本發(fā)明涉及一種碳納米管復(fù)合薄膜電極、本發(fā)明還涉及一種仿生型心肌組織、本發(fā)明還涉及仿生型心肌組織的培育方法，屬于組織工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

心肌梗死又叫心肌梗塞，是由于冠狀動(dòng)脈閉塞，血流中斷，導(dǎo)致分心肌因嚴(yán)重的持續(xù)性缺血而發(fā)生局部壞死。壞死的心肌逐漸被纖維瘢痕組織替代，引發(fā)心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭甚至猝死。目前臨床所采用的治療方法包括藥物治療、介入治療、溶栓治療、冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)，盡管能夠延緩心室重構(gòu)，改善心功能，但無(wú)法從根本上修復(fù)受損心肌、阻斷病程進(jìn)展。心臟移植則由于供體來(lái)源有限及免疫排異反應(yīng)，無(wú)法滿(mǎn)足臨床需求。為解決上述難題，研究人員提出組織工程心臟補(bǔ)片概念。即在實(shí)驗(yàn)室培育多功能心臟組織，在患者出現(xiàn)心力衰竭之前替換受損組織，從而修復(fù)心臟的結(jié)構(gòu)和功能。心肌組織工程研究包括3個(gè)方面：種子細(xì)胞、支架材料和組織構(gòu)建與移植，經(jīng)過(guò)多年研究已獲得許多技術(shù)突破。各類(lèi)天然及化學(xué)合成高分子材料顯示出較好的生物相容性，且對(duì)細(xì)胞活動(dòng)有一定程度的調(diào)節(jié)作用。然而，多功能心臟補(bǔ)片從實(shí)驗(yàn)室真正走向臨床應(yīng)用，還有諸多問(wèn)題亟待解決。特別是心肌組織具有獨(dú)特的電生理特性，而且心肌細(xì)胞在心臟的淺、中、深三層呈不同方向取向延伸，電信號(hào)在其中快速有序傳導(dǎo)引起心臟同步收縮。傳統(tǒng)的心肌補(bǔ)片培育方案難以充分模擬心肌的取向性結(jié)構(gòu)及電信號(hào)傳導(dǎo)功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種碳納米管復(fù)合薄膜電極和仿生型心肌組織及其培育方法，以解決上述問(wèn)題。

本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種碳納米管復(fù)合薄膜電極，其特征在于，包括：相互貼合的碳納米管薄膜和基底層，所述碳納米管薄膜中的碳納米管具有高取向性。

進(jìn)一步，本發(fā)明的碳納米管復(fù)合薄膜電極，還可以具有這樣的特征：其中，所述基底層為柔性的不導(dǎo)電高分子薄膜，材料為硅橡膠，聚四氟乙烯、聚乙烯和聚氯乙烯的其中一種。

進(jìn)一步，本發(fā)明的碳納米管復(fù)合薄膜電極，還可以具有這樣的特征：其中，所述碳納米管薄膜中，包括3～10層的單層碳納米管。

進(jìn)一步，本發(fā)明的碳納米管復(fù)合薄膜電極，還可以具有這樣的特征：其中，所述碳納米管薄膜和所述基底層的厚度之和的范圍是≥50μm，≤200μm。

本發(fā)明還提供一種仿生型心肌組織，包括如上述任意一項(xiàng)所述的碳納米管復(fù)合薄膜電極，其特征在于，包括：從上到下依次排列的心肌細(xì)胞層，碳納米管薄膜，以及基底層,其中，心肌細(xì)胞層中的心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)方向與取向碳納米管薄膜的方向一致。

進(jìn)一步，本發(fā)明的仿生型心肌組織，還可以具有這樣的特征：其中，所述基底層使用玻璃片代替柔性的不導(dǎo)電高分子薄膜。

本發(fā)明還提供一種仿生型心肌組織的培育方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，制備高度取向碳納米管薄膜，作為體外培育心肌細(xì)胞的基底；

