本發(fā)明涉及一種治療脂肪肝的藥物組合物及其制備方法和用途，屬中藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)是一種與胰島素抵抗(insulinresistance，ir)和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，其病理學(xué)改變與酒精性肝病(alcoholicfattyliverdisease，ald)相似，但患者無(wú)過(guò)量飲酒史，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholicfattyliver，nafl)、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，nash)及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)。隨著生活水平的提高，生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，nafld發(fā)病率不斷提升，已經(jīng)逐漸成為全球重要公共健康問(wèn)題之一。

調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在西方國(guó)家nafld是慢性肝病最常見(jiàn)病因，總體流行率在25％左右，在肥胖人群和2型糖尿病患者中比例則增加至70％。在我國(guó)的流行病學(xué)調(diào)查也不樂(lè)觀，nafld發(fā)病率高達(dá)20.7％，近年來(lái)其患病率、發(fā)病率是在人群當(dāng)中不斷增高，且發(fā)病年齡也出現(xiàn)低齡化趨勢(shì)。目前，在中國(guó)肥胖和代謝綜合征的流行，nafld已經(jīng)取代了慢性乙型肝炎成為第一大慢性肝臟疾病。就nafld的危害來(lái)講，其與酒精性肝病、病毒性肝病相似，可以通過(guò)肝臟炎癥，進(jìn)而發(fā)生肝硬化、肝癌，甚至肝功能衰竭。但相對(duì)來(lái)說(shuō)，nafld發(fā)生肝硬化、肝細(xì)胞癌的幾率相對(duì)較低；此外，從脂肪性肝炎到肝硬化、肝癌這樣一個(gè)過(guò)程來(lái)講，nafld比病毒性肝炎所需要的時(shí)間長(zhǎng)。但是在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，特別是在美國(guó)來(lái)講，nafld引起的肝臟移植排位已經(jīng)排在第二，僅次于慢性丙型肝炎；而在hcc病因當(dāng)中，nafld增長(zhǎng)率迅速上升，目前似乎已經(jīng)取代了酒精性肝病，成為第二大原因。因此針對(duì)nafld的發(fā)病機(jī)制和藥物治療的研究具有非常重要的意義。

目前針對(duì)nafld治療尚無(wú)特異性的手段和藥物。治療主要包括基礎(chǔ)治療和藥物治療?；A(chǔ)治療是改善生活方式，如控制飲食，加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)鍛煉從而降低體重。藥物治療包括有五大類(lèi)：(1)改善胰島素抵抗藥物：常用藥物為胰島素增敏劑，包括以二甲雙胍為代表的雙胍類(lèi)藥物及以羅格列酮、吡格列酮為代表的噻唑烷二酮類(lèi)；(2)降脂藥：以貝特類(lèi)和他汀類(lèi)為代表，他汀類(lèi)主要用于降tc和ldl-c，貝特類(lèi)主要用于以tg升高為主的高脂血癥；(3)保肝抗炎藥：甘草類(lèi)制劑通過(guò)其類(lèi)固醇作用發(fā)揮其強(qiáng)大保肝抗炎作用，多烯磷脂酰膽堿膠囊通過(guò)特異性地與肝細(xì)胞膜結(jié)合，穩(wěn)定、保護(hù)、修復(fù)肝細(xì)胞膜，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，如熊去氧膽酸，通過(guò)阻止細(xì)胞凋亡和抑制炎性反應(yīng)起作用；(4)抗氧化劑：如維生素e，通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和自由基的抗氧化劑水平降低，達(dá)到延緩nafld進(jìn)展到nash的進(jìn)程；(5)微生態(tài)制劑：腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)可產(chǎn)生內(nèi)源性酒精、釋放內(nèi)毒素、刺激炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生參與nafld的損傷。但是這些藥物都有一定的副作用：如噻唑烷二酮類(lèi)及降脂藥物有一定的肝損傷作用，且降脂藥物停藥可反彈，并且不能有效改善肝內(nèi)脂質(zhì)沉積；雙胍類(lèi)有引起乳酸性酸中毒的風(fēng)險(xiǎn)等。所以目前尚沒(méi)有一種藥物獲批用于nafld的治療。

單純依靠保肝抗炎藥物、降脂藥、改善胰島素抵抗藥物治療nafld的效果并不理想，且療效單一，存在不同的毒性和不良反應(yīng)。與西醫(yī)相較，中醫(yī)藥具有多途徑、多角度、多層次、多靶點(diǎn)綜合藥理作用的特點(diǎn)，中藥治療nafld有明顯的優(yōu)勢(shì)，主要在于中藥便于指定個(gè)體化治療方案，比單純的降脂、保肝治療方案更加有效?？捎糜谥委焠afld的中藥復(fù)方或者單位中藥種類(lèi)多，安全程度高，且在防治nafld方面療效穩(wěn)定持久，毒副作用小，價(jià)格低廉。

