本發(fā)明涉及低酯果膠在防治或輔助治療糖尿病中的應(yīng)用，屬于型糖尿病的預(yù)防和治療技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時(shí)長(zhǎng)期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。所以，控制患者血糖穩(wěn)定變得尤為重要。

2型糖尿病占糖尿病患者90％以上。患者多在35～40歲之后發(fā)病。2型糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的能力并非完全喪失，有的患者體內(nèi)胰島素甚至產(chǎn)生過多，但胰島素的作用效果較差，因此患者體內(nèi)的胰島素是一種相對(duì)缺乏，可以通過某些口服藥物刺激體內(nèi)胰島素的分泌。但到后期仍有一些病人需要使用胰島素治療。目前主要的治療方案有1)口服降糖類藥物如：雙胍類、磺脲類、噻唑烷二酮類等；2)以皮下注射方式胰島素類藥物；3)通過控制飲食和運(yùn)動(dòng)，也能對(duì)2型糖尿病有一定的緩解作用。

1型糖尿病(t1d)是由t淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，以選擇性攻擊破壞胰島β細(xì)胞為特征的器官特異性自身免疫性疾病。而胰島β細(xì)胞是唯一能產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞，在維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)中起著極為重要的作用。所以胰島素缺乏就會(huì)導(dǎo)致患者血糖代謝紊亂，一旦發(fā)病，患者就需要使用外源胰島素，因此1型糖尿病也同樣被稱為胰島素依賴性糖尿病或者自身免疫性糖尿病。其具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。非肥胖性糖尿病(non-obesediabetic，nod)小鼠是1型糖尿病的動(dòng)物模型，80％的雌性nod小鼠在出生12周后發(fā)生自發(fā)性糖尿病。其自發(fā)糖尿病的病理過程和人類1型糖尿病的病理過程極為相似，因此目前對(duì)于1型糖尿病的諸多理論上的認(rèn)識(shí)，均來自于對(duì)nod小鼠的研究結(jié)果。如何有效的防治該疾病發(fā)生變得尤為重要。目前的治療的手段有胰島素及其他藥物治療，胰島移植，免疫療法等。

同時(shí)，有研究表明，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，無論1型還是2型糖尿病，都伴隨著不同程度的腸道損傷例如腸道緊密鏈接蛋白表達(dá)下降，腸道通透性上升。腸道中的有害微生物透過患者腸道屏障進(jìn)入體內(nèi)，對(duì)糖尿病患者身體健康造成了很大危害。近年來，通過調(diào)節(jié)腸道部位的局部免疫、增強(qiáng)腸道屏障，減少有害微生物進(jìn)入人體成為預(yù)防多種高血糖癥的研究熱點(diǎn)。

果膠是一種高分子聚半乳糖醛酸多糖，是植物細(xì)胞壁的一種成分。果膠具有良好的乳化、增稠、穩(wěn)定和凝膠作用，在食品，紡織，冶金，煙草等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，果膠還有抗菌，抗炎，降血脂，抗輻射，抗癌等生物活性。果膠的酯化度(de)即指果膠半乳糖醛酸殘基被一些基團(tuán)酯化。酯化度指果膠中甲酯化，乙?；王０坊壤目偤??？梢詫⒐z分為2類：高酯果膠(hmp，de＞50％)、低酯果膠(lmp，de＜50％)。根據(jù)果膠酯化度的不同分別在食品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用于果凍，果醬，冰淇淋，果糖，乳制品等多數(shù)食品的生產(chǎn)上。據(jù)報(bào)告，nankathrynfuchs等發(fā)現(xiàn)果膠的抗癌性質(zhì)存在于低酯化度果膠中，尤其是當(dāng)果膠酯化度<10％以下。poppvsv等也發(fā)現(xiàn)柑橘果膠具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抗炎癥作用。salmanh等研究發(fā)現(xiàn)柑橘果膠能夠調(diào)節(jié)外周血單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。另外，果膠在腸道被宿主微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物如短鏈脂肪酸等能夠調(diào)節(jié)腸道部位的免疫細(xì)胞，同時(shí)也能改善腸道絨毛形態(tài)，增強(qiáng)腸道屏障，提高宿主對(duì)病原菌的抵抗能力。尋找更多能夠治療/輔助治療/預(yù)防糖尿病的藥物或者食品，對(duì)于糖尿病的發(fā)病機(jī)制并開發(fā)相應(yīng)的預(yù)防和治療方法尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明證明了低酯果膠對(duì)高血糖引起的疾病，包括糖尿病，尤其是nod小鼠發(fā)揮保護(hù)作用，并減少胰島浸潤(rùn)程度。本發(fā)明涉及的低酯果膠，在安全劑量范圍內(nèi)對(duì)nod小鼠發(fā)揮保護(hù)作用，降低胰島浸潤(rùn)程度，可作為有效成分添加到防治1型糖尿病的膳食中。

