本發(fā)明涉及一種用于治療小兒上呼吸道感染的中藥制劑及其制備方法，屬于治療小兒呼吸道的中藥制劑。
背景技術(shù)：
治療小兒上呼吸道感染的中藥臨床使用方多以湯劑為主，雖然臨床效果好，但病人在煎煮、服用和保存方面極不方便，還存在著久置易霉變的缺點(diǎn)；使用不方便，不利于臨床推廣應(yīng)用。目前尚無(wú)治療病毒引起的上呼吸道感染特效藥物，且西藥抗菌藥物大多有一定的副作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療小兒上呼吸道感染的中藥制劑及其制備方法，具有清熱解毒，止咳利咽之功效，主要用于小兒急性上呼吸道感染風(fēng)熱犯表證，證見(jiàn)：發(fā)熱、微惡風(fēng)、咽喉疼痛或紅腫、咳嗽、脈浮，服用方便。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：用于治療小兒上呼吸道感染的中藥制劑及其制備方法，其特征在于：中藥制劑的配方為：黃芩175-525g，野馬追350-1050g，金銀花175-525g，鴨跖草175-525g，糊精640g，甜菊素8g，檸檬酸3g，制成顆粒1000g。
中藥制劑的配方最佳用量為：黃芩350g，野馬追700g，金銀花350g，鴨跖草350g，糊精640g，甜菊素8g，檸檬酸3g，制成顆粒1000g。
其制備方法如下：將處方中黃芩，野馬追，金銀花，鴨跖草四味藥粉碎成粗粉，加10倍量70％乙醇回流提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，濾過(guò)，濾液回收乙醇并濃縮成1.30～1.35(60～65℃測(cè))的清膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加入糊精、甜菊素和檸檬酸，混勻，80％乙醇制粒，干燥，制成1000g，即得。
本發(fā)明的積極效果是為了便于服用，制成顆粒，使用時(shí)開(kāi)水沖服，比較適合小兒服用，吸收和呈效均較快，為適合小兒口味，選用甜菊素進(jìn)行矯味。
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明的效果做進(jìn)一步描述：
一、用于治療小兒上呼吸道感染的中藥制劑抗病毒作用
(一)體外抗甲型和乙型流感病毒的作用[1]
1.對(duì)mdck細(xì)胞最大無(wú)毒濃度(td0)測(cè)定
(1)實(shí)驗(yàn)方法
在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的mdck單層細(xì)胞中，棄去上清液后分別加入本發(fā)明顆粒的rpmi-1640液1.0ml。濃度分別為100、80、60、40、20、10、5、2.5mg/ml，每個(gè)濃度四孔，置37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察藥物對(duì)細(xì)胞的影響。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：藥物濃度為100mg/ml和80mg/ml對(duì)mdck細(xì)胞有毒性作用，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮，聚集成團(tuán)，部分脫落；60mg/ml部分細(xì)胞出現(xiàn)病變；藥物濃度40mg/ml及以下濃度對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒性，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。因此本發(fā)明顆粒對(duì)mdck細(xì)胞的最大無(wú)毒劑量為40mg/ml。見(jiàn)表1。
表1對(duì)mdck細(xì)胞的無(wú)毒濃度
注：-無(wú)細(xì)胞病變；+25％細(xì)胞病變；++50％細(xì)胞病變；+++75％細(xì)胞病變；++++100％細(xì)胞病變。
2.甲型流感病毒和乙型流感病毒毒力的測(cè)定(tcid50測(cè)定)
(1)實(shí)驗(yàn)方法
在長(zhǎng)成單層細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中，接種不同稀釋度的(10-1～10-10)甲型或乙型流感病毒液，每一個(gè)稀釋度接種4孔，置37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞病變，確定其tcid50。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果按reed-muench方法計(jì)算。其甲型流感病毒的tcid50為10-4.55，乙型流感病毒的tcid50為10-3.5。見(jiàn)表2-3。
表2甲型流感病毒毒力測(cè)定結(jié)果