步驟二，將碳納米管薄膜貼附在玻璃片或不導(dǎo)電高分子薄膜上；

步驟三，分離心肌細(xì)胞、將心肌細(xì)胞接種到碳納米管薄膜上。

進(jìn)一步，本發(fā)明的仿生型心肌組織的培育方法，還可以具有這樣的特征，還包括：步驟四、向心肌細(xì)胞實(shí)施模擬心臟的電脈沖刺激。

進(jìn)一步，本發(fā)明的仿生型心肌組織的培育方法，還可以具有這樣的特征：其中，電脈沖刺激的電壓為2～6v/cm，脈沖寬度為2ms；脈沖頻率為60～150bmp。

進(jìn)一步，本發(fā)明的仿生型心肌組織的培育方法，還可以具有這樣的特征：其中，電脈沖刺激通過(guò)碳納米管薄膜向心肌細(xì)胞施加。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的碳納米管復(fù)合薄膜電極和仿生型心肌組織及其培育方法，由于采用了高度取向性的碳納米管作為心肌細(xì)胞培育支架材料，使得心肌細(xì)胞在碳納米管上形成了類(lèi)似心肌組織的取向性生長(zhǎng)。因此本發(fā)明所提供的仿生型心肌組織可充分模仿心肌細(xì)胞取向性的微觀(guān)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步，由于碳納米管具有良好的導(dǎo)電性，因此能夠?yàn)榧?xì)胞間電信號(hào)的傳遞提供有效的聯(lián)接通路，使得本發(fā)明的仿生型心肌組織具有替代傳統(tǒng)高分子細(xì)胞培育支架材料，構(gòu)建多功能仿生心臟補(bǔ)片的應(yīng)用潛力。

附圖說(shuō)明

圖1為仿生型心肌組織的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為制備出的取向碳納米管的電鏡圖；

圖3a為取向碳納米管引導(dǎo)心肌細(xì)胞取向生長(zhǎng)的熒光顯微鏡照片，培育第3天時(shí)的熒光顯微鏡照片；

圖3b為培育第7天時(shí)的熒光顯微鏡照片；

圖3c為培育第7天時(shí)，熒光顯微鏡下同時(shí)打開(kāi)白光的照片，可見(jiàn)細(xì)胞伸展方向與碳納米管取向方向一致。

圖4a為顯微鏡下觀(guān)察到的依附于取向碳納米管薄膜上的三簇細(xì)胞,標(biāo)尺：500μm；

圖4b為這三簇細(xì)胞的自發(fā)搏動(dòng)曲線(xiàn)；

圖4c通過(guò)碳納米管薄膜對(duì)這些細(xì)胞施加起搏信號(hào)之后，這三簇細(xì)胞相應(yīng)起搏頻率(60bpm及100bpm)的搏動(dòng)變化曲線(xiàn)；

圖5是將柔性電極緊密貼附心臟的照片；

圖6是通過(guò)柔性電極同時(shí)起搏三個(gè)心臟的照片。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

1.碳納米管復(fù)合薄膜電極

1.1碳納米管薄膜的制備方法：

根據(jù)已有技術(shù)方法制備高度取向碳納米管膜，即通過(guò)化學(xué)氣相沉積法制備碳納米管陣列，再通過(guò)干法紡絲制備得相應(yīng)的纖維和膜。制備方法是：先在一個(gè)石英管式爐中，以鍍有fe(1.2nm)/al2o3(3nm)的硅片作為催化劑，以乙烯氣體作為碳源，以高純氬氣和高純氫氣混合氣作為載氣，升溫至740攝氏度，碳納米管開(kāi)始生長(zhǎng)。生長(zhǎng)時(shí)間控制在10-20分鐘，冷卻至室溫。得到可紡碳納米管陣列后，用一個(gè)刀片從碳納米管陣列的邊緣拉出單層的與陣列同寬的碳納米管膜。直接拉出的碳納米管薄膜顯示高度取向性,顯微鏡下觀(guān)測(cè)有顯著的取向性結(jié)構(gòu)。使用這種方法制備出這樣的碳納米管膜，稱(chēng)為super-alignedcarbonnanotubesheet，即高度取向性碳納米管。制備好的高度取向性碳納米管如圖2所示。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，干法紡絲技術(shù)制備的具有高度取向性的碳納米管薄膜，具有極輕的質(zhì)量、良好的柔韌性及自支撐性、多孔粗糙的表面、優(yōu)異的導(dǎo)電性及納米尺度上的可調(diào)控性。