本發(fā)明中的低酯果膠，是指酯化度(de)＜50％的果膠，例如酯化度為7％的果膠。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療糖尿病的藥物或者藥物組合物，所述藥物或者藥物組合物以低酯果膠作為主要有效成分。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物或者藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的賦型劑。所述藥學(xué)上可接受的賦型劑是指任何可用于藥學(xué)領(lǐng)域的稀釋劑、輔助劑和/或載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的低酯果膠可以與其他活性成分組合使用，只要它們不產(chǎn)生其他不利的作用，例如過敏反應(yīng)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物或者藥物組合物可配制成若干種劑型，其中含有藥學(xué)領(lǐng)域中常用的一些賦形劑；例如，口服制劑(如片劑，膠囊劑，溶液或混懸液)；可注射的制劑(如可注射的溶液或混懸液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制劑(例如軟膏或溶液)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，用于本發(fā)明藥物組合物的載體是藥學(xué)領(lǐng)域中可得到的常見類型，包括：口服制劑用的粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、無色素、矯味劑等；可注射制劑用的防腐劑、加溶劑、穩(wěn)定劑等；局部制劑用的基質(zhì)、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑等。藥物制劑可以經(jīng)口服或胃腸外方式(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或局部)給藥，如果某些藥物在胃部條件下是不穩(wěn)定的，可將其配制成腸衣片劑。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療糖尿病的食品或者飼料，所述食品或者飼料以低酯果膠作為主要有效成分。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述食品包括保健食品、飲品、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑等。

本發(fā)明本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種降低糖尿病發(fā)病率的制劑，所述制劑是以有效劑量的低酯果膠作為主要活性成分。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種減少糖尿病胰島細(xì)胞免疫浸潤(rùn)程度的制劑，所述制劑是以有效劑量的低酯果膠作為主要活性成分。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種降低胰腺組織中促炎癥因子tnf-α，il-1β，il-6，提高抗炎癥因子tgf-β表達(dá)水平的制劑，所述制劑是以有效劑量的低酯果膠作為主要活性成分。

本發(fā)明的制劑是指藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑等。

發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種提高腸道緊密鏈接蛋白zo-2、claudin-1表達(dá)水平的制劑，所述制劑是以有效劑量的低酯果膠作為主要活性成分。

發(fā)明的第七個(gè)目的是提供一種提高胰腺組織中起到免疫抑制作用的免疫細(xì)胞比例，所述制劑是以有效劑量的低酯果膠作為主要活性成分。

發(fā)明的第八個(gè)目的是提供一種降低胰腺組織中起到促進(jìn)免疫作用的免疫細(xì)胞比例，所述制劑是以有效劑量的低酯果膠作為主要活性成分。

發(fā)明的第九個(gè)目的是提供低酯果膠的新應(yīng)用。所述應(yīng)用，是制備預(yù)防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療糖尿病的藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是制備降低糖尿病發(fā)病率，或者降低胰島免疫浸潤(rùn)，或者降低胰腺組織中促炎癥因子tnf-α和/或il-1β和/或il-6表達(dá)水平的藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是制備提高胰腺組織中抗炎癥因子tgf-β表達(dá)水平的藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是制備降低促進(jìn)免疫細(xì)胞比例，提高抑制免疫細(xì)胞比例的藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明對(duì)1型糖尿病自發(fā)模型鼠進(jìn)行為期22周的低酯果膠喂飼的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有顯著的保護(hù)作用，可作為有效的成分添加到防治1型糖尿病的藥物當(dāng)中，降低臨床上1型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

