本申請是申請日為2010年8月12日、中國申請?zhí)枮?01080035971.x、發(fā)明名稱為“無巖藻糖基化cd20抗體與苯達(dá)莫司汀的聯(lián)合療法”的發(fā)明申請的分案申請。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及無巖藻糖基化cd20抗體與苯達(dá)莫司汀用于治療癌癥的聯(lián)合療法。
發(fā)明背景
無巖藻糖基化的抗體
單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)器功能可以通過工程化改造其寡糖組分來增強，如記載于
已經(jīng)報告了討論無巖藻糖基化的和巖藻糖基化的抗體(包括抗cd20抗體)的活性的研究(例如iida,s.等,clin.cancerres.12(2006)2879-2887；natsume,a.等,j.immunol.methods306(2005)93-103；satoh,m.等,expertopin.biol.ther.6(2006)1161-1173；kanda,y.等,biotechnol.bioeng.94(2004)680-688；davies,j.等,biotechnol.bioeng.74(2001)288-294。
cd20和抗cd20抗體
cd20分子(又稱作人b淋巴細(xì)胞限制性分化抗原或bp35)是一種已經(jīng)廣泛描述的位于前b和成熟b淋巴細(xì)胞上的疏水性跨膜蛋白(valentine,m.a.等,j.biol.chem.264(1989)11282-11287；及einfeld,d.a.等,emboj.7(1988)711-717；tedder,t.f.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85(1988)208-12；stamenkovic,i.等,j.exp.med.167(1988)1975-80；tedder,t.f.等,j.immunol.142(1989)2560-8)。cd20在大于90％的b細(xì)胞非何杰金(hodgkin)氏淋巴瘤(nhl)上表達(dá)(anderson,k.c.等,blood63(1984)1424-1433))，但是在造血干細(xì)胞、原b細(xì)胞、正常的漿細(xì)胞、或其它正常的組織上沒有找到(tedder,t.f.等,j,immunol.135(2)(1985)973-979)。
存在著在其cd20結(jié)合模式和生物學(xué)活性方面顯著不同的兩種不同類型的抗cd20抗體(cragg,m.s.等,blood103(2004)2738-2743；及cragg,m.s.等,blood101(2003)1045-1051)。i型抗體，如例如利妥昔單抗(rituximab)在補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中是有力的，而ii型抗體，如例如托西莫單抗(tositumomab)(b1)、11b8、at80或人源化b-ly1抗體經(jīng)由不依賴于胱天蛋白酶的凋亡及伴隨的磷脂酰絲氨酸暴露而有效啟動靶細(xì)胞死亡。
表1中匯總了i型和ii型抗cd20抗體共享的共同特征。
表1：i型和ii型抗cd20抗體的特性
苯達(dá)莫司汀(bendamustine)
苯達(dá)莫司汀(商品名ribomustin和treanda；又稱為sdx-105)是一種用于治療慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)(kath,r.等,j.cancerres.clin.oncol.127(2001)48-54)和非何杰金氏淋巴瘤(nhl)的氮芥。它屬于稱作烷化劑的藥物的家族。還在對其研究用于治療肉瘤(bagchi,s.,lancetoncol.8(2007)674)。
已經(jīng)與不同其它藥劑，包括利妥昔單抗一起使用苯達(dá)莫司汀作為治療劑(cheson,b.d.等,jclinoncol.27(9)20091492-501；knauf,w.,expertrevanticancerther.(2)9(2009)165-74；plosker,g.l.等,drugs.68(18)(2008)2645-60)。
發(fā)明概述
令人驚訝地，我們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了同與非無巖藻糖基化cd20抗體利妥昔單抗的組合相比，苯達(dá)莫司汀與無巖藻糖基化抗cd20抗體的組合顯示協(xié)同的(例如甚至大于疊加的)抗增殖效應(yīng)。
本發(fā)明包括具有占asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體用于制造與苯達(dá)莫司汀聯(lián)合治療癌癥的藥物的用途。
本發(fā)明的一方面是一種治療患有癌癥的患者的方法，其通過對需要此類治療的患者與苯達(dá)莫司汀組合施用具有占asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體來進行。
本發(fā)明的另一方面是具有占asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體，其用于與苯達(dá)莫司汀聯(lián)合治療癌癥。
在一個實施方案中，巖藻糖量占asn297處的寡糖(糖)總量的40％至60％。
在另一個實施方案中，巖藻糖量占asn297處的寡糖總量的0％。
在一個實施方案中，無巖藻糖基化抗cd20抗體是igg1抗體。
在另一個實施方案中，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體是人源化b-ly1抗體，而所述癌癥是表達(dá)cd20的癌癥，其在一個實施方案中是b細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl)。
在一個實施方案中，在6周劑量周期的第1天、第8天、第15天以800至1200mg的劑量，然后在多至5個4周劑量周期的第1天以800至1200mg的劑量施用人源化b-ly1抗體，并在多至6個4周劑量周期的第1天和第2天以80mg/m2至110mg/m2的劑量施用苯達(dá)莫司汀。
本發(fā)明的一個實施方案是一種用于治療癌癥的組合物，其包含具有60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀。
發(fā)明詳述
本發(fā)明包括igg1或igg3同種型的(優(yōu)選地igg1同種型的)具有占asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體用于制造與苯達(dá)莫司汀聯(lián)合治療癌癥的藥物的用途。在一個實施方案中，無巖藻糖基化抗cd20抗體以10-9m至10-13mol/l的kd結(jié)合cd20。
在一個實施方案中，巖藻糖量占asn297處的寡糖(糖)總量的40％至60％。
術(shù)語“抗體”涵蓋各種抗體形式，包括但不限于完整的抗體、人抗體、人源化抗體和遺傳工程抗體，如單克隆抗體、嵌合抗體或重組抗體及此類抗體的片段，只要依照本發(fā)明的特征性特性得到保留。如本文中所使用的，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一氨基酸組成的抗體分子的制備物。因而，術(shù)語“人單克隆抗體”指具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)的展現(xiàn)出單一結(jié)合特異性的抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體是由雜交瘤生成的，所述雜交瘤包含與永生化細(xì)胞融合的自具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的b細(xì)胞。
術(shù)語“嵌合抗體”指通常通過重組dna技術(shù)制備的包含來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)和自不同來源或物種衍生的恒定區(qū)的至少一部分的單克隆抗體。包含鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體是特別優(yōu)選的。此類鼠/人嵌合抗體是包含編碼鼠免疫球蛋白可變區(qū)的dna區(qū)段和編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的dna區(qū)段的所表達(dá)免疫球蛋白基因的產(chǎn)物。本發(fā)明所涵蓋的“嵌合抗體”的其它形式是那些其中類別或亞類已經(jīng)自初始抗體的類別或亞類修飾或改變的。此類“嵌合”抗體又稱為“類別轉(zhuǎn)換抗體”。用于生成嵌合抗體的方法牽涉本領(lǐng)域現(xiàn)在公知的常規(guī)重組dna和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見例如morrison,s.l.等,proc.natl.acadsci.usa81(1984)6851-6855；us5,202,238和us5,204,244。
