本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種大蒜提取物的應(yīng)用和應(yīng)用其的產(chǎn)品。

背景技術(shù)：

癌癥是一大類惡性腫瘤的統(tǒng)稱。癌細(xì)胞的特點(diǎn)是無(wú)限制、無(wú)止境地增生，使患者體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗。并且，癌細(xì)胞通過(guò)釋放出多種毒素，會(huì)使人體產(chǎn)生一系列癥狀。同時(shí)，癌細(xì)胞還可轉(zhuǎn)移到全身各處生長(zhǎng)增殖，導(dǎo)致人體消瘦、無(wú)力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等等。

其中，肝細(xì)胞癌(hcc)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌腫瘤，是全球癌癥死亡的主要原因。它的發(fā)展與多種因素和條件有關(guān)，包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎、病毒感染，慢性攝入酒精、食物中的致癌物質(zhì)或者肝硬化。目前，治療肝癌最常用的方法是綜合治療，即中西醫(yī)結(jié)合治療手術(shù)、放療、化療及中醫(yī)藥化療。

順鉑(ddp)是一種最廣泛抗腫瘤藥物，免疫印跡分析顯示，順鉑可下調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2并且上調(diào)促凋亡蛋白bax。然而，因?yàn)槠淠退幮院投靖弊饔?，如腎毒性、外周神經(jīng)毒性和耳毒性等副作用，給病人帶來(lái)極大痛苦，且對(duì)病人機(jī)體的免疫系統(tǒng)損傷也較大，致使順鉑的使用受到嚴(yán)重限制，導(dǎo)致其在非特異性全身器官和腫瘤內(nèi)的濃度與分布均不足，達(dá)不到治療疾病的最優(yōu)藥物濃度。

多糖是大分子碳水化合物，不僅在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，也是重要的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。近年來(lái)，許多多糖已從自然資源中分離出來(lái)，他們?cè)诳箵舭┌Y中起著重要作用，具有廣泛的生物學(xué)特性。大蒜提取物中的大蒜多糖(gps)是liliaceae家族的大蒜的主要活性成分。作為一種雜多糖，大蒜多糖由果聚糖和少量的葡萄糖組成。研究表明大蒜多糖具有多種活性，如強(qiáng)抗氧化，抗病毒，保護(hù)角質(zhì)層抗紫外線，保護(hù)肝臟和增強(qiáng)免疫活性等。

因此，開(kāi)發(fā)一種毒副作用小，抑制腫瘤生長(zhǎng)同時(shí)能夠誘導(dǎo)早期腫瘤細(xì)胞凋亡的有效的抗肝癌藥物尤為重要。目前，利用大蒜提取物作為低毒高效的輔助抗腫瘤候選藥物尚未見(jiàn)報(bào)道。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供大蒜提取物在制備降低化療藥物毒副作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種用于降低化療藥物毒副作用的藥物；

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種大蒜提取物在制備抗腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用；以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的化療藥物毒副作用大，尚未發(fā)現(xiàn)低毒高效的輔助抗腫瘤的候選藥物的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明提供了一種大蒜提取物的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括所述大蒜提取物在制備降低化療藥物毒副作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用和在制備抗腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述大蒜提取物為大蒜多糖。

進(jìn)一步地，所述毒副作用包括腎毒性、耳毒性和神經(jīng)毒性中的一種或多種。

進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品為藥物。

進(jìn)一步地，所述腫瘤為肝癌。

進(jìn)一步地，所述肝癌包括單純型、硬化型和炎癥型中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了一種用于降低化療藥物毒副作用的藥物，所述藥物包括上述的大蒜提取物。