本發(fā)明通過低酯果膠對(duì)1型糖尿病模型小鼠進(jìn)行預(yù)防性處理，對(duì)其胰腺組織及胰島周圍進(jìn)行病理組織形態(tài)觀察，小鼠胰腺組織促炎性細(xì)胞因子tnfα，il1-β，il-6，抗炎性因子tgf-β進(jìn)行測(cè)定。比較低酯果膠處理組與正常膳食小鼠的各個(gè)指標(biāo)水平，低酯果膠處理組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)顯著優(yōu)于正常膳食組。

附圖說明

圖1是給1型糖尿病模型小鼠喂飼正常膳食和5％低酯果膠飼料膳食，監(jiān)測(cè)小鼠發(fā)病率(圖1a)，在22周時(shí)處死小鼠對(duì)胰腺的胰島部位進(jìn)行病理學(xué)觀察和分析(圖1b)，對(duì)小鼠胰島免疫浸潤(rùn)進(jìn)行評(píng)分(圖1c)；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

圖2是用實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)，小鼠胰腺部位促炎癥因子(tnf-α,il-1β,il-6)及抗炎因子(tgf-β)；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

圖3是用實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)，小鼠胰腺部位促進(jìn)炎癥致糖尿病t細(xì)胞(a)的相對(duì)變化量(cd8⁺,ifn-γ⁺)及具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(b)相對(duì)表達(dá)量(cd4⁺cd25⁺foxp3⁺)；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

圖4是用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，小鼠胰腺(a)，胰腺淋巴結(jié)(b)，腸系膜淋巴結(jié)(c)中具有免疫抑制性t細(xì)胞(treg)占總t細(xì)胞的比例；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

圖5是用蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)，小鼠盲腸部位緊密鏈接蛋白zo-2，claudin-1的蛋白表達(dá)水平，選取了管家基因gapdh作為參照。

具體實(shí)施方案

下面是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實(shí)施例1.低酯果膠降低nod小鼠血糖及發(fā)病率

將雌性nod小鼠等分為兩組，其中一組為正常飼料喂飼，另一組為5％(低酯果膠質(zhì)量g/飼料總重g，低酯果膠是獲自荷蘭格羅寧根大學(xué)devos,paul教授的酯化度為7的低酯果膠)低酯果膠飼料喂飼。從第十周起對(duì)兩組nod小鼠進(jìn)行血糖測(cè)量。具體操作為將小鼠禁食12小時(shí)后，將羅氏活力型血糖試紙插入對(duì)應(yīng)血糖儀中，待出現(xiàn)滴上血液樣本的時(shí)候?qū)⑿∈笪膊棵?xì)管血液樣本滴在試紙上，等待5秒鐘，讀取血糖值。當(dāng)血糖值大于14.4mmol/l定義為發(fā)病小鼠。用kaplan-meier統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)小鼠發(fā)病率。經(jīng)過22周的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，低酯果膠處理組小鼠血糖下降明顯且發(fā)病率較正常膳食組下降35％(圖1a)。

實(shí)施例2.低酯果膠顯著減少nod小鼠胰島細(xì)胞免疫浸潤(rùn)

用he染色的方法，將正常膳食組和低酯果膠處理組的胰腺經(jīng)固定、脫水、染色、脫蠟、透明和封片等主要過程，觀察胰島炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。如圖1b，結(jié)果顯示，正常膳食組炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯，而低酯果膠處理組有明顯改善作用并且對(duì)同組多個(gè)胰島進(jìn)行胰島炎評(píng)級(jí)發(fā)現(xiàn)正常膳食組胰島炎評(píng)分顯著高于低酯果膠處理組。胰島炎評(píng)級(jí)原則：沒有胰島炎癥為0，輕微浸潤(rùn)為1，浸潤(rùn)程度小于50％為2，浸潤(rùn)程度大于50％為3(圖1b和c)。