術(shù)語“人源化抗體”指其中的框架或“互補決定區(qū)”(cdr)已經(jīng)進行過修飾以包含與親本免疫球蛋白的特異性相比不同特異性的免疫球蛋白的cdr的抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，將鼠cdr嫁接入人抗體的框架區(qū)中以制備“人源化抗體”。參見例如riechmann,l.等,nature332(1988)323-327；及neuberger,m.s.等,nature314(1985)268-270。
如本文中所使用的，術(shù)語“人抗體”意圖包括具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(vandijk,m.a.和vandewinkel,j.g.,curr.opin.pharmacol.5(2001)368-374)?；诖祟惣夹g(shù)，可以生成針對極其多種靶物的人抗體。人抗體的例子記載于例如kellermann,s.a.等,curr.opin.biotechnol.13(2002)593-597。
如本文中所使用的，術(shù)語“重組人抗體”意圖包括通過重組手段制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離的所有人抗體，諸如自宿主細(xì)胞諸如ns0或cho細(xì)胞或者自對于使用轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的人免疫球蛋白基因或抗體而言轉(zhuǎn)基因的動物(例如小鼠)分離的抗體。此類重組人抗體具有重排形式的自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)。依照本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)進行過體內(nèi)體細(xì)胞超突變。如此，重組抗體的vh和vl區(qū)的氨基酸序列是雖然自人種系vh和vl序列衍生及與其相關(guān)，但可以不天然存在于體內(nèi)的人抗體種系全集內(nèi)的序列。
如本文中所使用的，術(shù)語“結(jié)合”或“特異性結(jié)合”指用純化的野生型抗原在體外測定法中，優(yōu)選地在等離振子共振測定法(biacore,ge-healthcareuppsala,sweden)中抗體對腫瘤抗原的表位的結(jié)合。結(jié)合親和力通過術(shù)語ka(來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的結(jié)合速率常數(shù))、kd(解離常數(shù))、和kd(kd/ka)限定。結(jié)合或特異性結(jié)合意指10-8mol/l或更小，優(yōu)選地10-9m至10-13mol/l的結(jié)合親和力(kd)。如此，依照本發(fā)明的無巖藻糖基化抗體以10-8mol/l或更小，優(yōu)選地10-9m至10-13mol/l的結(jié)合親和力(kd)特異性結(jié)合腫瘤抗原。
如本文中所使用的，術(shù)語“核酸分子”意圖包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但是優(yōu)選的是雙鏈dna。
“恒定域”不直接牽涉抗體對抗原的結(jié)合，但是牽涉效應(yīng)器功能(adcc、補體結(jié)合、和cdc)。
如本文中所使用的，“可變區(qū)”(輕鏈可變區(qū)(vl)、重鏈可變區(qū)(vh))意為直接牽涉抗體結(jié)合抗原的輕鏈和重鏈域?qū)χ糠N。人輕鏈和重鏈可變域具有相同的一般結(jié)構(gòu)，并且每個域包含通過三個“高變區(qū)”(或互補決定區(qū)，cdr)連接的其序列廣泛保守的四個框架(fr)區(qū)?？蚣軈^(qū)采用b-片層構(gòu)象，而cdr可以形成連接b-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的cdr通過框架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)，并且與來自另一條鏈的cdr一起形成抗原結(jié)合位點。
術(shù)語“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”在本文中使用時指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基。“框架”或“fr”區(qū)是與如本文中所限定的高變區(qū)殘基不同的那些可變域區(qū)。因此，抗體的輕鏈和重鏈包含自n至c端的域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、和fr4。特別地，重鏈的cdr3是對抗原結(jié)合貢獻最大的區(qū)。cdr和fr區(qū)依照kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義和/或那些來自“高變環(huán)”的殘基來確定。
苯達(dá)莫司汀是4-[5-[二(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸。商品名是ribomustin和treanda；苯達(dá)莫司汀又稱為sdx-105)。苯達(dá)莫司汀是一種用于治療慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)(kath,r.等,j.cancerres.clin.oncol.127(2001)48-54)和非何杰金氏淋巴瘤(nhl)的氮芥。它屬于稱作烷化劑的藥物的家族。還在對其研究用于治療肉瘤(bagchi,s.,lancetoncol.8(2007)674)。
術(shù)語“無巖藻糖基化抗體”指在fc區(qū)中在asn297處具有改變的糖基化樣式且具有降低的巖藻糖殘基水平的igg1或igg3同種型的(優(yōu)選地igg1同種型的)抗體。在asn297處發(fā)生人igg1或igg3的糖基化，作為以多至兩個gal殘基為末端的核心巖藻糖化雙觸角復(fù)合寡糖糖基化。根據(jù)末端gal殘基的量，這些結(jié)構(gòu)稱為g0、g1(α1,6或α1,3)或g2聚糖殘基(raju,t.s.,bioprocessint.1(2003)44-53)?？贵wfc部分的cho型糖基化例如由routier,f.h.,glycoconjugatej.14(1997)201-207描述。在非糖修飾的cho宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體在asn297處通常以至少85％的量進行巖藻糖基化。應(yīng)當(dāng)理解，如本文中所使用的，術(shù)語無巖藻糖基化抗體包括在其糖基化樣式中沒有巖藻糖的抗體。通常已知的是，抗體中典型的糖基化殘基位置是依照eu編號系統(tǒng)的第297位的天冬酰胺(“asn297”)。
“eu編號系統(tǒng)”或“eu索引”一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時使用(例如kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中報告的eu索引，通過提及而將其明確收入本文)。