另外，本發(fā)明還提供了一種用于抗腫瘤的藥物，所述藥物包括上述的大蒜提取物。

進(jìn)一步地，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載劑或輔料。

進(jìn)一步地，所述化療藥物為順鉑。

本發(fā)明提供的大蒜提取物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能夠表現(xiàn)一定的抗腫瘤活性，通過(guò)應(yīng)用由大蒜提取物制備的產(chǎn)品，能夠起到抗腫瘤的作用；同時(shí)，將大蒜提取物聯(lián)合化療藥物共同作用于腫瘤細(xì)胞，能夠通過(guò)縮短作用時(shí)間，降低化療藥物使用量，降低其毒副作用；并且，大蒜為食藥兩用植物，應(yīng)用大蒜作為輔助抗腫瘤的藥物，在能夠降低化療藥物毒副作用的同時(shí)，不產(chǎn)生其他不良反應(yīng)，用藥更安全。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的應(yīng)用q-sepharose陰離子交換層析柱測(cè)得的洗脫曲線結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提供的應(yīng)用sephadexg-50凝膠滲透色譜柱測(cè)得的洗脫曲線結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例5提供的大蒜多糖和順鉑對(duì)hepg2細(xì)胞增殖的抑制作用的結(jié)果圖；

圖4a為本發(fā)明實(shí)施例6提供的空白對(duì)照組細(xì)胞用hoechst33342染色后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖；

圖4b為本發(fā)明實(shí)施例6提供的1mg/ml大蒜多糖組細(xì)胞用hoechst33342染色后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖；

圖4c為本發(fā)明實(shí)施例6提供的1mg/ml大蒜多糖與5μg/ml順鉑共同作用組細(xì)胞用hoechst33342染色后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖；

圖5a為本發(fā)明實(shí)施例7提供的空白對(duì)照組hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5b為本發(fā)明實(shí)施例7提供的單獨(dú)應(yīng)用0.5μg/ml順鉑作用48小時(shí)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5c為本發(fā)明實(shí)施例7提供的單獨(dú)應(yīng)用0.25mg/ml大蒜多糖作用48小時(shí)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5d為本發(fā)明實(shí)施例7提供的聯(lián)合應(yīng)用0.25mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時(shí)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5e為本發(fā)明實(shí)施例7提供的單獨(dú)應(yīng)用0.5mg/ml大蒜多糖作用48小時(shí)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5f為本發(fā)明實(shí)施例7提供的聯(lián)合應(yīng)用0.5mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時(shí)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5g為本發(fā)明實(shí)施例7提供的單獨(dú)應(yīng)用1.0mg/ml大蒜多糖作用48小時(shí)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5h為本發(fā)明實(shí)施例7提供的聯(lián)合應(yīng)用1.0mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時(shí)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖6a為本發(fā)明實(shí)施例8提供的空白對(duì)照組hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡情況結(jié)果圖；

圖6b為本發(fā)明實(shí)施例8提供的單獨(dú)應(yīng)用0.5μg/ml順鉑作用48小時(shí)對(duì)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6c為本發(fā)明實(shí)施例8提供的單獨(dú)應(yīng)用5μg/ml順鉑作用48小時(shí)對(duì)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6d為本發(fā)明實(shí)施例8提供的單獨(dú)應(yīng)用0.25mg/ml大蒜多糖作用48小時(shí)對(duì)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6e為本發(fā)明實(shí)施例8提供的單獨(dú)應(yīng)用0.5mg/ml大蒜多糖作用48小時(shí)對(duì)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6f為本發(fā)明實(shí)施例8提供的單獨(dú)應(yīng)用1.0mg/ml大蒜多糖作用48小時(shí)對(duì)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6g為本發(fā)明實(shí)施例8提供的聯(lián)合應(yīng)用0.25mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時(shí)對(duì)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6h為本發(fā)明實(shí)施例8提供的聯(lián)合應(yīng)用0.5mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時(shí)對(duì)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6i為本發(fā)明實(shí)施例8提供的聯(lián)合應(yīng)用1.0mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時(shí)對(duì)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例8提供的單獨(dú)應(yīng)用大蒜多糖和大蒜多糖與順鉑聯(lián)合應(yīng)用作用48小時(shí)對(duì)hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡率的影響結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

在腫瘤治療過(guò)程中，通常會(huì)使用廣譜抗腫瘤藥物，例如順鉑。但此類藥物的使用往往伴有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，包括腎毒性、外周神經(jīng)毒性和耳毒性等副作用，給病人帶來(lái)極大痛苦，對(duì)病人機(jī)體的免疫系統(tǒng)損傷也較大，致使其使用受到嚴(yán)重限制，在非特異性全身器官和腫瘤內(nèi)的濃度與分布均不足，達(dá)不到治療疾病的最優(yōu)藥物濃度。