目前治療脂肪肝的中藥報(bào)道較多，如：鐘燕春，中醫(yī)藥治療脂肪肝進(jìn)展，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008年2月第10卷第2期，根據(jù)中醫(yī)對(duì)脂肪肝的病因病機(jī)、辯證分型治療，公開(kāi)了多種不同的處方，目前中醫(yī)藥治療本病還存在許多問(wèn)題，如中醫(yī)診斷、辨證分型、判斷標(biāo)準(zhǔn)及療效判定標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，客觀指標(biāo)不明確，遠(yuǎn)期療效觀察少，缺乏大樣本、多中心的嚴(yán)格隨機(jī)對(duì)照研究，在治療機(jī)制和藥理作用環(huán)節(jié)方面研究很少，需要不斷完善并確定統(tǒng)一脂肪肝治療的辨證分型、診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效判定標(biāo)準(zhǔn)以及量化客觀指標(biāo)，對(duì)中醫(yī)藥作用機(jī)理進(jìn)行廣泛而科學(xué)的研究，為臨床治療本病提供可靠有效的證據(jù)。專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺篶n201310305337.9，發(fā)明名稱(chēng)：一種治療脂肪肝的中藥組合物及其制備方法，該發(fā)明公開(kāi)了一種治療脂肪肝的中藥組合物及其制備方法，由如下原料藥按一定的重量配比制成：麥芽、茯苓、白術(shù)、何首烏、澤瀉、黃精、黃芪、丹參、虎杖、荷葉、赤芍、蒼術(shù)、寄生、巴戟天、川楝子、當(dāng)歸、柴胡、決明子、法半夏、黃連、牡丹皮、青皮、枳實(shí)、黨參、陳皮、郁金、甘草、三棱、莪術(shù)，該組方具有疏肝理氣、活血化瘀、消食化積的功能，該申請(qǐng)公開(kāi)的處方原料用量多，不利于臨床使用和工業(yè)化大生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新的治療脂肪肝的中藥藥物組合物。本發(fā)明的另一目的是提供了該藥物組合物的其制備方法和用途。

本發(fā)明治療脂肪肝的藥物組合物，它是由下述重量配比的原料制備而成的制劑：

淫羊藿10-12.5份、黃芪15-20份、茯苓5-7.5份、白術(shù)5-7.5份、澤瀉7.5-10份、陳皮7.5-10份、半夏7.5-10份、生山楂15-20份、丹參15-20份。

優(yōu)選地，它是由下述重量配比的原料制備而成的制劑：

淫羊藿10份、黃芪15份、茯苓7.5份、白術(shù)7.5份、澤瀉10份、陳皮10份、半夏7.5份、生山楂15份、丹參15份。

其中，所述藥物組合物是由所述原料藥的原生藥粉或者水或有機(jī)溶劑提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。

優(yōu)選地，所述制劑為口服制劑。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述口服制劑為所述的制劑是顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液。

本發(fā)明還提供了前述藥物組合物的制備方法，它包括如下操作步驟：

(1)稱(chēng)取各重量配比的原料；

(2)打粉、或加入水或有機(jī)溶劑提取，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。

本發(fā)明還提供了前述藥物組合物在制備治療脂肪肝的藥物中的用途。其中，所述的藥物是治療非酒精性脂肪肝的藥物。

本發(fā)明還提供了所述的藥物組合物在制備預(yù)防肝纖維化的藥物中的用途。

本發(fā)明還提供了前述藥物組合物在制備具有溫陽(yáng)健脾，祛濕化痰的藥物中的用途。

肥胖陽(yáng)虛、痰濕阻滯型非酒精性脂肪肝是臨床常見(jiàn)證型，發(fā)病人群廣、病源基數(shù)大，嚴(yán)重威脅人民群眾的身體健康，中醫(yī)臨床尚缺乏直接針對(duì)該證型的可靠藥物。依據(jù)該證型的病因病機(jī)特點(diǎn)，提出“脾虛濕滯，痰瘀互結(jié)”的病機(jī)學(xué)說(shuō)，以“溫陽(yáng)健脾，祛痰散瘀”為基本治則。本發(fā)明藥物原料組方中黃芪補(bǔ)益脾氣助脾升清陽(yáng)；淫羊藿溫陽(yáng)化氣，補(bǔ)腎壯陽(yáng)，祛風(fēng)除濕；白術(shù)、茯苓，白術(shù)甘溫補(bǔ)中，補(bǔ)脾燥濕，益氣生血，和中消滯；茯苓甘淡滲利，健脾補(bǔ)中，利水滲濕，二藥伍用，一健一滲，水濕則有出路，故脾可健、濕可除；薏苡仁利水滲濕，健脾；澤瀉利水滲濕；陳皮、半夏，陳皮理氣健脾，和胃化痰，半夏燥濕化痰，消痞散結(jié)，健脾止嘔，二者均入脾經(jīng)，兩藥參合，相互促進(jìn)，故脾可健、濕可去、痰自消，氣機(jī)通暢；生山楂性味酸甘，長(zhǎng)于消積化滯，主治肉食積滯，長(zhǎng)于行氣散瘀止痛；丹參活血祛瘀。首重益氣健脾，溫煦脾陽(yáng)，兼以祛痰散瘀。