如此，依照本發(fā)明的無巖藻糖基化抗體意指其中的巖藻糖量占asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少(這意味著在fc區(qū)中asn297處的寡糖的至少40％或更多是無巖藻糖基化的)的igg1或igg3同種型的(優(yōu)選地igg1同種型的)抗體。在一個實施方案中，巖藻糖量占fc區(qū)中asn297處的寡糖的40％至60％。在另一個實施方案中，巖藻糖量是50％或更小，并且在又一個實施方案中，巖藻糖量占fc區(qū)中asn297處的寡糖的30％或更小。在一個備選的實施方案中，巖藻糖量占fc區(qū)中asn297處的寡糖的0％。依照本發(fā)明，“巖藻糖的量”意指通過maldi-tof質(zhì)譜術(shù)測量的，并以平均值計算的，相對于附著于asn297的所有寡糖(糖)(例如復(fù)合的、雜合的和高甘露糖結(jié)構(gòu))的總和，asn297處寡糖(糖)鏈內(nèi)所述寡糖(巖藻糖)的量(測定巖藻糖量的詳細(xì)規(guī)程記載于例如wo2008/077546)。此外，在一個實施方案中，fc區(qū)的寡糖是兩分的?？梢栽诠こ袒脑斐杀磉_(dá)至少一種核酸的糖修飾的宿主細(xì)胞中表達(dá)依照本發(fā)明的無巖藻糖基化抗體，所述核酸編碼具有g(shù)ntiii活性的多肽，其量足以部分巖藻糖基化fc區(qū)中的寡糖。在一個實施方案中，具有g(shù)ntiii活性的多肽是融合多肽?；蛘?，可以依照us6,946,292降低或消除宿主細(xì)胞的α1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性以生成糖修飾的宿主細(xì)胞。可以例如通過發(fā)酵條件(例如發(fā)酵時間)或者通過組合至少兩種具有不同巖藻糖基化量的抗體來預(yù)先確定抗體巖藻糖基化的量。此類無巖藻糖基化抗體及相應(yīng)的糖工程方法記載于wo2005/044859,wo2004/065540,wo2007/031875,umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180,wo99/154342,wo2005/018572,wo2006/116260,wo2006/114700,wo2005/011735,wo2005/027966,wo97/028267,us2006/0134709,us2005/0054048,us2005/0152894,wo2003/035835,wo2000/061739。這些糖工程抗體具有升高的adcc。依照本發(fā)明產(chǎn)生無巖藻糖基化抗體的其它糖工程方法記載于例如niwa,r.等,j.immunol.methods306(2005)151-160；shinkawa,t.等,j.biol.chem.278(2003)3466-3473；wo03/055993或us2005/0249722。
如此，本發(fā)明的一方面是igg1或igg3同種型的(優(yōu)選地igg1同種型的)，特異性結(jié)合cd20的，具有占asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體用于制造與苯達(dá)莫司汀聯(lián)合治療癌癥的藥物的用途。在一個實施方案中，巖藻糖量占asn297處的寡糖(糖)總量的40％至60％。
cd20(又稱為b淋巴細(xì)胞抗原cd20、b淋巴細(xì)胞表面抗原b1、leu-16、bp35、bm5、和lf5；序列以swissprot數(shù)據(jù)庫條目p11836為特征)是一種位于前b和成熟b淋巴細(xì)胞上的具有約35kd分子量的疏水性跨膜蛋白(valentine,m.a.等,j.biol.chem.264(19)(1989)11282-11287；tedder,t.f.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85(1988)208-212；stamenkovic,i.等,j.exp.med.167(1988)1975-80；einfeld,d.a.等,emboj.7(1988)711-7；tedder,t.f.等,j.immunol.142(1989)2560-2568)。相應(yīng)的人基因是4次跨膜域，a亞家族，成員1，又稱為ms4a1。此基因編碼跨膜4a基因家族的成員。此初生蛋白質(zhì)家族的成員以共同的結(jié)構(gòu)特征和相似的內(nèi)含子/外顯子剪接邊界為特征，并且在造血細(xì)胞和非淋巴樣組織中展現(xiàn)出獨特的表達(dá)樣式。此基因編碼b淋巴細(xì)胞表面分子，其在b細(xì)胞發(fā)育及分化成漿細(xì)胞中發(fā)揮作用。在家族成員的簇中，此家族成員定位于11q12。此基因的可變剪接產(chǎn)生編碼同一蛋白質(zhì)的兩種轉(zhuǎn)錄物變體。
術(shù)語“cd20”和“cd20抗原”在本文中可互換使用，包括由細(xì)胞天然表達(dá)的或者在用cd20基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上表達(dá)的人cd20的任何變體、同等型和物種同系物。本發(fā)明的抗體對cd20抗原的結(jié)合通過滅活cd20而介導(dǎo)對表達(dá)cd20的細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)的殺傷?？梢酝ㄟ^下列一項或多項機制而發(fā)生對表達(dá)cd20的細(xì)胞的殺死：細(xì)胞死亡/凋亡誘導(dǎo)、adcc和cdc。
如本領(lǐng)域中認(rèn)可的，cd20的同義詞包括b淋巴細(xì)胞抗原cd20、b淋巴細(xì)胞表面抗原b1、leu-16、bp35、bm5、和lf5。
依照本發(fā)明的術(shù)語“抗cd20抗體”是特異性結(jié)合cd20抗原的抗體。根據(jù)針對cd20抗原的抗cd20抗體的結(jié)合特性和生物學(xué)活性，兩種類型的抗cd20抗體(i型和ii型抗cd20抗體)可以依照cragg,m.s.等,blood103(2004)2738-2743；及cragg,m.s.等,blood101(2003)1045-1051區(qū)別，參見表2。
表2：i型和ii型抗cd20抗體的特性
ii型抗cd20抗體的例子包括例如人源化b-ly1抗體igg1(一種嵌合的人源化igg1抗體，如披露于wo2005/044859中的)、11b8igg1(如披露于wo2004/035607中的)、和at80igg1。通常，igg1同種型的ii型抗cd20抗體顯示特征性的cdc特征。與igg1同種型的i型抗體相比，ii型抗cd20抗體具有降低的cdc(若為igg1同種型的話)。
i型抗cd20抗體的例子包括例如利妥昔單抗、hi47igg3(ecacc，雜交瘤)、2c6igg1(如披露于wo2005/103081中的)、2f2igg1(如披露于wo2004/035607和wo2005/103081的)和2h7igg1(如披露于wo2004/056312中的)。
依照本發(fā)明的無巖藻糖基化抗cd20抗體在一個實施方案中是ii型抗cd20抗體，在一個更具體的實施方案中，ii型抗cd20抗體是無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體。
與沒有降低巖藻糖的抗cd20抗體不一樣，依照本發(fā)明的無巖藻糖基化抗cd20抗體具有升高的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)。
“具有升高的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)的無巖藻糖基化抗cd20抗體”意指具有如通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何合適的方法測定的升高的adcc的無巖藻糖基化抗cd20抗體，如該術(shù)語在本文中所定義的。一種公認(rèn)的體外adcc測定法如下：
1)該測定法使用已知表達(dá)被抗體的抗原結(jié)合區(qū)識別的靶抗原的靶細(xì)胞；
2)該測定法使用自隨機選定的健康供體的血液分離的人外周血單個核細(xì)胞(pbmc)作為效應(yīng)細(xì)胞；
3)依照下列方案來實施測定法：
i)使用標(biāo)準(zhǔn)的密度離心規(guī)程來分離pbmc，并將其以5x106個細(xì)胞/ml在rpmi細(xì)胞培養(yǎng)基中懸??；
ii)將靶細(xì)胞通過標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)方法來培養(yǎng)，自具有高于90％的存活力的指數(shù)生長期收獲，在rpmi細(xì)胞培養(yǎng)基中清洗，用100微居里51cr標(biāo)記，用細(xì)胞培養(yǎng)基清洗兩次，并以105個細(xì)胞/ml的密度在細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸浮；
iii)將100微升上述最終靶細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板的每孔；
iv)將抗體在細(xì)胞培養(yǎng)基中自4000ng/ml連續(xù)稀釋至0.04ng/ml，并將50微升所得的抗體溶液添加至96孔微量滴定板中的靶細(xì)胞，一式三份測試覆蓋上述整個濃度范圍的多種抗體濃度；
v)對于最大釋放(mr)對照，含有經(jīng)標(biāo)記的靶細(xì)胞的平板中的3個另外的孔接受50微升非離子型去污劑(nonidet,sigma,st.louis)的2％(vn)水溶液，代替抗體溶液(上述第iv點)；
vi)對于自發(fā)釋放(sr)對照，含有經(jīng)標(biāo)記的靶細(xì)胞的平板中的3個另外的孔接受50微升rpmi細(xì)胞培養(yǎng)基，代替抗體溶液(上述第iv點)；
vii)然后，將96孔微量滴定板以50xg離心1分鐘，并于4℃溫育1小時；