實(shí)施例3.低酯果膠顯著降低nod小鼠胰腺部位促炎因子的表達(dá)

在nod小鼠中，tnf-α，il-1β及il-6是促炎因子。nod小鼠發(fā)病前體內(nèi)炎癥水平就已經(jīng)高于同齡c57等品系小鼠。當(dāng)nod小鼠發(fā)病期間炎癥因子劇烈釋放并且三者之間協(xié)同刺激加重nod小鼠炎癥水平。

采用qpcr方法對(duì)促炎因子進(jìn)行定量，首先把小鼠胰腺組織放在液氮中研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移到trizol中劇烈混勻，加入氯仿劇烈震蕩，高速離心后取上清。加入等體積的異丙醇沉淀上清中的rna，高速離心，用75％的乙醇洗滌一遍rna后，用depc水溶解rna，取2000ngrna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，得到cdna進(jìn)行qpcr，使用2^-^△△ct進(jìn)行運(yùn)算得到目的基因的變化量。發(fā)現(xiàn)低酯果膠處理組較正常膳食組tnf-α下降48％，il-1β下降58％及il-6下降44％(圖2)。

實(shí)施例4.低酯果膠顯著提高nod小鼠胰腺部位抗炎因子的表達(dá)

在nod小鼠中，tgf-β是抗炎因子。在胰腺部位能夠提高tgf-β的表達(dá)量能夠?qū)od小鼠起到保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)低酯果膠處理組較正常膳食組tgf-β上升31％(圖2)。

實(shí)施例5.低酯果膠顯著提高nod小鼠胰腺部位起到抑制免疫作用的免疫細(xì)胞比例

據(jù)報(bào)道，調(diào)節(jié)性t細(xì)胞能夠保護(hù)nod小鼠降低發(fā)病率。調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表面標(biāo)記物有cd4，cd25，foxp3。通過定量pcr實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)低酯果膠處理組nod小鼠中的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表面標(biāo)記物顯著高于正常膳食組(圖3)。

實(shí)施例6.低酯果膠顯著降低nod小鼠胰腺部位起到促進(jìn)免疫作用的免疫細(xì)胞比例

普遍認(rèn)為，cd8⁺、ifn-γ⁺細(xì)胞能夠識(shí)別胰島β細(xì)胞上特異性蛋白igrp206-214并特異性的攻擊β細(xì)胞導(dǎo)致β細(xì)胞受損，所以降低此類致糖尿病cd8⁺t細(xì)胞能夠有效緩解1型糖尿病。通過定量pcr實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)低酯果膠處理組nod小鼠中此類t細(xì)胞表面標(biāo)記物顯著低于正常膳食組(圖3)。

實(shí)施例7.低酯果膠顯著提高nod小鼠胰腺、胰腺淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)中起到促進(jìn)免疫作用的免疫細(xì)胞比例

本實(shí)施例，使用流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確描述了小鼠胰腺、胰腺淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性t細(xì)胞含量。我們發(fā)現(xiàn)低酯果膠處理組nod小鼠三個(gè)部位中的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞含量都有不同程度的顯著上升現(xiàn)象(分別為圖4a、b及c)。

實(shí)施例8.低酯果膠顯著提高nod小鼠盲腸緊密鏈接蛋白zo2，claudin1的表達(dá)量

本實(shí)施例，使用蛋白免疫印跡的方法測(cè)定了小鼠盲腸緊密鏈接蛋白zo-2，claudin-1的蛋白表達(dá)量(上樣、跑膠條件相同)。我們發(fā)現(xiàn)低酯果膠處理組nod小鼠的盲腸部位的緊密鏈接蛋白有顯著上調(diào)的現(xiàn)象(圖5)。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。