zhì)量濃度為1-10％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取胰島素粉末用ph＝2的鹽酸溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度為1‰-1％的胰島素溶液；

(4)制備短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物：將步驟(3)制得的胰島素溶液逐滴加入到步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理12～48h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物。

步驟(4)中所述胰島素溶液與短直鏈淀粉溶液的體積比為1:8。

步驟(4)中所述凍干的條件為真空度為1pa，冷阱溫度為-82℃，干燥至樣品最終含水量為5-7％。

一種短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的制備方法，所述方法將短鏈淀粉、胰島素與原花青素復(fù)合，具體制備過(guò)程為：將質(zhì)量濃度為1‰-1％的胰島素溶液和質(zhì)量濃度為1‰-1％的原花青素溶液同時(shí)分別逐滴加入到質(zhì)量濃度為1％-10％的胰島素溶液中攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理12～48h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物。

所述原花青素溶液的制備過(guò)程為：將原花青素加入到去離子水中，制得質(zhì)量濃度為1‰-1％的原花青素溶液。

本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：

本發(fā)明采用生物酶法制備短直鏈淀粉，短直鏈淀粉含有大量的-oh，胰島素含有nh2，原花青素可以作為交聯(lián)劑跟穩(wěn)定劑，抑制胰島素本身的聚集，利用短直鏈自組裝并結(jié)合二者之間或者三者之間的相互作用，制得所述納米復(fù)合物。制備得到的納米復(fù)合物粒徑較小，可以緊密的粘附在小腸的膜粘附層，延長(zhǎng)在胃腸帶停留時(shí)間，同時(shí)可以克服消化道系統(tǒng)中存在的粘液層屏障、酶屏障及上皮屏障，提高口服胰島素的生物利用率。制備得到的納米復(fù)合物，具有包埋率高，成本低，降血糖作用明顯等特性，有效提高了口服胰島素的生物利用度，而且口服納米復(fù)合物在胃腸道環(huán)境中具有明顯的緩釋功效。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1、2所得納米復(fù)合物的透射電鏡和粒徑圖；

圖2本發(fā)明實(shí)施例所用短直鏈淀粉與胰島素兩者或短直鏈淀粉、原花青素和胰島素三者相互作用的熒光圖譜；

圖3本發(fā)明實(shí)施例所用短直鏈淀粉與胰島素兩者或短直鏈淀粉、原花青素和胰島素三者相互作用的同步熒光圖譜；

圖4短直鏈淀粉與胰島素兩者或短直鏈淀粉、原花青素和胰島素三者相互作用的共振光散射圖譜；

圖5為實(shí)施例1、3、5、7所得短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物的x衍射圖和實(shí)施例2、4、6、8所得短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的x衍射圖；

圖6為實(shí)施例1、3、5、7所得納米復(fù)合物中短直鏈淀粉對(duì)胰島素的包埋率；和實(shí)施例2、4、6、8所得納米復(fù)合物中短直鏈淀粉和原花青素對(duì)胰島素的包埋率；

圖7為實(shí)施例1、2所得納米復(fù)合物體內(nèi)降血糖效果曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實(shí)施例1

一種短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物通過(guò)如下步驟制得：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為1％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.01g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1‰的胰島素溶液；

(4)制備短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理48h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物。本發(fā)明實(shí)施例所得納米復(fù)合物的透射電鏡圖和粒徑圖分別如圖1a、c所示；所得納米復(fù)合物體內(nèi)降血糖效果曲線如圖7所示；所得納米復(fù)合物動(dòng)物體內(nèi)生物利用率如表1所示。

實(shí)施例2

一種短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述制備方法包括如下步驟：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為1％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.01g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1‰的胰島素溶液；

(4)制備原花青素溶液：稱取0.01g的原花青素粉末用10ml的去離子水溶解，配制成1‰的原花青素溶液；

(5)制備短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液、5ml步驟(4)制得的原花青素溶液同時(shí)逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理48h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物。本發(fā)明實(shí)施例所得納米復(fù)合物的透射電鏡圖和粒徑圖分別如圖1b、d所示；所得納米復(fù)合物體內(nèi)降血糖效果曲線如圖7所示；所得納米復(fù)合物動(dòng)物體內(nèi)生物利用率如表1所示。

實(shí)施例3

一種短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物通過(guò)如下步驟制得：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為1％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.01g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1‰的胰島素溶液；

(4)制備短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理36h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物。本發(fā)明實(shí)施例所得納米復(fù)合物的x衍射圖如圖5a所示。

實(shí)施例4

一種短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述制備方法包括如下步驟：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為1％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.01g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1‰的胰島素溶液；

(4)制備原花青素溶液：稱取0.01g的原花青素粉末用10ml的去離子水溶解，配制成1‰的原花青素溶液；

(5)制備短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液、5ml步驟(4)制得的原花青素溶液同時(shí)逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理36h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物。本發(fā)明實(shí)施例所得納米復(fù)合物的x衍射圖如圖5b所示。