viii)將50微升pbmc懸浮液(上述第i點)添加至每孔以產(chǎn)生效應(yīng):靶細(xì)胞比率25:1，并將平板在培養(yǎng)箱中在5％co2氣氛下于37℃放置4小時；
ix)收獲來自每孔的無細(xì)胞上清液，并使用γ計數(shù)器來量化實驗釋放的放射性(er)；
x)依照公式(er-mr)/(mr-sr)x100對每個抗體濃度計算特異性溶解的百分比，其中er是對所述抗體濃度量化(參見上述第ix點)的平均放射性，mr是對mr對照(參見上述第v點)量化(參見上述第ix點)的平均放射性，而sr是對sr對照(參見上述第vi點)量化(參見上述第ix點)的平均放射性；
4)“升高的adcc”定義為上文測試的抗體濃度范圍內(nèi)觀察到的特異性溶解的最大百分比的增加和/或達(dá)到上文測試的抗體濃度范圍內(nèi)觀察到的特異性溶解的最大百分比的一半所需要的抗體濃度降低。adcc的升高相對于用上述測定法測量的，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相同的標(biāo)準(zhǔn)生成、純化、配制和貯存方法，由相同類型的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的，但是并非由工程化改造成過表達(dá)gntiii的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的相同抗體介導(dǎo)的adcc。
可以通過所述抗體的糖工程來獲得所述“升高的adcc”，其意味著通過工程化改造其寡糖組分來增強單克隆抗體的所述天然的、細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)器功能，如記載于umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180及us6,602,684的。
術(shù)語“補體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)”指在存在補體的情況中依照本發(fā)明的抗體對人腫瘤靶細(xì)胞的溶解。優(yōu)選地，通過在存在補體的情況中用依照本發(fā)明的抗cd20抗體處理表達(dá)cd20的細(xì)胞的制備物來測量cdc。若抗體在濃度100nm時在4小時后誘導(dǎo)20％或更多的腫瘤細(xì)胞溶解(細(xì)胞死亡)，則發(fā)現(xiàn)cdc。優(yōu)選地，用經(jīng)51cr或eu標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞及釋放的51cr或eu測量來實施測定法。對照包括將腫瘤靶細(xì)胞與補體但不與抗體一起溫育。
“利妥昔單抗”抗體(參照抗體；i型抗cd20抗體的例子)是一種針對人cd20抗原的含有遺傳工程嵌合人γ1鼠恒定域的單克隆抗體。此嵌合抗體含有人γ1恒定域，并且以1998年4月17日公告的歸于idecpharmaceuticalscorporation的us5,736,137(andersen等)中的名稱“c2b8”鑒定。利妥昔單抗批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)性或頑固性低度或濾泡性、cd20陽性、b細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤患者。體外作用機制研究已經(jīng)顯示了利妥昔單抗展現(xiàn)出人補體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)(reff,m.e.等,blood83(2)(1994)435-445)。另外，它在測量抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)的測定法中展現(xiàn)出顯著的活性。利妥昔單抗不是無巖藻糖基化的。
術(shù)語“人源化b-ly1抗體”指如wo2005/044859和wo2007/031875中所披露的人源化b-ly1抗體，其通過用來自igg1的人恒定域嵌合化及接著的人源化自鼠單克隆抗cd20抗體b-ly1(鼠重鏈可變區(qū)(vh)：seqidno:1；鼠輕鏈可變區(qū)(vl)：seqidno:2，參見poppema,s.和visser,l.,biotestbulletin3(1987)131-139)獲得(參見wo2005/044859和wo2007/031875)。這些“人源化b-ly1抗體”詳細(xì)披露于wo2005/044859和wo2007/031875中。
在一個實施方案中，“人源化b-ly1抗體”具有選自下組的重鏈可變區(qū)(vh)：seqidno:3至seqidno:20(wo2005/044859和wo2007/031875的b-hh2至b-hh9和b-hl8至b-hl17)。特別優(yōu)選的是seq.idno.3、4、7、9、11、13和15(wo2005/044859和wo2007/031875的b-hh2、b-hh3、b-hh6、b-hh8、b-hl8、b-hl11和b-hl13)。在一個具體的實施方案中，“人源化b-ly1抗體”具有輕鏈可變區(qū)(vl)seqidno:20(wo2005/044859和wo2007/031875的b-kv1)。在另一個具體的實施方案中，“人源化b-ly1抗體”具有重鏈可變區(qū)(vh)seqidno:7(wo2005/044859和wo2007/031875的b-hh6)和輕鏈可變區(qū)(vl)seqidno:20(wo2005/044859和wo2007/031875的b-kv1)。此外，在一個實施方案中，人源化b-ly1抗體是igg1抗體。依照本發(fā)明，依照記載于wo2005/044859、wo2004/065540、wo2007/031875、umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180及wo99/154342中的規(guī)程在fc區(qū)中糖工程化改造(ge)此類無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體。在本發(fā)明的一個實施方案中，所使用的抗cd20抗體是無巖藻糖基化的糖工程人源化b-ly1，稱為b-hh6-b-kv1ge。此類糖工程人源化b-ly1抗體在fc區(qū)中具有改變的糖基化樣式，優(yōu)選地具有降低的巖藻糖殘基水平。在一個實施方案中，巖藻糖量占asn297處的寡糖總量的60％或更少(在一個實施方案中，巖藻糖的量是40％至60％，在另一個實施方案中，巖藻糖的量是50％或更少，且在又一個實施方案中，巖藻糖的量是30％或更少，且在又一個實施方案中，巖藻糖的量是0％。此外，在一個具體的實施方案中，fc區(qū)的寡糖是兩分的。這些糖工程人源化b-ly1抗體具有升高的adcc。
寡糖組分可以顯著影響與治療性糖蛋白的功效有關(guān)的特性，包括物理穩(wěn)定性、對蛋白酶攻擊的抗性、與免疫系統(tǒng)的相互作用、藥動學(xué)、和特定(specific)生物學(xué)活性。此類特性可能不僅取決于寡糖的存在或缺乏，而且還取決于寡糖的特定結(jié)構(gòu)?？梢宰龀龉烟墙Y(jié)構(gòu)與糖蛋白功能間的一些概括。例如，某些寡糖結(jié)構(gòu)經(jīng)由與特定碳水化合物結(jié)合蛋白的相互作用而介導(dǎo)糖蛋白自血流的快速清除，而其它寡糖結(jié)構(gòu)可以被抗體結(jié)合，并觸發(fā)不想要的免疫反應(yīng)(jenkins,n.等,naturebiotechnol.14(1996)975-981)。
由于哺乳動物細(xì)胞以對于人應(yīng)用最相容的形式糖基化蛋白質(zhì)的性能，它是用于生成治療性糖蛋白的卓越的宿主(cumming,d.a.等,glycobiology1(1991)115-30；jenkins,n.等,naturebiotechnol.14(1996)975-981)。細(xì)菌糖基化蛋白質(zhì)非常罕見，并且與其它類型的常見宿主，諸如酵母、絲狀真菌、昆蟲和植物細(xì)胞一樣，其產(chǎn)生與自血流快速清除、不想要的免疫相互作用、和(在一些特定的情況中)降低的生物學(xué)活性有關(guān)的糖基化樣式。在哺乳動物細(xì)胞中，在過去二十年期間最常使用中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞。在給予合適的糖基化樣式外，這些細(xì)胞容許遺傳穩(wěn)定的、高生產(chǎn)性克隆細(xì)胞系的一致生成。它們可以使用無血清培養(yǎng)基在簡單的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)至高密度，并容許開發(fā)安全且可再現(xiàn)的生物工藝。其它通常使用的動物細(xì)胞包括幼侖鼠腎(bhk)細(xì)胞、nso和sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞。新近，還已經(jīng)測試了自轉(zhuǎn)基因動物的生成(jenkins,n.等,naturebiotechnol.14(1996)975-981)。