因此，針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了大蒜提取物的應(yīng)用，包括大蒜提取物在制備降低化療藥物毒副作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用和在制備抗腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

在本發(fā)明中，大蒜提取物為大蒜多糖。

在本發(fā)明中，毒副作用包括腎毒性、耳毒性和神經(jīng)毒性中的一種或多種。

在本發(fā)明中，產(chǎn)品為藥物。

在本發(fā)明中，腫瘤為肝癌。

在本發(fā)明中，肝癌包括單純型、硬化型和炎癥型中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了一種用于降低化療藥物毒副作用的藥物，包括上述的大蒜提取物。

另外，本發(fā)明還提供了一種用于抗腫瘤的藥物，包括上述的大蒜提取物。

在本發(fā)明中，藥物還包括藥學(xué)上可接受的載劑或輔料。

其中，載劑例如可以為，但不限于殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒中的一種或多種；輔料例如可以為，但不限于糊精、淀粉或蔗糖。

在本發(fā)明中，藥物的劑型例如可以為，但不限于片劑、膠囊或沖劑。

在本發(fā)明中，化療藥物為順鉑。

本發(fā)明提供的大蒜提取物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能夠表現(xiàn)一定的抗腫瘤活性，通過(guò)應(yīng)用由大蒜提取物制備的產(chǎn)品，能夠起到抗腫瘤的作用；同時(shí)，將大蒜提取物聯(lián)合化療藥物共同作用于腫瘤細(xì)胞，能夠通過(guò)縮短作用時(shí)間，降低化療藥物使用量，降低其毒副作用；并且，大蒜為食藥兩用植物，應(yīng)用大蒜作為輔助抗腫瘤的藥物，在能夠降低化療藥物毒副作用的同時(shí)，不產(chǎn)生其他不良反應(yīng)，用藥更安全。

為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的內(nèi)容，現(xiàn)結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)介紹如下。如未明確指出，以下實(shí)施例中采用的白大蒜為市售200克；hepg2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞資源中心；mtt購(gòu)自sigma；順鉑購(gòu)自豪森藥業(yè)有限公司；培養(yǎng)基(mem)和胎牛血清均購(gòu)自gibco；非必需氨基酸溶液100×，胰蛋白酶-edta溶液1×(胰蛋白酶)購(gòu)自gibco；碘化丙啶(pi)試劑盒、annexinv-fitc和hoechst33342染色試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純級(jí)別。

實(shí)施例1大蒜多糖的提取、分離與純化

大蒜去皮磨碎。磨碎后的大蒜勻漿加4倍體積水80℃浸提3小時(shí)，然后用200目紗布過(guò)濾。濾渣再經(jīng)4倍體積的水在80℃提取2小時(shí)，之后再次過(guò)濾取上清，合并上清液。上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮液冷卻后加入3倍體積的95％(v/v)的預(yù)冷乙醇進(jìn)行沉淀，將沉淀物用95％(v/v)的乙醇洗滌三次并凍干。利用sevage法去除多糖中的蛋白質(zhì)，之后再次干燥，獲得粗多糖。

取5g粗多糖，重新溶解在100ml蒸餾水中，并利用q-sepharosefastflow層析柱(20mmid×350mm，法瑪西亞公司)，用蒸餾水和0.1-0.5m濃度梯度的nacl在1ml/min的流速下進(jìn)行洗脫。采用苯酚-硫酸法檢測(cè)洗脫糖含量高的餾分(峰值1)并收集、透析、凍干，得大蒜多糖純品。利用sephadexg-50(26mmid×1000mm)凝膠滲透色譜，用0.1m的nacl在0.5ml/min的流速下對(duì)上一步驟中獲得的大蒜多糖進(jìn)行純度驗(yàn)證，獲得洗脫峰為單一對(duì)稱峰，說(shuō)明上一步驟制備的大蒜多糖為純品。

在本實(shí)驗(yàn)中，白蒜分離大蒜粗多糖得率26.06克，收率為13.08％。粗多糖經(jīng)q-sepharosefastflow層析純化。主要組分通過(guò)凝膠過(guò)濾層析純度驗(yàn)證，洗脫曲線如圖1所示。