實(shí)施例5

一種短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物通過(guò)如下步驟制得：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為1％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.01g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1‰的胰島素溶液；

(4)制備短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理24h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物。本發(fā)明實(shí)施例所得納米復(fù)合物的x-衍射圖如圖5a所示。

實(shí)施例6

一種短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述制備方法包括如下步驟：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為1％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.01g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1‰的胰島素溶液；

(4)制備原花青素溶液：稱取0.01g的原花青素粉末用10ml的去離子水溶解，配制成1‰的原花青素溶液；

(5)制備短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液、5ml步驟(4)制得的原花青素溶液同時(shí)逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理24h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物。本發(fā)明實(shí)施例所得納米復(fù)合物的x衍射圖如圖5b所示。

實(shí)施例7

一種短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物通過(guò)如下步驟制得：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為1％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.01g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1‰的胰島素溶液；

(4)制備短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理12h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物。本發(fā)明實(shí)施例所得納米復(fù)合物的x衍射圖如圖5a所示。

實(shí)施例8

一種短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述制備方法包括如下步驟：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為1％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.01g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1‰的胰島素溶液；

(4)制備原花青素溶液：稱取0.01g的原花青素粉末用10ml的去離子水溶解，配制成1‰的原花青素溶液；

(5)制備短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液、5ml步驟(4)制得的原花青素溶液同時(shí)逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理12h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物。發(fā)明實(shí)施例所得納米復(fù)合物的x衍射圖如圖5b所示。

實(shí)施例9

一種短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物通過(guò)如下步驟制得：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.5g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為5％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.1g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1％的胰島素溶液；

(4)制備短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理12h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物。

實(shí)施例10

一種短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述制備方法包括如下步驟：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取0.5g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為5％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.1g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成1％的胰島素溶液；

(4)制備原花青素溶液：稱取0.1g的原花青素粉末用10ml的去離子水溶解，配制成1％的原花青素溶液；

(5)制備短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液、5ml步驟(4)制得的原花青素溶液同時(shí)逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理12h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物。

實(shí)施例11

一種短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物通過(guò)如下步驟制得：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為10％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.05g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成0.5％的胰島素溶液；

(4)制備短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理48h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物。

實(shí)施例12

一種短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述制備方法包括如下步驟：

(1)制備短直鏈淀粉：配制質(zhì)量百分比為15％的蠟質(zhì)玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，隨后降溫至58℃，向其中加入100u/ml的普魯蘭酶，酶解6h，離心，滅酶，凍干得短直鏈淀粉；

(2)制備短直鏈淀粉溶液：稱取1g步驟(1)制得的短直鏈淀粉加入到10ml去離子水中，超聲5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室溫，制得質(zhì)量濃度為10％的短直鏈淀粉溶液；

(3)制備胰島素溶液：稱取0.05g胰島素粉末用10mlph＝2的鹽酸溶解，配制成0.5％的胰島素溶液；

(4)制備原花青素溶液：稱取0.05g的原花青素粉末用10ml的去離子水溶解，配制成0.5％的原花青素溶液；

(5)制備短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物：將5ml步驟(3)制得的胰島素溶液、5ml步驟(4)制得的原花青素溶液同時(shí)逐滴加入到40ml步驟(2)制得的短直鏈淀粉溶液中，攪拌1h，在室溫下使其充分反應(yīng)，然后將其放置4℃冰箱下回生處理48h，離心得到沉淀，將沉淀凍干即得短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物。

測(cè)試?yán)?/p>

1、tem

將本發(fā)明實(shí)施例1、2制得的納米復(fù)合物分散在水中，用碳膜蘸一滴納米復(fù)合物的懸浮液，真空冷凍干燥，然后用于透射電鏡觀察，透射電鏡圖分別如圖1a、圖1b所示；粒徑圖如圖1c、圖1d所示。

從圖1a、c可以看出，用短直鏈淀粉包埋胰島素形成的短直鏈-胰島素復(fù)合物的粒徑基本分布在60-200nm之間，納米復(fù)合物呈球形且分布比較均勻，不聚集；由圖1b、d可以看出短直鏈淀粉-胰島素-原花青素形成的納米顆粒是球形的，且有聚集的情況，這主要是由于原花青素起到了交聯(lián)劑的作用。

2、熒光圖譜

使用光程路徑1cm，體積3.0ml石英池，胰島素濃度固定在1mg/ml，向其中滴加濃度為0，2，4，6，8，10的短直鏈淀粉，等體積混合5分鐘后在25℃條件下測(cè)量胰島素?zé)晒夤庾V；固定胰島素濃度1mg/ml，短直鏈淀粉濃度10mg/ml，向其中滴加濃度為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1mg/ml的原花青素，激發(fā)波長(zhǎng)為278nm，掃描范圍是300-450nm，激發(fā)和發(fā)射帶寬均為5.0nm，并記錄掃描數(shù)據(jù)。所得熒光圖譜如圖2所示。