所有抗體在重鏈恒定區(qū)中的保守位置處都含有碳水化合物結(jié)構(gòu)，其中每種同種型擁有獨特的一批n連接的碳水化合物結(jié)構(gòu)，其易變地影響蛋白質(zhì)裝配、分泌或功能性活性(wright,a.和monison,s.l.,trendsbiotech.15(1997)26-32)。根據(jù)加工程度，附著的n連接的碳水化合物結(jié)構(gòu)變化得相當(dāng)大，并且可以包括高甘露糖的、多分支的及雙觸角的復(fù)合寡糖(wright,a.和morrison,s.l.,trendsbiotech.15(1997)26-32)。通常，存在著特定糖基化位點處附著的核心寡糖結(jié)構(gòu)的異質(zhì)加工，使得甚至單克隆抗體以多種糖形存在。同樣地，已經(jīng)顯示了細(xì)胞系間存在抗體糖基化的主要差異，而且甚至對不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的給定細(xì)胞系看到次要差異(lifely,m.r.等,glycobiology5(8)(1995)813-22。
一種在維持簡單的生成過程并潛在地避免顯著的、不想要的副作用的情況中獲得效力大幅升高的方式是通過工程化改造單克隆抗體的寡糖組分來增強其天然的、細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)器功能，如記載于umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180及us6,602,684的。igg1型抗體(即在癌癥免疫療法中最常使用的抗體)是在每個ch2域中的asn297處具有保守的n連接的糖基化位點的糖蛋白。附著于asn297的兩個復(fù)合雙觸角寡糖掩埋于各ch2域間，與多肽主鏈形成廣泛的接觸，并且其存在對于抗體介導(dǎo)效應(yīng)器功能諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)是至關(guān)重要的(lifely,m.r.等,glycobiology5(1995)813-822；jefferis,r.等,immunol.rev.163(1998)59-76；wright,a和morrison,s.l.,trendsbiotechnol.15(1997)26-32)。
先前顯示了β(1,4)-n-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶i11(“gntii17y”)(一種催化兩分型寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)在中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞中的過表達(dá)顯著提高由工程化改造的cho細(xì)胞生成的抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤嵌合單克隆抗體(chce7)的體外adcc活性。(參見umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180；及wo99/154342，在此通過提及而收錄其全部內(nèi)容)。抗體chce7屬于具有高腫瘤親和力和特異性，但是在缺乏gntiii酶的標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)細(xì)胞系中生產(chǎn)時具有太少的效力以致在臨床上無用的一大類未綴合的單克隆抗體(umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180)。所述研究第一次顯示了可以通過工程化改造抗體生成細(xì)胞以表達(dá)gntiii來獲得adcc活性的大幅升高，其還導(dǎo)致恒定區(qū)(fc)結(jié)合的兩分型寡糖(包括兩分型非巖藻糖基化寡糖)比例的增加，高于天然存在的抗體中找到的水平。
如本文中所使用的，術(shù)語“癌癥”包括淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、非小細(xì)胞肺(nscl)癌、細(xì)支氣管肺泡細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastriccancer)、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金(hodgkin)氏病、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細(xì)胞癌、膽癌(biliarycancer)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)新生物、脊柱軸腫瘤、腦干膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme)、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤(schwanoma)、室鼓膜瘤(ependymona)、髓母細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、鱗狀細(xì)胞癌、垂體腺瘤，包括任何上述癌癥的頑固性型式、或一種或多種上述癌癥的組合。在一個實施方案中，術(shù)語癌癥指表達(dá)cd20的癌癥。
術(shù)語“表達(dá)cd20”抗原意圖指示分別來自腫瘤或癌癥，優(yōu)選地非實體瘤的細(xì)胞中，優(yōu)選地在t或b細(xì)胞，更優(yōu)選地b細(xì)胞的細(xì)胞表面上的cd20抗原的顯著水平的表達(dá)。可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定法來確定患有“表達(dá)cd20的癌癥”的患者。例如，可以使用免疫組織化學(xué)(ihc)檢測、facs或者經(jīng)由相應(yīng)mrna的基于pcr的檢測來測量cd20抗原表達(dá)。
如本文中所使用的，術(shù)語“表達(dá)cd20的癌癥”指癌細(xì)胞顯示cd20抗原表達(dá)的所有癌癥。優(yōu)選地，如本文中所使用的表達(dá)cd20的癌癥指淋巴瘤(優(yōu)選地b細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl))和淋巴細(xì)胞性白血病。此類淋巴瘤和淋巴細(xì)胞性白血病包括例如a)濾泡性淋巴瘤、b)小無核裂細(xì)胞淋巴瘤(smallnon-cleavedcelllymphoma)/伯基特(burkitt)氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤、散發(fā)性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)、c)邊緣區(qū)淋巴瘤(包括結(jié)外邊緣區(qū)b細(xì)胞淋巴瘤(粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤，malt)、結(jié)邊緣區(qū)b細(xì)胞淋巴瘤和脾邊緣區(qū)淋巴瘤)、d)套細(xì)胞淋巴瘤(mcl)、e)大細(xì)胞淋巴瘤(包括b細(xì)胞彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤(dlcl)、彌漫性混合細(xì)胞淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、原發(fā)性縱隔b細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺b細(xì)胞淋巴瘤)、f)毛細(xì)胞白血病、g)淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫(waldenstrom)氏巨球蛋白血癥、h)急性淋巴細(xì)胞性白血病(all)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(sll)、b細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病、i)漿細(xì)胞新生物、漿細(xì)胞骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤、j)何杰金氏病。
