本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一，惡性程度很高，死亡率占婦科腫瘤的首位。由于卵巢癌在早期癥狀往往不明顯，不易早期發(fā)現(xiàn)，超過70％的患者就診時(shí)已為中晚期，5年生存率僅為25％。目前對(duì)卵巢癌的早期診斷尚缺乏特異有效的方法或手段。卵巢癌的治療目前主要以手術(shù)治療后輔以化療，但是常規(guī)化療副作用較大，且手術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高。因此，探索卵巢癌新型高效的早期診斷手段和治療方法意義重大。將多種手段有機(jī)結(jié)合對(duì)卵巢癌進(jìn)行聯(lián)合靶向診療已成為重要的研究方向。腫瘤熱療是通過熱能殺死腫瘤細(xì)胞，不僅可以獨(dú)立應(yīng)用，還可以增強(qiáng)放化療的敏感性。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，將納米技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的治療也日益受到關(guān)注。若能以磁性納米材料為載體，將化療、熱療有機(jī)結(jié)合，互補(bǔ)協(xié)同，有可能形成一種新的腫瘤聯(lián)合治療方法。

磁性納米顆粒作為納米材料的一種，除了具有一般納米載體的功能外，由于其具有特殊的磁學(xué)性質(zhì)，可被應(yīng)用于磁共振成像。磁性納米材料在外加磁場(chǎng)的作用下產(chǎn)生和周圍組織不同的磁場(chǎng)敏感性，使t1和t2磁共振成像的弛豫時(shí)間發(fā)生變化。磁性納米顆粒在交變磁場(chǎng)的作用下能夠產(chǎn)生熱效應(yīng)，熱能不僅能增加化療藥物的功能，還可以對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向熱療。其中金屬氧化物顆粒fe3o4是應(yīng)用較多的磁性納米粒子。在納米氧化鐵結(jié)構(gòu)中加入錳、鋅等金屬元素可以制備成各種鐵氧體，其中mn0.6zn0.4fe2o4不僅具有載體、熱療的功能，還具有自動(dòng)控溫和恒溫的特征。

化療是臨床上最常用的腫瘤治療手段，但是絕大多數(shù)的化療藥物都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，而且化療主要對(duì)增殖期細(xì)胞有效，單一化療很難將腫瘤徹底治愈。順鉑(ddp)已成為臨床最常用的化療藥物之一，可抑制癌細(xì)胞的dna復(fù)制，并損傷其細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用，尤其是在卵巢癌的治療中顯示了較好的療效。但目前臨床上所用的順鉑是靜脈注射，靜脈給藥后，由于血漿ddp濃度很快升高并迅速彌散至周圍組織，可使病人出現(xiàn)食欲減退、惡心、嘔吐、腹瀉等消化道癥狀和骨髓抑制、腎臟毒性、神經(jīng)毒性、過敏反應(yīng)等毒副作用。因此，改變化療藥物的給藥方式及劑型具有重要的臨床意義。對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向給藥，不僅能有效殺死腫瘤細(xì)胞，而且能大大降低化療藥物的用藥量，減輕其毒副作用。

基于單純磁流體熱療、順鉑化療在腫瘤治療研究方面都顯示了良好的效果，前景廣泛，但作用仍顯單一，在腫瘤聯(lián)合治療原則的指導(dǎo)下，本研究設(shè)想：以mn0.6zn0.4fe2o4納米粒作為藥物載體，利用其優(yōu)良的磁響應(yīng)性和有效升溫控溫的效果，將ddp化療、磁流體熱療有機(jī)結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有可能形成一種聯(lián)合靶向診療卵巢癌的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有卵巢癌治療中存在的問題，本發(fā)明提供一種以peg修飾的mn0.6zn0.4fe2o4納米粒(peg-mzf-nps)為載體的攜載ddp化療藥物的復(fù)合物及其制備方法，該復(fù)合物在外加磁場(chǎng)作用下，可以將ddp化療與磁流體熱療有機(jī)結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向治療，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)的問題。

一種peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物，是以peg-mzf-nps為載體，負(fù)載ddp；peg-mzf-nps與ddp質(zhì)量比為40:1-80:1。