1.2碳納米管薄膜與基底復(fù)合形成碳納米管復(fù)合薄膜電極

干法紡絲直接拉出的取向碳納米管薄膜直接置于基底上。

基底分為非柔性基底和柔性基底。非柔性基底可采用細(xì)胞培養(yǎng)的蓋玻片或玻璃片。柔性基底采用不導(dǎo)電高分子薄膜，包括硅橡膠，聚四氟乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯等。

基底厚度在10-1000μm之間，小于200μm最佳；基底尺寸根據(jù)培養(yǎng)皿尺寸，或需要起搏的哺乳動(dòng)物心臟大小調(diào)控，在0.2*0.2cm²及2*2cm²間可無(wú)比例約束隨意變化。

由于靜電吸引及范得華力作用，取向碳納米管薄膜對(duì)上述基底均有很好的帖附性質(zhì)。也可滴加少量無(wú)水乙醇，自然揮干起到更好的固定作用?；咨系奶技{米管薄膜可多層疊加。一般疊加層數(shù)在3-10層之間。單層的薄膜相當(dāng)于單根碳納米管組成的納米柵，薄膜厚度僅為10納米左右。碳納米管之間會(huì)有很多縫隙。而且也比較脆弱，彎折的時(shí)候容易碎裂。多層可以有效改善這個(gè)問(wèn)題。更重要的是，單層薄膜電阻較大，通過(guò)多層疊加來(lái)提高薄膜的電導(dǎo)率。也同時(shí)提高可操控性。

柔性基底上的取向碳納米管薄膜可90度彎折而不會(huì)脫落或破碎。先取向碳納米管所在一側(cè)內(nèi)向彎折500次，薄膜導(dǎo)電率幾乎不發(fā)生變化。外向彎折時(shí)，第一次彎折會(huì)造成20％的電導(dǎo)率降低，隨后繼續(xù)外向彎折到500次，電導(dǎo)率不再產(chǎn)生顯著降低。內(nèi)向彎曲和外向彎曲的區(qū)別如下：碳納米管薄膜帖附在柔性的基底上，向著碳納米管薄膜這面彎曲，叫內(nèi)向彎曲，向著基底那面彎曲，叫外向彎曲。更形象的，當(dāng)碳納米管在上，柔性基底在下，u形就是內(nèi)向彎曲，n形就是外向彎曲。

取向碳納米管薄膜帖附在柔性不導(dǎo)電高分子上制成碳納米管復(fù)合薄膜，可應(yīng)用于起搏器的電極。根據(jù)所需要起搏的器官大小將碳納米管復(fù)合薄膜剪裁成合式的大小。碳納米管復(fù)合薄膜顯示出良好的柔性，可多角度彎曲而結(jié)構(gòu)不發(fā)生明顯變化。碳納米管復(fù)合薄膜厚度控制在10-1000μm之間，碳納米管層厚度小于1μm，可忽略不計(jì)。主要調(diào)控不導(dǎo)電高分子層厚度。高分子薄膜可直接購(gòu)買(mǎi)厚度定制的商業(yè)生產(chǎn)的硅橡膠，聚四氟乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯等薄膜。也可購(gòu)買(mǎi)商業(yè)配制的前驅(qū)體溶液及引發(fā)劑，在實(shí)驗(yàn)室按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)比例自行混合后倒入底部平滑的容器成膜。碳納米管復(fù)合薄膜厚度小于200μm最佳，此時(shí)可緊密貼合柔軟的組織器官表面。但是薄膜厚度太薄將增加轉(zhuǎn)移操作難度，所以厚度一般大于50μm。