由圖2可以看出，隨著體系中短直鏈淀粉濃度逐漸增加，短直鏈-胰島素復(fù)合物峰強(qiáng)逐漸降低；當(dāng)在短直鏈-胰島素復(fù)合物中添加原花青素時(shí)，復(fù)合物峰強(qiáng)逐漸降低，并出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象，表明胰島素不僅能與短直鏈發(fā)生相互作用形成復(fù)合物，而且能與原花青素和短直鏈淀粉形成二元復(fù)合物。

3、同步熒光圖譜

同步熒光光譜是分別固定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)間距為δλ＝30同步掃描激發(fā)和發(fā)射光譜所得。

由圖3可以看出，隨著體系中短直鏈淀粉濃度逐漸增加，峰強(qiáng)度逐漸降低，且峰的位置發(fā)生紅移，表面酪氨酸所處的微環(huán)境發(fā)生改變，說(shuō)明短直鏈淀粉、原花青素、胰島素能在混合的過(guò)程中發(fā)生相互作用形成納米復(fù)合物。

4、共振光散射圖譜

共振光散射光譜是在220～800nm范圍內(nèi)以λex＝λem(即δλ＝0)方式進(jìn)行同步掃描所得。

由圖4可以看出，隨著體系中短直鏈淀粉濃度增加，體系共振光強(qiáng)度逐漸增加，說(shuō)明短直鏈淀粉、胰島素能在混合的過(guò)程中形成復(fù)合物，并且隨著短直鏈淀粉濃度的增大，胰島素與短直鏈之間的結(jié)合越來(lái)越多。隨著體系中原花青素濃度增加，體系共振光強(qiáng)度峰逐漸增加，說(shuō)明短直鏈淀粉、原花青素、胰島素能在混合的過(guò)程中形成二元復(fù)合物。

5、x衍射光譜

將本發(fā)明實(shí)施例1-8制得的納米復(fù)合物用x射線衍射儀檢測(cè)，測(cè)試條件為：特征射線cu-kα，石墨單色器，管壓為40.0kv，電流100ma，掃描速率為1°/min，測(cè)量角度2θ＝4–40°，步寬為0.02°，發(fā)射狹峰為1°，防發(fā)射狹峰為1°，接收狹峰為0.3mm。測(cè)試結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，胰島素在2θ<20°的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出許多結(jié)晶峰，表明胰島素為有晶體和無(wú)定形的混合物，在復(fù)合物的衍射圖譜中，胰島素的晶體衍射峰幾乎完全消失，這表明在形成復(fù)合物過(guò)程中，可能處于一種高度分散的無(wú)定形狀態(tài)，胰島素自身的晶體特征被抑制，證明了短直鏈淀粉-胰島素/短直鏈淀粉-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的形成。隨著回生時(shí)間的增加，納米復(fù)合物的x-衍射峰逐漸增加，說(shuō)明納米復(fù)合物的結(jié)晶度增加，這可能是由于延長(zhǎng)了回生時(shí)間，淀粉鏈在回生過(guò)程中重組更加完善。

6、包埋率

將本發(fā)明實(shí)施例1-8所得的納米復(fù)合物于12000rpm/min離心30min，收集上清液，利用考馬斯亮藍(lán)法在595nm測(cè)定溶液吸光值a595，根據(jù)標(biāo)曲測(cè)得上清中胰島素含量，測(cè)試結(jié)果如圖6所示。

由圖6可以看出，隨著短直鏈的回生，短直鏈淀粉-胰島素的最大包埋率是50.9％，短直鏈淀粉-胰島素-原花青素的最大包埋率是70.2％。

7、體內(nèi)降血糖效果

取禁食24h的雄性健康大鼠數(shù)十只，按40mg/kg劑量尾靜脈注射3％(w/v)四氧嘧啶溶液，正常飼養(yǎng)72h后禁食，尾靜脈取血0.2ml，血液凝固后，12,000rpm離心4min。取血清20μl，葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖值，血糖值高于16.67mmol/l的為高血糖模型大鼠。

糖尿病大鼠12只，分為三組，每組4只，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，可自由飲水，稱重，灌胃給藥。第一組注射5iu/kg的胰島素，第二組和第三組分別給予實(shí)施例1短直鏈-胰島素復(fù)合物(100iu/kg)和實(shí)施例2短直鏈-胰島素-原花青素(100iu/kg)的混懸液，于0h，0.5h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h尾靜脈取血0.2ml，血液凝固后，12000rpm離心4min，精密量取血清20μl，葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖值。測(cè)試結(jié)果分別如圖7、表1所示。

由圖7和表1可看出，相對(duì)于注射胰島素溶液，短直鏈淀粉-胰島素納米復(fù)合物的生物利用率能夠達(dá)到4.59％，短直鏈-胰島素-原花青素納米復(fù)合物的生物利用率能夠達(dá)到6.98％。

表1

注：aac0→8h表示0至8h時(shí)間內(nèi)經(jīng)計(jì)算得到血糖曲線上面積。