注：-無(wú)細(xì)胞病變；+25％細(xì)胞病變；++50％細(xì)胞病變；+++75％細(xì)胞病變；++++100％細(xì)胞病變。
表3乙型流感病毒毒力測(cè)定結(jié)果
注：-無(wú)細(xì)胞病變；+25％細(xì)胞病變；++50％細(xì)胞病變；+++75％細(xì)胞病變；++++100％細(xì)胞病變。
3.本發(fā)明對(duì)甲型流感病毒和乙型流感病毒致細(xì)胞病變的抑制作用
(1)實(shí)驗(yàn)方法
在長(zhǎng)成單層細(xì)胞的mdck培養(yǎng)板中，每孔感染甲型流感病毒或乙型流感病毒100tcid50。吸附1h后傾去病毒液，分別加入不同濃度的本發(fā)明顆粒藥液，37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組,利巴韋林組(10mg/ml)和病毒對(duì)照組。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明顆粒濃度在20mg/ml以上時(shí)，能夠抑制甲型流感病毒對(duì)mdck細(xì)胞的毒性作用；本發(fā)明顆粒濃度在40mg/ml時(shí)，也能夠抑制乙型流感病毒對(duì)mdck細(xì)胞的毒性作用。表明本發(fā)明顆粒具有一定的體外抗甲型和乙型流感病毒的作用。見(jiàn)表4-5。
表4對(duì)甲型流感病毒的抑制作用
注：-無(wú)細(xì)胞病變；+25％細(xì)胞病變；++50％細(xì)胞病變；+++75％細(xì)胞病變；++++100％細(xì)胞病變。
表5對(duì)乙型流感病毒的抑制作用
注：-無(wú)細(xì)胞病變；+25％細(xì)胞病變；++50％細(xì)胞病變；+++75％細(xì)胞病變；++++100％細(xì)胞病變。
(二)體內(nèi)抗甲型和乙型病毒作用[1，2，4，5]
1.對(duì)甲型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用
(1)實(shí)驗(yàn)方法
①甲型流感病毒雞胚增毒試驗(yàn)
將甲型流感病毒毒株接種于10日齡雞胚尿囊中，37℃培養(yǎng)48h后取出第1次增毒的尿囊液。再將第1次增毒的尿囊液再接種于雞胚尿囊中，重復(fù)4次后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前做血凝試驗(yàn)。
②血凝試驗(yàn)
取36孔微孔板，除1孔加入生理鹽水0.9ml，其余各孔加入生理鹽水0.5ml。將病毒尿囊液0.1ml加入第1孔內(nèi)，混勻后取0.5ml加至第2孔，依次稀釋至第8孔。第9孔不加病毒尿囊液，作空白對(duì)照。隨后每孔加入0.5％雞紅細(xì)胞0.25ml，輕輕搖勻后于室溫放置2小時(shí)，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果血凝試驗(yàn)(ha)為640。
③甲型流感病毒感染小鼠半數(shù)致死量(ld50)測(cè)定
取icr小鼠56只，體重13～15g，♀♂各半，隨機(jī)分7組，每組8只，取增毒4次的病毒尿囊液，以10倍稀釋?zhuān)拷M滴一個(gè)病毒濃度，各組小鼠在乙醚淺麻醉下以病毒尿囊液30μl滴鼻，觀察14天內(nèi)死亡數(shù)。按reed-muench法計(jì)算，結(jié)果ld50為101.47。
④對(duì)甲型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用
取icr小鼠120只，體重13～16g，♂♀各半，隨機(jī)分為6組，每組20只。(1)空白對(duì)照組：等量ns10ml/kg；(2)模型組：等量ns10ml/kg；(3)利巴韋林組：0.5g/kg；(4)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(5)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(6)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg。以上各組小鼠均灌胃給藥，給藥容量10ml/kg，1次/天，連續(xù)給藥五天。第1天給藥1h后除空白對(duì)照組外，其余各組在乙醚淺麻醉下，以血凝試驗(yàn)640以上的尿囊液給小鼠滴鼻感染，每鼠30μl(20個(gè)ld50致死量)。然后再給藥四天，觀察14天內(nèi)動(dòng)物感染后發(fā)病及死亡情況。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明顆粒21.6g/kg和43.2g/kg劑量組均可明顯延長(zhǎng)甲型流感病毒感染小鼠的存活天數(shù)(p＜0.05,p＜0.01)；43.2g/kg劑量組可顯著降低甲型流感病毒感染小鼠死亡數(shù)，與模型組比較具有顯著性差異(p＜0.05)。表明本發(fā)明顆粒對(duì)甲型流感病毒感染小鼠具有一定的保護(hù)作用。見(jiàn)表6。