所制備取向碳納米管復(fù)合薄膜電極，可同步起搏多個(gè)離體心臟。一個(gè)典型的例子如附圖6所示:3個(gè)1-3天的乳鼠心臟被取出并經(jīng)過(guò)臺(tái)式液灌洗，放置在不導(dǎo)電平臺(tái)上。使取向碳納米管復(fù)合膜柔性電極同時(shí)覆蓋三個(gè)心臟，顯示出良好的貼合性。連接起搏器，三個(gè)心臟在2ms,5-10v,1-3hz條件下均可同步起搏。起搏情況可通過(guò)心室肌單項(xiàng)動(dòng)作電位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。另一方面，在麻醉?xiàng)l件下對(duì)試驗(yàn)小鼠進(jìn)行顯微鏡下開(kāi)胸手術(shù)，將柔性電極直接貼附在心臟表面，復(fù)合電極也可成功起搏心臟。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出，本發(fā)明制備的柔性取向碳納米管復(fù)合膜電極，在心臟同步起搏中具有進(jìn)一步應(yīng)用開(kāi)發(fā)的潛力。

2.仿生型心肌組織

結(jié)構(gòu)如圖1所示，仿生型心肌組織包括：心肌細(xì)胞層11和碳納米管復(fù)合薄膜電極12。心肌細(xì)胞層11覆蓋在碳納米管復(fù)合薄膜電極12上。

3.仿生型心肌組織的培育方法

根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法獲得分離的哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞，或通過(guò)市售途徑及保藏機(jī)構(gòu)獲得。以典型的sd大鼠乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)體系為例。心肌細(xì)胞分散在對(duì)應(yīng)的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液中，接種于底部鋪有取向碳納米管薄膜的細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。典型的方法中使用細(xì)胞培養(yǎng)六孔板，每個(gè)孔底部放置一片鋪有取向碳納米管薄膜的1.5*1.5cm²蓋玻片。細(xì)胞種植量為1×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔。細(xì)胞的種植濃度可以調(diào)整，培養(yǎng)皿放置在常規(guī)的如37℃/5％二氧化碳培養(yǎng)箱中。心肌細(xì)胞自主沉降帖附在取向碳納米管薄膜表面，自動(dòng)感知取向碳納米管薄膜表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)并依附其取向性生長(zhǎng)。細(xì)胞在培育第3天即顯示出明顯的沿碳納米管取向方向伸長(zhǎng)的形貌特征，如圖3a、圖3b和圖3c所示。細(xì)胞生長(zhǎng)情況通過(guò)免疫熒光染色后熒光顯微鏡圖像觀(guān)測(cè)。可見(jiàn)心肌細(xì)胞均顯現(xiàn)取向性生長(zhǎng)的形態(tài)。

取向碳納米管薄膜對(duì)心肌細(xì)胞取向性生長(zhǎng)具有顯著的引導(dǎo)作用。細(xì)胞培育第7天，細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)明顯的肌節(jié)橫紋，說(shuō)明細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于成熟。但是細(xì)胞的取向性形貌依然良好保持。可通過(guò)常規(guī)免疫熒光染色檢測(cè)到明顯的細(xì)胞間連接蛋白cx43表達(dá)。cx43對(duì)相鄰細(xì)胞間信號(hào)的傳遞具有重要作用。取向性生長(zhǎng)的心肌細(xì)胞表達(dá)的cx43也呈側(cè)壁化分布，沿著細(xì)胞邊緣顯示出取向性的排列方式。