本發(fā)明還公開了所述peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：取一定量的peg-mzf-nps磁流體與適量的ddp溶液混合，加入蒸餾水，超聲分散15min，使其充分反應(yīng)，過濾，濾液即為peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物，將其置于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步地，peg-mzf-nps與ddp質(zhì)量比優(yōu)選40:1-80:1，加入蒸餾水后peg-mzf-nps終濃度為60μg/ml。

本發(fā)明還公開了該復(fù)合物在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明用不同方法對(duì)卵巢癌ho8910細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)分為四組,分別為：陰性對(duì)照組；ddp組；peg-mzf-nps/mfh組；peg-mzf-nps/ddp/mfh組；分別計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率。結(jié)果顯示peg-mzf-nps/ddp/mfh組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均明顯高于其余三組。ddp化療聯(lián)合磁流體熱療能夠明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng),并誘導(dǎo)其凋亡，效果明顯優(yōu)于其中任何單一治療。

本發(fā)明采用的peg-mzf-nps(mn0.6zn0.4fe2o4)磁性納米材料體外磁感應(yīng)升溫實(shí)驗(yàn)中，在外加235khz、4kw、35a的高頻交變磁場(chǎng)條件下，不同濃度的peg-mzf-nps均能迅速升溫，0～20min升溫急劇，20min后升溫平緩，并保持一定的恒溫，說明該材料有良好的升溫恒溫能力。其中濃度為60μg/ml的peg-mzf-nps在20min內(nèi)達(dá)到42℃～43℃，該溫度為腫瘤熱療的理想溫度。

本發(fā)明采用的peg-mzf-nps，具有良好的分散性、磁響應(yīng)性和生物相容性；成功制備了peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物，該復(fù)合物和peg-mzf-nps同樣具有良好的磁熱效應(yīng)，可用于腫瘤的熱化療研究；體外磁共振掃描顯示其具有作為磁共振t2弛豫造影劑的應(yīng)用潛能，有可能實(shí)現(xiàn)靶向診斷與治療一體化的目標(biāo)。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在外加交變磁場(chǎng)作用下，peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物對(duì)卵巢癌細(xì)胞有較好的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用，效果明顯優(yōu)于單一的磁流體熱療和ddp化療。

附圖說明

圖1為peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的透射電鏡圖(tem)。

圖2為peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的紅外光譜圖。

圖3為peg-mzf-nps在交變磁場(chǎng)中升溫曲線圖。

圖4為peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物在交變磁場(chǎng)中升溫曲線圖。

圖5peg-mzf-nps的體外mri成像。

圖6不同濃度的peg-mzf-nps的t2橫向弛豫時(shí)間r2。

圖7peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的體外mri成像。

具體實(shí)施方式

為了理好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖、具體材料對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的具體限定。本發(fā)明中所采用的材料如下：

納米材料：peg-mzf-nps購于南京東納生物科技有限公司；

ddp(順鉑)購于江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

實(shí)施例：

1.peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的制備及表征

1.1peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的制備

取一定量的peg-mzf-nps磁流體與適量的ddp溶液混合(peg-mzf-nps與ddp質(zhì)量比40:1-80:1)，加入蒸餾水(peg-mzf-nps終濃度為60μg/ml)，超聲分散15min，使其充分反應(yīng)，過濾，濾液即為peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物，將其置于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的穩(wěn)定性檢測(cè)

peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物放在4℃冰箱儲(chǔ)存，一周后管底可見少量褐色沉淀物，經(jīng)超聲分散1min后即可重懸，說明該復(fù)合物具有較好的懸浮穩(wěn)定性。

1.3peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物透射電鏡觀察

取少量peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物，加無水乙醇超聲分散15分鐘，滴有膜銅網(wǎng)，自然晾干后，在透射電鏡(tem)下觀察其形貌。電鏡圖見圖1，制備的peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物平均粒徑為10nm左右，大小較一致。