在一個別的實施方案中，表達(dá)cd20的癌癥是b細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl)。在另一個實施方案中，表達(dá)cd20的癌癥是套細(xì)胞淋巴瘤(mcl)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(all)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)、b細(xì)胞彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤(dlcl)、伯基特氏淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病、濾泡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、移植后淋巴增殖性病癥(ptld)、hiv有關(guān)的淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、或原發(fā)性cns淋巴瘤。
術(shù)語“治療方法”或其等同用語在應(yīng)用于例如癌癥時指設(shè)計為降低或消除患者中的癌細(xì)胞數(shù)目，或者減輕癌癥癥狀的規(guī)程或作用過程。癌癥或另一種增殖性病癥的“治療方法”不必意味著實際上會消除癌細(xì)胞或其它病癥，實際上會降低細(xì)胞數(shù)目或病癥，或?qū)嶋H上會減輕癌癥或其它病癥的癥狀。經(jīng)常，甚至?xí)嵤┚哂休^低的成功概率，但是然而鑒于醫(yī)學(xué)史和估計的患者存活預(yù)期認(rèn)為誘導(dǎo)總體有益的作用過程的治療癌癥的方法。
術(shù)語“共施用”指施用所述無巖藻糖基化抗cd20和苯達(dá)莫司汀作為一種單一配制劑或者作為兩種不同配制劑。共施用可以是同時的或者以任意次序序貫的，其中優(yōu)選地，存在著所有活性劑同時施加其生物學(xué)活性的時段。同時或序貫(例如經(jīng)由靜脈內(nèi)(i.v.)經(jīng)由連續(xù)輸注(對于抗cd20抗體一次，及最終對于苯達(dá)莫司汀一次))共施用所述無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀。在序貫共施用這兩種治療劑時，在同一天在兩次分開的施用中施用劑量，或者在第1天施用藥劑之一，而在第2天至第7天，優(yōu)選地在第2天至第4天共施用第二種。如此，術(shù)語“序貫地”意指在第一組分(苯達(dá)莫司汀或抗體)的劑量后7天內(nèi)，優(yōu)選地在第一組分的劑量后4天內(nèi)；而術(shù)語“同時地”意指同時。術(shù)語“共施用”就所述無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀的維持劑量而言意指若治療周期對于這兩種藥物都是合適的，例如每周，則可以或是同時共施用維持劑量?；蛘撸?，例如每第一至第三天施用苯達(dá)莫司汀，而每周施用所述無巖藻糖基化抗體?；蛘撸谝惶靸?nèi)或在幾天內(nèi)序貫共施用維持劑量。
不證自明的是，以“治療有效量”(或僅為“有效量”)對患者施用抗體，所述治療有效量是各種化合物或組合會引發(fā)研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)醫(yī)生或其它臨床醫(yī)生尋找的組織、系統(tǒng)、動物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答的量。
所述抗cd20無巖藻糖基化的抗體和苯達(dá)莫司汀的共施用量和共施用時機會取決于所治療患者的類型(物種、性別、年齡、重量、等)和狀況和所治療疾病或狀況的嚴(yán)重性?？梢砸淮位蛟谝幌盗兄委熇飳颊哌m當(dāng)?shù)毓彩┯盟鰺o巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀。
若施用是靜脈內(nèi)的，則所述無巖藻糖基化抗cd20抗體或苯達(dá)莫司汀的初始輸注時間可以比隨后的輸注時間長，例如初始輸注為約90分鐘，而隨后的輸注為約30分鐘(若初始輸注耐受良好的話)。
根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重性，約1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)所述無巖藻糖基化抗cd20抗體和1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)苯達(dá)莫司汀是對患者共施用這兩種藥物的初始候選劑量。在一個實施方案中，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體(優(yōu)選地?zé)o巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)的優(yōu)選劑量會在約0.05mg/kg至約30mg/kg的范圍中。如此，可以對患者共施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg或30mg/kg(或其任何組合)的一劑或多劑。在一個實施方案中，苯達(dá)莫司汀的劑量會在0.01mg/kg至約30mg/kg，例如0.1mg/kg至10.0mg/kg的范圍中。根據(jù)患者的類型(物種、性別、年齡、重量、等)和狀況及無巖藻糖基化抗cd20抗體的類型，所述無巖藻糖基化抗體和苯達(dá)莫司汀的劑量和施用日程表可以有所不同，例如，可以例如每1至3周施用所述無巖藻糖基化抗cd20抗體，并且可以每天或每2至10天施用苯達(dá)莫司汀。也可以施用較高的初始加載劑量，接著是較低的一劑或多劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體(優(yōu)選地，無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)的優(yōu)選劑量會是在6周劑量周期的第1天、第8天、第15天的800至1200mg，然后是多至5個4周劑量周期的第1天的800至1200mg的劑量，而苯達(dá)莫司汀的優(yōu)選劑量會是例如在多至6個4周劑量周期的第1天和第2天(在第1天和第2天在30分鐘里靜脈內(nèi)輸注)的80mg/m2至110mg/m2(在一個實施方案中為110mg/m2，在另一個實施方案中為90mg/m2)?；蛘撸鰺o巖藻糖基化抗cd20抗體的劑量可以是在多至8個3周劑量周期的第1天的800至1200mg(例如1000mg)。
在一個實施方案中，藥物可用于預(yù)防或降低患有癌癥，優(yōu)選地表達(dá)cd20的癌癥的此類患者中的轉(zhuǎn)移或進一步散布。藥物可用于延長此類患者的存活持續(xù)時間，延長此類患者的無進展存活，延長響應(yīng)的持續(xù)時間，導(dǎo)致經(jīng)治療的患者的統(tǒng)計學(xué)顯著的且臨床上有意義的改善，如通過存活的持續(xù)時間、無進展存活、響應(yīng)率或響應(yīng)的持續(xù)時間所測量的。在一個具體的實施方案中，藥物可用于提高患者組中的響應(yīng)率。
在本發(fā)明的上下文中，可以在無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀的癌癥聯(lián)合治療中使用額外的其它細(xì)胞毒劑、化療劑或抗癌劑、或增強此類藥劑的效果的化合物(例如細(xì)胞因子)。合適地，此類分子以對于意圖的目的有效的量組合存在。在一個實施方案中，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀聯(lián)合治療不與所述額外的細(xì)胞毒劑、化療劑或抗癌劑、或增強此類藥劑的效果的化合物一起使用。
此類藥劑包括例如：烷化劑或具有烷基化作用的藥劑，諸如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)(ctx；例如
上文所描述的細(xì)胞毒劑和抗癌劑及抗增殖性靶物特異性抗癌藥物，如蛋白質(zhì)激酶抑制劑在化學(xué)療法方案中的使用一般在癌癥療法領(lǐng)域中得到充分表征，并且其在本文中的使用歸入關(guān)于監(jiān)測耐受性和效力及關(guān)于控制施用路徑和劑量的相同考慮，伴有一些調(diào)整。例如，細(xì)胞毒劑的實際劑量可以隨通過使用組織培養(yǎng)方法測定的患者的培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)答而變化。一般地，與在沒有額外的其它藥劑的情況中使用的量相比，劑量會是降低的。