實(shí)施例2大蒜多糖重均分子量

采用高效凝膠滲透色譜法(hpgpc)，并利用液相色譜儀器(安捷倫，美國(guó))測(cè)定大蒜多糖的重均分子量。其中，plaquagel-oh30柱(7.5mmid×300mm，8μm)維持在25℃，流動(dòng)相為0.02m的硝酸鈉(nano3)和0.01m的磷酸二氫鈉(naoh，ph7.0)，流量為0.6ml/min，并通過(guò)rid-10a檢測(cè)器檢測(cè)。將2mg樣品溶解在流動(dòng)相中，過(guò)0.45μm濾膜。大蒜多糖的重均分子量以dextrant-系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(t-10、t-40、t-70、t-500和t-2000)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為參考進(jìn)行評(píng)估。

通過(guò)在sephadexg-50中觀察到單一對(duì)稱峰，說(shuō)明大蒜多糖是均一多糖，如圖2所示。利用高效凝膠色譜法檢測(cè)大蒜多糖的重均分子量，根據(jù)校準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖，得到大蒜多糖的重均分子量約為2714.94da。

實(shí)施例3大蒜多糖單糖組成分析

大蒜多糖中單糖的鑒定與定量采用pmp柱前衍生法和高性能液相色譜分析。大蒜多糖用2mtfa在100℃下水解2小時(shí)，并轉(zhuǎn)化為所述的糖醇乙酸酯。由此產(chǎn)生的糖醇乙酸酯通過(guò)紫外檢測(cè)器(245nm)和色譜毛細(xì)管柱(4.6mm內(nèi)徑×250mm，5μm)，利用agilent1280高效液相色譜分析儀進(jìn)行分析。其中，色譜毛細(xì)管柱的溫度保持在25℃，樣品折射量為10μl。流動(dòng)相為經(jīng)磷酸二氫鉀：乙腈(83:17，v/v)稀釋的0.05m的kh2po4-naoh緩沖液，流速為1ml/min。以甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

氣相色譜分析表明，大蒜多糖是由相對(duì)摩爾質(zhì)量比為4.6：0.8：0.9：0.5的葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)、木糖(xyl)和阿拉伯糖(ara)組成。

實(shí)施例4細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系hepg2細(xì)胞利用mem培養(yǎng)基(含10％的胎牛血清、100u/ml的青霉素和100u/ml的鏈霉素)，在37℃，5％co2/95％空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

實(shí)施例5抗增殖活性

采用mtt法檢測(cè)大蒜多糖對(duì)hepg2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。將hepg2細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％時(shí)，分別加入100μg/ml、250μg/ml和500μg/ml的大蒜多糖，5μg/ml的順鉑以及大蒜多糖與順鉑聯(lián)合用藥，用藥方案為大蒜多糖100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml分別與5μg/ml順鉑共同作用于人肝癌細(xì)胞系hepg2，在37℃條件下分別孵育24小時(shí)和48小時(shí)。孵育完成后，每孔加入20μlmtt(5mg/ml)，37℃孵育4小時(shí)。之后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液并每孔加入150μldmso。紫色結(jié)晶溶解充分后，設(shè)定波長(zhǎng)為490nm的酶標(biāo)儀(perkinelmer，美國(guó))檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)中，如圖3所示，大蒜多糖可在一定濃度范圍內(nèi)抑制人肝癌細(xì)胞系hepg2的增殖，并呈劑量依賴性。系列濃度大蒜多糖作用腫瘤細(xì)胞24小時(shí)，當(dāng)大蒜多糖濃度為100μg/ml時(shí)，抑制率為7.85％；當(dāng)大蒜多糖濃度為250μg/ml時(shí)，抑制率為13.37％；當(dāng)大蒜多糖濃度為500μg/ml時(shí)，抑制率為19.52％；作用48小時(shí)，當(dāng)大蒜多糖濃度為100μg/ml時(shí)，抑制率為14.47％；當(dāng)大蒜多糖濃度為250μg/ml時(shí)，抑制率為22.38％；當(dāng)大蒜多糖濃度為500μg/ml時(shí)，抑制率為26.18％。5μg/ml順鉑作用腫瘤細(xì)胞24小時(shí)抑制率為13.68％，48小時(shí)抑制率為52.93％。對(duì)于大蒜多糖與順鉑聯(lián)合用藥，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯高于單獨(dú)用藥。100μg/ml大蒜多糖+5μg/ml順鉑作用24小時(shí)，其增殖抑制率為52.04％；500μg/ml大蒜多糖+5μg/ml順鉑作用24小時(shí)，增殖抑制率高達(dá)64.47％。聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率均遠(yuǎn)高于順鉑單藥作用48小時(shí)42.93％的抑制率?？梢?jiàn)大蒜多糖可幫助增加順鉑的抗腫瘤活性，并可通過(guò)減少用藥時(shí)間間接降低化療藥物使用量，減少其毒副作用。