表6對(duì)甲型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用
##p＜0.01與空白對(duì)照組比較
*p＜0.05**p＜0.01與模型組比較
2.對(duì)甲型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)及肺病變的影響
(1)實(shí)驗(yàn)方法
取icr小鼠120只，體重13～16g，♂♀兼用。隨機(jī)分6組，每組20只。(1)空白對(duì)照組：等量ns10ml/kg；(2)模型組：等量ns10ml/kg；(3)利巴韋林組：0.5g/kg；(4)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(5)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(6)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg。以上各組小鼠均灌胃給藥，給藥容量10ml/kg，1次/天，連續(xù)給藥五天。除空白對(duì)照組外，其余各組于給藥第1天，在乙醚淺麻醉下以病毒尿囊液滴鼻感染小鼠，每鼠30μl(15個(gè)ld50攻擊量)。然后繼續(xù)給藥4天。末次給藥后將小鼠禁食(不禁水)，次日進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：①小鼠稱(chēng)重后脫頸處死，解剖，取全肺稱(chēng)重，計(jì)算各鼠肺指數(shù)值(g/10g體重)和肺指數(shù)抑制率[(模型組-藥物組)/模型組×100％]；②各組隨機(jī)選取10只小鼠，取肺，用1％甲醛溶液固定后，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片，he染色后作病理組織學(xué)檢查，觀察肺部病變程度。病理照片見(jiàn)附圖。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
①對(duì)甲型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明顆粒21.6g/kg和43.2g/kg劑量組均可明顯降低甲型流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)值，肺指數(shù)抑制率分別為19.75％和22.51％。表明本發(fā)明顆粒具有減輕甲型流感病毒感染小鼠肺部病變的作用。見(jiàn)表7。
表7對(duì)甲型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響
##p＜0.01與空白對(duì)照組比較
*p＜0.05**p＜0.01與模型組比較
注：模型組于第3日死亡2只，第4日死亡3只；
利巴韋林組于第3日死亡1只，第4日死亡2只；
本發(fā)明顆粒1組于第3日死亡2只，第4日死亡2只；
本發(fā)明顆粒2組于第4日死亡3只；
本發(fā)明顆粒3組于第3日死亡1只，第4日死亡2只；
②對(duì)甲型流感病毒感染小鼠肺病變的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
空白對(duì)照組(10例)：10例肺組織均呈正常形態(tài)。支氣管腔內(nèi)無(wú)滲出物，黏膜上皮無(wú)變性壞死脫落，管壁及其周?chē)M織無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔未增厚，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物。
模型組(10例)：中度化膿性支氣管炎，小葉性肺炎和間質(zhì)性肺炎改變者2例。支氣管上皮細(xì)胞可見(jiàn)變性、壞死，腔內(nèi)可見(jiàn)一些膿性滲出物；部分肺組織結(jié)構(gòu)不清，呈實(shí)變狀；實(shí)變區(qū)有較多的嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；上述改變成效葉狀分布；實(shí)變區(qū)周?chē)糠址闻荼谠龊?，其?nèi)血管擴(kuò)張充血，亦見(jiàn)少量上述炎細(xì)胞浸潤(rùn)，小部分肺泡擴(kuò)張，呈氣腫狀。
重度化膿性支氣管炎，小葉性肺炎和間質(zhì)性肺炎改變者3例。支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死，腔內(nèi)可見(jiàn)較多膿性滲出物；病變支氣管周?chē)∪~泡周?chē)谓M織結(jié)構(gòu)不清，有大量的嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；部分病變?nèi)诤蠈?shí)變；實(shí)變區(qū)周?chē)糠址闻荼谠龊?，其?nèi)血管擴(kuò)張，間質(zhì)有多少不等的上述炎細(xì)胞浸潤(rùn)；部分肺泡擴(kuò)張，呈氣腫狀。