本發(fā)明藥物組合物，配伍精當(dāng)，各藥味相輔相成，對(duì)脂肪肝的療效明確，毒副作用小，為臨床治療脂肪肝提供了一種新的選擇。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1.油紅o染色結(jié)果。a.中藥高劑量組，b.中劑量組，c.低劑量組，d.陽(yáng)性藥組，e.模型組，f.空白組

圖2.qpcr結(jié)果。a.tlr4，b.nf-κb，c.tgf-β1，d.smad3

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：本發(fā)明藥物的制備

取淫羊藿10g、黃芪15g、茯苓7.5g、白術(shù)7.5g、澤瀉10g、陳皮10g、半夏7.5g、生山楂15g、丹參15g，加入10倍量水，浸泡過(guò)夜，補(bǔ)足吸水量，煎煮3次，每次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，即得。

用法與用量：口服，一日一劑，一日3次。

實(shí)施例2：本發(fā)明藥物顆粒劑的制備

取淫羊藿10g、黃芪15g、茯苓7.5g、白術(shù)7.5g、澤瀉10g、陳皮10g、半夏7.5g、生山楂15g、丹參15g，加入10倍量水，浸泡過(guò)夜，補(bǔ)足吸水量，煎煮3次，每次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，濾液減壓濃縮成相對(duì)密度為1.25(60℃)的浸膏；浸膏與3倍量糊精混合，制備軟材，搖擺式制粒機(jī)制粒，60℃干燥0.5h，整粒，篩除細(xì)小顆粒，包裝，即得。

實(shí)施例3：本發(fā)明藥物片劑的制備

取淫羊藿10g、黃芪15g、茯苓7.5g、白術(shù)7.5g、澤瀉10g、陳皮10g、半夏7.5g、生山楂15g、丹參15g，加入10倍量水，浸泡過(guò)夜，補(bǔ)足吸水量，煎煮3次，每次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，濾液減壓濃縮成相對(duì)密度為1.25(60℃)的浸膏；浸膏與3倍量糊精混合，制備軟材，搖擺式制粒機(jī)制粒，60℃干燥0.5h，單沖壓片機(jī)壓片，制備大小為0.3g的片劑，即得。

以下通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。

試驗(yàn)例1本發(fā)明藥物含藥血清對(duì)非酒精性脂肪性肝病的細(xì)胞藥效學(xué)及其機(jī)制研究

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器與試藥

co2培養(yǎng)箱(美國(guó)nuare公司)，超凈工作臺(tái)(濟(jì)南卓奧)，倒置顯微鏡(日本olympus公司)，臺(tái)式低速離心機(jī)(美國(guó)thermo公司)，超聲細(xì)胞破碎儀(南京星辰科技有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)thermo公司)，美國(guó)thermo公司(浙江賽德)，abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀(abi7500)。

dmem培養(yǎng)基(美國(guó)gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰酶(美國(guó)gibco公司)，油酸(美國(guó)mp公司)，油紅o(美國(guó)sigma公司)，甘油三酯(tg)測(cè)定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，m-mlvfriststandcdnasynthesiskit(omega公司)，sybrgreenpcrmastermix試劑盒(appliedbiosystems公司)，tirzol(ambion公司)，肝癌細(xì)胞株hepg2(來(lái)源于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù))。多烯磷脂酰膽堿膠囊(228mg*24粒，賽諾菲制藥有限公司)，購(gòu)于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性wistar大鼠70只，體重200±20g，由四川簡(jiǎn)陽(yáng)達(dá)碩生物公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：scxk(川)2008-011。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1本發(fā)明藥物含藥血清的制備

雄性wistar大鼠70只隨機(jī)分為5組，即中藥高劑量、中藥中劑量、中藥低劑量、陽(yáng)性對(duì)照組(多烯磷脂酰膽堿膠囊組)、空白組，每組14只。根據(jù)人與大鼠體表面積折算法，給予本發(fā)明藥物(實(shí)施例1制備)高、中、低劑量組分別灌胃18.8g/kg、9.4g/kg、4.7g/kg，陽(yáng)性對(duì)照組122.14mg/kg，每日藥量分兩次灌胃，間隔8h，空白組給予等體積蒸餾水，連續(xù)7天。末次給藥1小時(shí)后，大鼠腹主動(dòng)脈取血，靜置，離心，得含藥血清。