取向碳納米管具體有良好的導(dǎo)電性。本發(fā)明中在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，即細(xì)胞貼壁完全，第三天的時(shí)候，通過(guò)將取向碳納米管薄膜基底連接外部信號(hào)發(fā)射器，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)的脈沖電刺激。電刺激范圍：起搏電壓2-6v/cm；脈寬，2ms；頻率，60-150bpm。為了防止漏電，外電路與取向碳納米管薄膜的連接部分使用不導(dǎo)電高分子，如硅橡膠，進(jìn)行保護(hù)。確保電信號(hào)通過(guò)取向碳納米管基底傳入培育中的心肌細(xì)胞。通過(guò)熱成像儀觀(guān)察到，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)體系持續(xù)通電不會(huì)造成額外的發(fā)熱現(xiàn)象。和無(wú)電刺激相比，電刺激培養(yǎng)也未帶來(lái)明顯的細(xì)胞凋亡數(shù)量的增加。另一方面，電刺激輔助培養(yǎng)提升了cx43的表達(dá)量(比未刺激高30-50％)。電刺激對(duì)取向碳納米管上細(xì)胞的形貌沒(méi)有顯著影響。

無(wú)論是否通電，通過(guò)取向碳納米管培育的心肌細(xì)胞，均能夠顯示出明顯的同步自發(fā)搏動(dòng)現(xiàn)象，sd大鼠乳鼠心肌細(xì)胞在培育第3天同步自發(fā)搏動(dòng)頻率約為80～200bpm，如圖3a，b所示。在培養(yǎng)后3-4天，通過(guò)膜片鉗技術(shù)針對(duì)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行原位的電生理學(xué)評(píng)估，顯示出取向碳納米管薄膜可以促進(jìn)乳鼠心肌細(xì)胞的電生理特性的成熟。電生理特性的成熟的標(biāo)準(zhǔn)是：靜息電位-70～-80mv，動(dòng)作電位幅度90～110mv，動(dòng)作電位復(fù)極90％時(shí)程(apd90)130～160ms)；同時(shí)取向碳納米管薄膜還可以降低不同心肌細(xì)胞之間、同一心肌細(xì)胞連續(xù)多次搏動(dòng)之間的電生理異質(zhì)性(apd30和apd90異質(zhì)性較蓋玻片降低60～80％)。通過(guò)取向碳納米管薄膜基底，可對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行同步起搏,如圖4c所示。圖4a為顯微鏡下觀(guān)察到的依附于取向碳納米管薄膜上的三簇細(xì)胞,標(biāo)尺：500μm；圖4b為這三簇細(xì)胞的自發(fā)搏動(dòng)曲線(xiàn)；圖4c通過(guò)碳納米管薄膜對(duì)這些細(xì)胞施加起搏信號(hào)之后，這三簇細(xì)胞相應(yīng)起搏頻率(60bpm及100bpm)的搏動(dòng)變化曲線(xiàn)。

如圖5所示，按照本發(fā)明的方法提供的仿生型心肌組織，能夠很好的貼附在心肌上，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)起搏的效果。

綜上所述，本發(fā)明首次提出利用碳納米管復(fù)合膜可以引導(dǎo)心肌細(xì)胞取向生長(zhǎng)，模擬天然心臟的微觀(guān)心肌結(jié)構(gòu)，增加心肌細(xì)胞間的連接蛋白表達(dá)和側(cè)壁化，并為心肌細(xì)胞間電信號(hào)的快速傳導(dǎo)提供物理通道。同時(shí)，碳納米管復(fù)合膜促進(jìn)乳鼠心肌細(xì)胞電生理特性的成熟，降低心肌細(xì)胞復(fù)極離散度，有助于碳納米管復(fù)合膜上的所有心肌細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)、規(guī)律的搏動(dòng)，避免心律失常的發(fā)生。電刺激協(xié)同碳納米管復(fù)合膜可以促進(jìn)乳鼠心肌細(xì)胞的成熟。體內(nèi)外起搏試驗(yàn)還顯示，輕薄、彈性極佳的單片式碳納米管復(fù)合膜電極還具有優(yōu)良的組織附著和起搏功能。因此，該碳納米管復(fù)合膜在心梗后心臟修復(fù)治療和伴有傳導(dǎo)阻滯的心梗后心衰的心臟再同步化治療中有著廣泛的應(yīng)用前景。