實(shí)施例6大蒜多糖和順鉑誘導(dǎo)后的hepg2細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)分析

將hepg2細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％時(shí)，分別加入1.0mg/ml的大蒜多糖以及大蒜多糖與順鉑的聯(lián)合用藥，用藥方案為1mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑共同作用，在37℃條件下孵育48小時(shí)。并設(shè)只加mem培養(yǎng)基的hepg2細(xì)胞為空白對(duì)照組。之后，收集細(xì)胞并通過(guò)hoechst33342在37℃條件下孵育15分鐘。熒光顯微鏡(尼康ts100，日本)下觀察細(xì)胞并拍照(400×)。

凋亡細(xì)胞的染色體dna結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使染料與dna結(jié)合更為高效，增強(qiáng)了凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光。在本實(shí)驗(yàn)中，如圖4a所示，空白對(duì)照組可見(jiàn)均勻藍(lán)色橢圓形細(xì)胞核，未見(jiàn)明顯凋亡。然而，通過(guò)結(jié)合hoechst33342，1mg/ml大蒜多糖的實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)較重藍(lán)色熒光，如圖4b所示；1mg/ml大蒜多糖聯(lián)合0.5μg/ml順鉑的實(shí)驗(yàn)組與1mg/ml大蒜多糖的實(shí)驗(yàn)組相比，顯示出更重的藍(lán)色熒光，如圖4c所示。hoechst33342染色結(jié)果顯示，是由大蒜多糖誘導(dǎo)凋亡途徑實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞的凋亡。順鉑是一種烷化劑抗腫瘤藥物，通過(guò)使dna不完整產(chǎn)生細(xì)胞毒性，作為一種非特異性的細(xì)胞周期藥物，主要干擾dna的復(fù)制。通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑，其抗腫瘤作用也得到了證實(shí)，并且，通過(guò)實(shí)施例1提供的大蒜多糖可以協(xié)同順鉑誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞凋亡。

實(shí)施例7細(xì)胞周期分布測(cè)定

將hepg2接種于6孔板，接種密度為1×10⁵個(gè)/孔，利用mem培養(yǎng)基，在37℃，5％co2/95％空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達(dá)到80％。之后，分別加入0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的大蒜多糖，0.5μg/ml的順鉑以及大蒜多糖與順鉑的聯(lián)合用藥，用藥方案為大蒜多糖0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml分別與0.5μg/ml順鉑共同作用于人肝癌細(xì)胞系hepg2，其中，單獨(dú)應(yīng)用0.5μg/ml順鉑的為陽(yáng)性對(duì)照組，并設(shè)只加mem培養(yǎng)基的hepg2細(xì)胞為空白對(duì)照組，在37℃條件下孵育48小時(shí)。胰蛋白酶消化后離心法收集細(xì)胞，pbs清洗兩次后，用70％的酒精進(jìn)行固定，并于4℃儲(chǔ)存過(guò)夜。固定后的細(xì)胞經(jīng)pbs清洗后加入含有0.05％核糖核酸酶的pi溶液，37℃孵育30分鐘。之后，于室溫在黑暗條件下加入5μl濃度為5mg/ml的pi溶液。30分鐘后，細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀(貝克曼庫(kù)爾特公司，美國(guó))進(jìn)行分析。每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定dna含量。通過(guò)與空白對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行比較，對(duì)用藥實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期進(jìn)行評(píng)價(jià)。

用pi染色評(píng)價(jià)大蒜多糖和順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用48小時(shí)后，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。結(jié)果如表1所示。