2.2hepg2細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將hepg2細(xì)胞以1×10⁵個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板中成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。待細(xì)胞長(zhǎng)至70-80％，棄掉原有培養(yǎng)液，加適量pbs緩沖液洗兩遍。

實(shí)驗(yàn)分6組：

空白組：加入普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；

模型組：加入含0.25mm油酸的培養(yǎng)基。

陽(yáng)性藥物組：在含0.25mm油酸的培養(yǎng)液中加入10％的陽(yáng)性藥物含藥血清。

中藥高、中、低劑量組：在含0.25mm油酸的培養(yǎng)液中加入10％的中藥高、中、低劑量的含藥血清。

2.3油紅o染色

按實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)24h，吸棄培養(yǎng)基，pbs清洗3次，4％多聚甲醛固定30min，pbs清洗2次，加入60％異丙醇同步化液，油紅o工作液避光孵育30min，60％異丙醇進(jìn)行分色約30s至背景色全無(wú)，ddh2o洗3min，蘇木素復(fù)染3-5min，ddh2o洗3次，每次2min，ddh2o液封，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞脂滴情況，取不同倍數(shù)不同視野拍照。

2.4細(xì)胞內(nèi)tg/蛋白含量的測(cè)定

按實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，吸棄培養(yǎng)基，pbs清洗3次，加入200μl0.25％胰酶消化，吸掉胰酶，加入適量含10％fbs的dmem重懸細(xì)胞，離心，加入1ml細(xì)胞裂解液于超聲細(xì)胞破碎儀下破碎，置于冰上孵育20min，離心取上清液。按照bca蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白含量，按照甘油三酯試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)tg含量。

根據(jù)公式計(jì)算：細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量(mmol/gprot)＝(樣本od值－空白o(hù)d值)/(標(biāo)準(zhǔn)od值－空白o(hù)d值)×校準(zhǔn)品濃度(2.26mmol/l)÷待測(cè)樣本蛋白濃度(gprot/l)

2.5qpcr法檢測(cè)hepg2細(xì)胞中目的基因(tlr4、nf-κb、tgf-β1和smad3)在mrna水平的表達(dá)

收集孔板中各組細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后收集上清液，采用trizol試劑提取rna，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)和sybrrgreenpcrmastermix試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞中tlr4、nf-κb、tgf-β1、smad3在mrna水平的表達(dá)量。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用spss21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊性，故采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較空白組與模型組的均數(shù)，p＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1各組細(xì)胞藥物干預(yù)24h后hepg2細(xì)胞油紅o染色結(jié)果

空白組細(xì)胞邊緣清晰，胞漿豐富，核膜完整，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯紅色脂滴；模型組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)很多大小不等的紅色脂滴，脂肪變嚴(yán)重部分甚至融合成片；陽(yáng)性藥組、中藥高、中、低劑量組中細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)不同程度的紅色脂滴顆粒。與模型組相比較，中藥低中高劑量及陽(yáng)性藥組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴顆粒減少。

4.2細(xì)胞內(nèi)tg/蛋白含量結(jié)果

與空白組比較，模型組細(xì)胞tg含量明顯升高，p＜0.01，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與模型組相比，中藥高中低劑量組細(xì)胞中tg含量有所降低，p＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陽(yáng)性藥組細(xì)胞中tg含量明顯降低，p＜0.01，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1tg/蛋白含量

注：與空白組比較*p＜0.05，**p＜0.01；與模型組相比較^#p＜0.05，^##p＜0.01

4.3qpcr法檢測(cè)hepg2細(xì)胞中目的基因(tlr4、nf-κb、tgf-β1和smad3)在mrna水平的表達(dá)結(jié)果

和空白組相比，模型組目的基因tlr4、nf-κb、tgf-β1、smad3在mrna水平的表達(dá)量明顯上調(diào)。

和模型組相比，中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽(yáng)性藥組tlr4、nf-κb、tgf-β1、smad3在mrna水平的表達(dá)量均明顯下調(diào)。

5.結(jié)論

用含藥血清處理nafld細(xì)胞24小時(shí)后，油紅o染色、tg/蛋白含量、qpcr測(cè)定結(jié)果示：和模型組相比較，中藥組能夠降低nafld細(xì)胞中的tg含量，可能是通過(guò)下調(diào)目的基因tlr4、nf-κb在mrna水平的表達(dá)量發(fā)揮作用從而治療nafld。且中藥組同時(shí)能下調(diào)細(xì)胞中tgf-β1、smad3的mrna表達(dá)量，達(dá)到預(yù)防肝纖維化的作用。

本發(fā)明藥物組合物，配伍精當(dāng)，各藥味相輔相成，對(duì)脂肪肝的療效明確，且可用于預(yù)防肝纖維化，毒副作用小，為臨床治療脂肪肝提供了一種新的選擇。