有效細(xì)胞毒劑的典型劑量可以在制造商推薦的范圍中，并且在通過體外應(yīng)答或動物模型中的應(yīng)答指示的情況中，可以降低多至約一個數(shù)量級的濃度或量。如此，實際劑量會取決于內(nèi)科醫(yī)生的判斷、患者的狀況、和治療方法的效力，其基于原代培養(yǎng)的惡性細(xì)胞或組織培養(yǎng)組織樣品的體外響應(yīng)性，或合適的動物模型中觀察到的響應(yīng)。
在本發(fā)明的上下文中，在表達(dá)cd20的癌癥的無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀聯(lián)合治療外，可以實施有效量的電離輻射和/或可以使用放射性藥物。放射源可以是在所治療的患者外部或內(nèi)部。在來源在患者外部時，已知療法為外部束放射療法(ebrt)。在放射源在患者內(nèi)部時，治療稱作近程治療(bt)。本發(fā)明的上下文中使用的放射性原子可以選自下組，包括但不限于鐳、銫-137、銥-192、镅-241、金-198、鈷-57、銅-67、锝-99、碘-123、碘-131、和碘-111。也有可能用此類放射性同位素標(biāo)記抗體。優(yōu)選地，無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀聯(lián)合治療不與此類電離輻射一起使用。
放射療法是一種用于控制不可切除的或不能手術(shù)的腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)治療。已經(jīng)在組合放射療法與化學(xué)療法時看到改善的結(jié)果。放射療法基于如下的原則，即對靶區(qū)域投遞的高劑量放射會導(dǎo)致腫瘤和正常組織兩者中的生殖細(xì)胞(reproductivecell)死亡。放射劑量方案一般在放射吸收劑量(gy)、時間和分級方面限定，并且必須由腫瘤學(xué)家仔細(xì)限定?；颊呓邮艿姆派淞繒Q于各種考慮因素，但是兩項最重要的是腫瘤相對于身體的其它重要結(jié)構(gòu)或器官的位置和腫瘤已經(jīng)擴散的程度。經(jīng)歷放射療法的患者的典型治療過程會是在1至6周時段里的治療日程表，以單一每日分?jǐn)?shù)約1.8至2.0gy一周5天對患者施用10-80gy的總劑量。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，在用本發(fā)明的聯(lián)合治療和放射治療人患者中的腫瘤時存在著協(xié)同。換言之，在與放射，任選地有額外的化學(xué)治療劑或抗癌劑組合時，依靠構(gòu)成本發(fā)明的組合的藥劑對腫瘤生長的抑制得到增強。例如，輔助放射療法的參數(shù)包含在wo99/60023中。
可以依照已知的方法，諸如通過靜脈內(nèi)施用(以推注或者通過在一段時間里連續(xù)輸注)，通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、或鞘內(nèi)路徑對患者施用無巖藻糖基化抗cd20抗體。在一個實施方案中，此類抗體通過靜脈內(nèi)或皮下施用來施用。
依照已知的方法，例如通過靜脈內(nèi)施用(以推注或者通過在一段時間里連續(xù)輸注)，通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、或經(jīng)口路徑對患者施用苯達(dá)莫司汀。依照一個實施方案，通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用來施用此類抗體。
如本文中所使用的，“藥學(xué)可接受載體”意圖包括與藥學(xué)施用相容的任何和所有材料，包括溶劑、分散介質(zhì)、涂層材料、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑、和與藥學(xué)施用相容的其它材料和化合物。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或藥劑與活性化合物不相容，涵蓋其在本發(fā)明的組合物中的用途。也可以將補充的活性化合物摻入組合物中。
藥物組合物：
可以通過用藥學(xué)可接受的無機或有機載體加工依照本發(fā)明的抗cd20抗體和/或苯達(dá)莫司汀來獲得藥物組合物?？梢允褂萌樘?、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其鹽等，例如諸如片劑、包衣片劑、錠劑和硬明膠膠囊的載體。適合于軟明膠膠囊的載體是例如植物油、蠟、脂肪、半固體和液體多元醇等。然而，根據(jù)活性物質(zhì)的性質(zhì)，通常在軟明膠膠囊的情況中不需要載體。適合于生成溶液和糖漿劑的載體是例如水、多元醇、甘油、植物油等。適合于栓劑的載體是例如天然的或硬化的油、蠟、脂肪、半液體或液體多元醇等。
此外，藥物組合物可以含有防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、增甜劑、著色劑、香料、用于改變滲透壓的鹽、緩沖劑、掩蔽劑或抗氧化劑。它們也可以含有其它治療上有價值的物質(zhì)。
本發(fā)明的一個實施方案，組合物包含具有60％或更小的巖藻糖量的所述無巖藻糖基化抗cd20抗體(在一個實施方案中，所述抗體是無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)和苯達(dá)莫司汀兩者，其在治療癌癥，特別是表達(dá)cd20的癌癥中使用。
所述藥物組合物可以進一步包含一種或多種藥學(xué)可接受載體。
本發(fā)明進一步提供了特別在癌癥中使用的藥物組合物，其包含(i)第一有效量的具有60％或更小的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體(在一個實施方案中為無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)，和(ii)第二有效量的苯達(dá)莫司汀。任選地，此類組合物包含藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑。
通過將具有期望純度的抗體與任選的藥學(xué)可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(remington’spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.編(1980))混合以凍干配制劑或水溶液形式為貯存制備依照本發(fā)明使用的僅無巖藻糖基化抗cd20抗體的藥物組合物?？山邮艿妮d體、賦形劑、或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對于接收者無毒，并且包括緩沖劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、芐索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑諸如edta；糖諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反荷離子諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如，zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子型表面活性劑諸如tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。
苯達(dá)莫司汀的藥物組合物可以與上文對無巖藻糖基化抗cd20抗體描述的藥物組合物類似。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，將無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀以兩種不同配制劑配制。
活性成分還可以包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)，或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)披露于例如remington’spharmaceuticalsciences,第16版,osol,a.編(1980)。
可以制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(us3,773,919)、l-谷氨酸和l-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如luprondepottm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)、及聚-d-(-)-3-羥基丁酸。
要用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這容易通過過濾流過無菌濾膜來實現(xiàn)。