表1大蒜多糖和順鉑對(duì)hepg2細(xì)胞周期的影響

每種藥物單獨(dú)作用48小時(shí)均減少g1期細(xì)胞數(shù)，如圖5b，5c，5e和5g所示，大蒜多糖處理能夠增加g2或m期細(xì)胞比例，順鉑能夠顯著增加細(xì)胞周期中s期的細(xì)胞比例。而聯(lián)合用藥組s期和g2期細(xì)胞比例增加，如圖5d，5f和5h所示?？瞻讓?duì)照組如圖5a所示。因此，說(shuō)明聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)是通過(guò)延長(zhǎng)并阻止細(xì)胞在s和g2期的增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

實(shí)施例8凋亡檢測(cè)

確定藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，利用annexinv-fitc試劑盒及pi染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。annexinv-fitc及pi染色劑能夠進(jìn)入細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，并通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸，檢測(cè)凋亡或壞死的細(xì)胞。將hepg2接種于6孔板，接種密度為1×10⁵個(gè)/孔，利用mem培養(yǎng)基，在37℃，5％co2/95％空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％時(shí)，分別加入0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的大蒜多糖，0.5μg/ml的順鉑以及大蒜多糖與順鉑的聯(lián)合用藥，用藥方案為大蒜多糖0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml分別與0.5μg/ml順鉑共同作用于人肝癌細(xì)胞系hepg2，其中，單獨(dú)應(yīng)用0.5μg/ml順鉑的為陽(yáng)性對(duì)照組，并設(shè)只加mem培養(yǎng)基的hepg2細(xì)胞為空白對(duì)照組，在37℃條件下孵育48小時(shí)。之后，細(xì)胞與5μlannexinv-fitc及5μlpi共孵育，并通過(guò)流式細(xì)胞儀(加利福尼亞，貝克曼庫(kù)爾特公司)進(jìn)行分析。每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)。細(xì)胞凋亡率(％)＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞×100％。

根據(jù)染色，正常細(xì)胞為annexinv(-)/pi(-)；早期凋亡細(xì)胞為annexinv(+)/pi(-)；晚期凋亡細(xì)胞annexinv(+)/pi(+)，壞死細(xì)胞為annexinv(-)/pi(+)。流式細(xì)胞儀分析表明，每組藥物單獨(dú)處理48小時(shí)均可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞凋亡，如圖6b、6c、6d、6e和6f所示。聯(lián)合用藥也增加腫瘤細(xì)胞早期和晚期凋亡率，如圖6g、6h和6i所示。空白對(duì)照組如圖6a所示。通過(guò)大蒜多糖聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(74.1％、76.7％和79.3％)均顯著高于單獨(dú)應(yīng)用0.5μg/ml順鉑(50.3％)或單獨(dú)應(yīng)用大蒜多糖(49％，56.8％，63.8％)的凋亡率，如圖7所示(p＜0.05)。其中，大蒜多糖聯(lián)合0.5μg/ml順鉑用藥對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響均接近5μg/ml順鉑單獨(dú)的作用。提示大蒜多糖能夠降低化療藥物90％的用量，并達(dá)到相同的抗腫瘤效果。由于順鉑能夠干擾dna的復(fù)制，并且具有多種細(xì)胞毒性，能夠產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，因此，與其他藥物聯(lián)合用藥是一種增加療效但不增加不良反應(yīng)的好方法。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，作為低毒的天然大分子果聚糖成分的大蒜多糖，能顯著增加順鉑對(duì)hepg2細(xì)胞的抗增殖能力，且呈時(shí)間和劑量依賴性。

由本發(fā)明提供的實(shí)施例1至8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，本發(fā)明提供的大蒜提取物大蒜多糖，能夠表現(xiàn)一定的抗腫瘤活性，將大蒜多糖聯(lián)合化療藥物順鉑共同作用于腫瘤細(xì)胞，能夠通過(guò)縮短作用時(shí)間，降低順鉑使用量，從而降低其毒副作用；并且，大蒜為食藥兩用植物，應(yīng)用大蒜作為輔助抗腫瘤的藥物，在能夠降低化療藥物毒副作用的同時(shí)，不產(chǎn)生其他不良反應(yīng)，用藥更安全。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。