1.4peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的傅立葉紅外光譜(ftir)分析

用傅立葉紅外光譜(ftir)分析peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp特征峰的變化。紅外光譜圖見圖2，在peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的紅外光譜中，在530cm^-1附近出現(xiàn)了一個(gè)新峰，為順鉑的pt－n特征吸收峰，表明peg-mzf-nps已將ddp成功地包裹。

1.5peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物在交變磁場(chǎng)中的升溫實(shí)驗(yàn)

配制濃度為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的peg-mzf-nps磁流體，分別取500μl置于平底試管中，將溫度計(jì)直接插入試管中(避免接觸到試管壁)，啟動(dòng)交變磁場(chǎng)，參數(shù)設(shè)置為235khz、4kw、35a，磁感應(yīng)線圈直徑為3cm，試管底部距磁感應(yīng)線圈約0.5cm，每隔5min記錄一次溫度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，溫度為縱坐標(biāo)，繪制peg-mzf-nps磁性納米材料的升溫曲線。

取peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物1ml加入平底試管中，交變磁場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：235khz、4kw，輸出電流分別為15a、25a、35a、45a下進(jìn)行升溫實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)方法同peg-mzf-nps升溫實(shí)驗(yàn)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，溫度為縱坐標(biāo)繪制該復(fù)合物升溫曲線。

peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物在交變磁場(chǎng)中的升溫特性見圖3、圖4，二者均能升溫至43℃，并保持穩(wěn)定，可用于腫瘤的熱療。

1.6peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的體外磁共振成像(mri)研究

將濃度為0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml的peg-mzf-nps置于含1％瓊脂糖的ependoff管中，對(duì)照組為加入去離子水的瓊脂糖。另取peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物100μl置于ependoff管中。采用7.0tmicro-mr掃描儀，內(nèi)徑3.0cm的體線圈，set2w1序列，參數(shù)設(shè)置如下：重復(fù)時(shí)間tr2500ms，回波時(shí)間te36ms，層厚1.0mm，fov4cmx3.5cm，矩陣256×256。讀取各樣本相應(yīng)的t2值，之后在origin下作r2曲線(r2＝1/t2)，由此得出各濃度樣品的r2弛豫率。

從磁共振成像(圖5)上可以觀察到，隨著peg-mzf-nps濃度增加，其t2w1信號(hào)明顯降低，測(cè)量出各濃度材料的t2值，由此得出peg-mzf-nps材料的弛豫率r2＝6.06(μg/ml^-1s^-1)，見圖6，提示peg-mzf-nps具有作為磁共振t2弛豫造影劑的應(yīng)用潛能。圖7為peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物的加權(quán)圖像，其信號(hào)明顯低于對(duì)照組，表明peg-mzf-nps與ddp結(jié)合后同樣可以作為造影劑使用。

2.1peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物對(duì)ho8910細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用

將ho8910細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的imem培養(yǎng)液中，置于37℃、飽和濕度、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：a組為陰性對(duì)照組；b組為ddp組；c組為peg-mzf-nps/mfh組；d組為peg-mzf-nps/ddp/mfh組。b組加入ddp；c組加入peg-mzf-nps磁流體；d組加入peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物；mfh組(c、d組)細(xì)胞放入spg-10a-ii高頻磁感應(yīng)加熱儀平板線圈上加熱1h，非mfh組(a、b組)室溫放置1h，然后將各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，mtt方法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖的抑制率，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如表1、表2。

表1peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物磁感應(yīng)加熱對(duì)卵巢癌細(xì)胞ho8910增殖抑制作用

^ap＜0.001與陰性對(duì)照組對(duì)比；^bp＜0.001與ddp組對(duì)比；^cp＜0.001與peg-mzf-nps/mfh組對(duì)比；^等dp＜0.001與ddp/mfh組對(duì)比

表2peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物磁感應(yīng)加熱對(duì)卵巢癌細(xì)胞ho8910的凋亡誘導(dǎo)作用

結(jié)果顯示，peg-mzf-nps/ddp復(fù)合物磁感應(yīng)加熱組(peg-mzf-nps/ddp/mfh組)細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均明顯高于其他各組，顯示了ddp和磁熱二者聯(lián)合治療的明顯優(yōu)勢(shì)。