本發(fā)明進一步提供了一種用于治療癌癥的方法，包括對需要此類治療的患者施用(i)第一有效量的具有60％或更小的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體(在一個實施方案中為無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)，和(ii)第二有效量的苯達(dá)莫司汀。
在一個實施方案中，巖藻糖量是40％至60％。
優(yōu)選地，所述癌癥是表達(dá)cd20的癌癥。
優(yōu)選地，所述表達(dá)cd20的癌癥是b細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl)。
優(yōu)選地，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體是ii型抗cd20抗體。
優(yōu)選地，所述抗體是人源化b-ly1抗體。
優(yōu)選地，在6周劑量周期的第1天、第8天、第15天以800至1200mg的劑量，然后在多至5個4周劑量周期的第1天以800至1200mg的劑量施用所述人源化b-ly1抗體，并在多至6個4周劑量周期的第1天和第2天以80mg/m2至110mg/m2的劑量施用苯達(dá)莫司汀。
如本文中所使用的，術(shù)語“患者”優(yōu)選地指出于任何目的需要用無巖藻糖基化抗cd20抗體治療的人(例如，患有表達(dá)cd20的癌癥的患者)，且更優(yōu)選地需要此類治療以治療癌癥、或癌前狀況或損傷的人。然而，術(shù)語“患者”也可以指非人動物，優(yōu)選地哺乳動物諸如犬、貓、馬、牛、豬、綿羊和非人靈長類，等等。
本發(fā)明進一步包括與苯達(dá)莫司汀聯(lián)合治療癌癥的無巖藻糖基化抗cd20抗體。
本發(fā)明進一步包括在治療癌癥中使用的具有60％或更小的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀。
優(yōu)選地，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體是人源化b-ly1抗體。
優(yōu)選地，癌癥是表達(dá)cd20的癌癥，更優(yōu)選地b細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl)。
優(yōu)選地，在6周劑量周期的第1天、第8天、第15天以800至1200mg的劑量，然后在多至5個4周劑量周期的第1天以800至1200mg的劑量施用所述人源化b-ly1抗體，并在多至6個4周劑量周期的第1天和第2天以80mg/m2至110mg/m2的劑量施用苯達(dá)莫司汀。
提供以下實施例和圖以幫助理解本發(fā)明，其真正的范圍在所附權(quán)利要求書中列出。應(yīng)當(dāng)理解，可以在不背離本發(fā)明精神的前提下對列出的規(guī)程做出修飾。
序列表
seqidno:1鼠單克隆抗cd20抗體b-ly1的重鏈可變區(qū)(vh)的氨基酸序列。
seqidno:2鼠單克隆抗cd20抗體b-ly1的輕鏈可變區(qū)(vl)的氨基酸序列。
seqidno:3-19人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(qū)(vh)的氨基酸序列(b-hh2至b-hh9、b-hl8、和b-hl10至b-hl17)。
seqidno:20人源化b-ly1抗體的輕鏈可變區(qū)(vl)的氨基酸序列。b-kv1
附圖描述
圖1無巖藻糖基化ii型抗cd20抗體(b-hh6-b-kv1ge)與苯達(dá)莫司汀的聯(lián)合治療的體內(nèi)抗腫瘤活性(與利妥昔單抗(巖藻糖基化i型抗cd20抗體)與苯達(dá)莫司汀的組合相比及與各種單一療法相比)。
實施例
實驗規(guī)程
ii型抗cd20抗體(b-hh6-b-kv1ge)與苯達(dá)莫司汀的聯(lián)合治療的抗腫瘤活性
測試劑
無巖藻糖基化抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge(無巖藻糖基化的人源化b-ly1，糖工程化改造的b-hh6-b-kv1，參見wo2005/044859和wo2007/031875)以來自glycart,schlieren,switzerland的儲備溶液(9.4mg/ml)提供?？贵w緩沖液包含組氨酸、海藻糖和聚山梨酯20。自儲液將抗體溶液在pbs中適當(dāng)稀釋，用于在先注射。
臨床級利妥昔單抗(mabthera)獲自hoffmannlaroche,basel。
苯達(dá)莫司汀
細(xì)胞系和培養(yǎng)條件
將人z138套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系在補充有10％胎牛血清(paalaboratories,austria)和2mml-谷氨酰胺的dmem中于37℃在水飽和氣氛中于8％co2常規(guī)培養(yǎng)。使用傳代4來移植。將細(xì)胞與matrigel共注射。
動物
將雌性scid米色小鼠；到達(dá)時年齡為3-4周(購自charlesriver,sulzfeld,germany)在無特定病原體的條件下以12小時光照/12小時黑暗的日周期依照約定的準(zhǔn)則(gv-solas；felasa；tierschg)維持。實驗研究方案得到地方政府審閱并批準(zhǔn)。到達(dá)后，將動物在動物房的檢疫部分維持1周以習(xí)慣于新的環(huán)境及觀察。定期實施連續(xù)健康監(jiān)測。飲食食物(provimikliba3337)和水(酸化的ph2.5-3)任意提供。
監(jiān)測
每天對動物控制臨床癥狀和不利作用的檢測。對于貫穿整個實驗的監(jiān)測，每周兩次記錄動物的體重，并在分期后通過測徑器測量腫瘤體積。
動物的處理
動物處理在腫瘤細(xì)胞接種后19天的隨機化當(dāng)天開始。在研究第19天和第26天以指定劑量1mg/kgi.p.q7d以單一藥劑施用人源化的無巖藻糖基化抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge或利妥昔單抗。在同一天施用相應(yīng)的媒介物。在第19天、第20天、第21天和第22天以3mg/kgi.p.給予苯達(dá)莫司汀。在聯(lián)合療法組中，在第19天在這兩種抗體后8小時施用化療劑。
體內(nèi)腫瘤生長抑制研究
在腫瘤細(xì)胞接種后第33天在實驗結(jié)束時，與對照組相比，給予利妥昔單抗、抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge、利妥昔單抗和苯達(dá)莫司汀組合、或抗cd20抗體和苯達(dá)莫司汀組合的動物中分別有如表1中給出的腫瘤生長抑制(tgi)。僅用苯達(dá)莫司汀的處理在本實驗中沒有顯示任何抗腫瘤活性。
通過比較抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge/苯達(dá)莫司汀組合組與僅抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge的處理，存在著大于疊加的效應(yīng)。
統(tǒng)計學(xué)評估
在第33天終止研究。統(tǒng)計學(xué)評估基于sauc。與媒介物組(組1)相比，腫瘤生長在組2(b-hh6-b-kv1ge，1mg/kg，一周一次，i.p.)中(以tcr為0.72(ci0.59-0.86)指示)、在組3(利妥昔單抗，1mg/kg，一周一次，i.p.)中(以tcr為0.78(ci0.65-0.93)指示)、在組5(b-hh6-b-kv1ge，1mg/kg，一周一次，i.p.，與苯達(dá)莫司汀組合，3mg/kg，研究日19-22，i.p.)中(以tcr為0.46(ci0.34-0.59)指示)及在組6(利妥昔單抗，1mg/kg，一周一次，i.p.，與苯達(dá)莫司汀組合，3mg/kg，研究日19-22，i.p.)中(以tcr為0.67(ci0.54-0.81)指示)受到統(tǒng)計學(xué)顯著抑制。在研究結(jié)束時，組4(苯達(dá)莫司汀，3mg/kg，研究日19-22，i.p.)顯示與對照組相當(dāng)?shù)哪[瘤生長。
通過tukey-kramer檢驗(p<0.001)分析，與單一處理相比，b-hh6-b-kv1ge與苯達(dá)莫司汀的組合對腫瘤生長抑制顯示大于疊加的(協(xié)同的)且統(tǒng)計學(xué)顯著的影響(參見表1和圖1)。
表1：基于sauc和tgi(％)的參數(shù)tcr及低的和高的置信區(qū)間(ci)
序列表
<110>羅切格利卡特公司(rocheglycartag)
<120>無巖藻糖基化cd20抗體與苯達(dá)莫司汀的聯(lián)合療法
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