本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新藤黃酸在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤,占各種惡性腫瘤死亡率的第二位。因其起病隱匿,進(jìn)展迅速,發(fā)現(xiàn)時(shí)已多屬中晚期。故而手術(shù)治療效果差,放化療又都有明顯不良反應(yīng),導(dǎo)致肝癌患者生存質(zhì)量差,生存期短。因此尋找低毒、有效、安全的抗腫瘤藥物是治療肝癌的關(guān)鍵。

以中醫(yī)藥為主的綜合治療對(duì)控制肝癌患者病情發(fā)展,改善生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期有著重要意義，并且天然的抗腫瘤藥物效果顯著且?guī)缀鯚o(wú)不良反應(yīng)。因此人們?cè)絹?lái)越重視這些物質(zhì)在抗腫瘤方面的研究和應(yīng)用。

細(xì)胞增殖失控與細(xì)胞凋亡異常是惡性腫瘤發(fā)生的兩大機(jī)制，細(xì)胞增殖受到嚴(yán)格的調(diào)控，癌基因激活或抑癌基因失活時(shí)均可導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡，為正常細(xì)胞生命活動(dòng)，涉及dna，高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)和線粒體網(wǎng)細(xì)胞組分的降解，凋亡異常會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，并與腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的異常改變密切相關(guān)。此外，遷移是腫瘤惡性程度的指標(biāo)之一，腫瘤細(xì)胞的遷移與血管的生成密切相關(guān)，偽足突出的速率影響細(xì)胞遷移的速度。

因此，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種新藤黃酸在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用甚為必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種新藤黃酸在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用，研制和尋求新型高效低毒的肝癌藥物。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

新藤黃酸在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。

在本發(fā)明中，上述肝癌細(xì)胞為人肝癌sk-hep-1細(xì)胞。

優(yōu)選的，新黃藤酸在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖藥物中應(yīng)用的有效濃度為0.75～4.5μmol/l。

優(yōu)選的，新黃藤酸在制備抑制肝癌細(xì)胞遷移藥物中應(yīng)用的有效濃度為0.0625～0.5μmol/l。

優(yōu)選的，新黃藤酸在制備誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡藥物中應(yīng)用的有效濃度為0.03125～8μmol/l。

本發(fā)明對(duì)肝癌細(xì)胞系sk-hep-1進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，采用cck-8檢測(cè)不同濃度新藤黃酸對(duì)sk-hep-1細(xì)胞活力的影響；通過(guò)倒置顯微鏡觀察hoechst染色檢測(cè)新藤黃酸處理后sk-hep-1細(xì)胞的凋亡情況；通過(guò)倒置顯微鏡觀察不同濃度新藤黃酸對(duì)sk-hep-1細(xì)胞遷移能力的影響。

新藤黃酸能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)作為天然植物提取藥物，新藤黃酸將在抗腫瘤的藥物治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為新藤黃酸對(duì)sk-hep-1細(xì)胞增殖的影響圖。

圖2為不同濃度新藤黃酸對(duì)sk-hep-1細(xì)胞遷移的影響圖。

圖3為不同濃度新滕黃酸作用sk-hep-1細(xì)胞后hoechst染色圖。

具體實(shí)施方式

利用附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但附圖中的內(nèi)容不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例1。

新藤黃酸在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。其中，上述肝癌細(xì)胞為人肝癌sk-hep-1細(xì)胞。新黃藤酸在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖藥物中應(yīng)用的有效濃度為0.75～4.5μmol/l。新黃藤酸在制備抑制肝癌細(xì)胞遷移藥物中應(yīng)用的有效濃度為0.0625～0.5μmol/l。新黃藤酸在制備誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡藥物中應(yīng)用的有效濃度為0.03125～8μmol/l。

本發(fā)明對(duì)肝癌細(xì)胞系sk-hep-1進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，采用cck-8檢測(cè)不同濃度新藤黃酸對(duì)sk-hep-1細(xì)胞活力的影響；通過(guò)倒置顯微鏡觀察hoechst染色檢測(cè)新藤黃酸處理后sk-hep-1細(xì)胞的凋亡情況；通過(guò)倒置顯微鏡觀察不同濃度新藤黃酸對(duì)sk-hep-1細(xì)胞遷移能力的影響。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新藤黃酸能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)作為天然植物提取藥物，新藤黃酸將在抗腫瘤的藥物治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

實(shí)施例2。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

1材料與方法

1.1材料

人肝癌sk-hep-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；新藤黃酸購(gòu)自廣州安邦生物科技有限公司，hoechst33342購(gòu)自美國(guó)cst公司；mem高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自mediatech公司；cck8試劑盒購(gòu)自日本dojindo公司。

1.2方法

1.2.1.細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配制

sk-hep-1細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清、100mg/l鏈霉素和100mg/l青霉素的高糖完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃、5％co2、飽和濕度。新藤黃酸先用pbs完全溶解，做后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2.新藤黃酸對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

用不同濃度新藤黃酸(0.75～4.5μmol/l)分別處理sk-hep-1細(xì)胞24h后，多功能酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)下讀取吸光度(a)值(od)，并計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率[抑制率(％)＝(1－加藥孔平均a值/對(duì)照孔平均a值)×100％]和ic50值。如圖1所示，經(jīng)測(cè)定，細(xì)胞增殖出現(xiàn)抑制效應(yīng)且呈劑量時(shí)間依賴性，新藤黃酸作用sk-hep-1細(xì)胞24h的最佳藥物濃度為4.5μmol/l，ic50值為4μmol/l。

1.2.3.新藤黃酸對(duì)肝癌sk-hep-1細(xì)胞遷移的作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sk-hep-1細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成均勻單層后,用無(wú)菌200μl移液器吸頭沿著孔的中軸線輕輕劃過(guò)。用pbs洗三次，除去細(xì)胞殘骸后,加入含有0、0.0625、0.125、0.25、0.5μmol/l新藤黃酸的無(wú)血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)0.5～1h后,以這一時(shí)間作為零時(shí)間點(diǎn),分別在0、12、24、36h時(shí)通過(guò)倒置顯微鏡(4×)觀察細(xì)胞遷移情況，劃痕損傷愈合的速度表明細(xì)胞遷移能力的快慢，如圖2所示，新黃藤酸在制備抑制肝癌細(xì)胞遷移藥物中應(yīng)用的有效濃度為0.0625～0.5μmol/l。

4.新藤黃酸對(duì)肝癌sk-hep-1細(xì)胞凋亡的作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sk-hep-1細(xì)胞，分別加入終濃度為0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μmol/l的新藤黃酸培養(yǎng)24h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變并拍照。用pbs洗滌兩次后加4％的多聚甲醇固定，加入hoechst染液，37℃閉光孵育45min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的變化并拍照。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)新藤黃酸作用后的細(xì)胞呈明顯凋亡狀態(tài)，細(xì)胞核固縮，核小體碎片增加，如圖3所示。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新藤黃酸能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，適合于作為抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡藥物。

最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。