極重度化膿性支氣管炎，小葉性肺炎和間質(zhì)性肺炎改變者5例。支氣管上皮細(xì)胞明顯變性、壞死，腔內(nèi)可見(jiàn)大量膿性滲出物；病變支氣管周?chē)笃谓M織結(jié)構(gòu)不清，呈實(shí)變狀，實(shí)變區(qū)有大量的嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)變區(qū)周?chē)糠址闻荼谠龊?，其?nèi)血管明顯擴(kuò)張、充血，間質(zhì)有較多上述炎細(xì)胞浸潤(rùn)；部分肺泡擴(kuò)張，呈氣腫狀。
利巴韋林組(10例)：本組所有肺組織亦呈支氣管炎及間質(zhì)性肺炎，但總體病變程度明顯輕于模型組。其中輕度支氣管炎及間質(zhì)性肺炎為主。僅2例為中度。鏡下見(jiàn)部分支氣管上皮輕度變性、壞死。管腔內(nèi)可見(jiàn)少量壞死上皮細(xì)胞。管周?chē)倭渴戎行粤＜?xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞呈圍管浸潤(rùn)。肺泡壁輕度增厚，其內(nèi)血管輕度擴(kuò)張、充血，可見(jiàn)少量嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。部分區(qū)域肺組織基本正常。
本發(fā)明顆粒小劑量組(10例)：輕度小葉性肺炎、支氣管炎，間質(zhì)性肺炎者1例。支氣管上皮輕度變性、壞死。管腔內(nèi)可見(jiàn)少量脫落上皮細(xì)胞。管周?chē)倭渴戎行粤＜?xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞呈圍管浸潤(rùn)。肺泡壁輕度增厚，其內(nèi)血管輕度擴(kuò)張、充血，可見(jiàn)少量嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。中度間質(zhì)性肺炎、小葉性肺炎改變者8例，中度化膿性支氣管炎改變者6例。
本發(fā)明顆粒中劑量組(10例)：輕度小葉性肺炎、間質(zhì)性肺炎5例，輕度支氣管炎1例,中度小葉性肺炎和間質(zhì)性肺炎改變4例，中度化膿性支氣管炎3例。
本發(fā)明顆粒高劑量組(10例)：輕度小葉性肺炎，間質(zhì)性肺炎7例，輕度支氣管炎1例，中度小葉性肺炎和間質(zhì)性肺炎改變3例，中度化膿性支氣管炎1例。
病理照片見(jiàn)附圖。
表8對(duì)甲型流感病毒感染小鼠肺病變的影響
##p<0.01與空白對(duì)照組比較
*p<0.05**p<0.01與模型組比較
注：1.病變積分根據(jù)病變程度不同，依次標(biāo)記為“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”。
“-”為無(wú)明顯改變，記為0分；“+”為輕度病變改變，記為1分；
“++”為中度病理改變，記為2分；“+++”為重度病理改變，記為3分；
“++++”為極重度病理改變，記為4分。
積分值越高，表示病變程度越重。
2.統(tǒng)計(jì)采用秩和檢驗(yàn)。
上述結(jié)果顯示：甲型流感病毒感染小鼠為肺炎性病變。主要表現(xiàn)為化膿性支氣管炎、小葉性肺炎和間質(zhì)性肺炎。本發(fā)明顆粒高、低劑量組與模型組相比，肺部病變均明顯減輕。表明本發(fā)明顆粒能減輕甲型流感病毒所致小鼠的肺部感染，具有一定的抗甲型流感病毒的作用。
3.對(duì)乙型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用
(1)實(shí)驗(yàn)方法
①乙型流感病毒雞胚增毒試驗(yàn)
將乙型流感病毒毒株接種于9日齡雞胚尿囊中，37℃培養(yǎng)48h后取出第1次增毒的尿囊液。再將第1次增毒的尿囊液再接種于雞胚尿囊中，重復(fù)4次后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前做血凝試驗(yàn)。
②血凝試驗(yàn)
取36孔微孔板，除1孔加入生理鹽水0.9ml，其余各孔加入生理鹽水0.5ml。將病毒尿囊液0.1ml加入第1孔內(nèi)，混勻后取0.5ml加至第2孔，依次稀釋至第8孔。第9孔不加病毒尿囊液，作空白對(duì)照。隨后每孔加入0.5％雞紅細(xì)胞0.25ml，輕輕搖勻后于室溫放置2小時(shí)，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果血凝試驗(yàn)(ha)為640。
③乙型流感病毒感染小鼠半數(shù)致死量(ld50)測(cè)定
取icr小鼠56只，體重13～15g，雌雄兼用，隨機(jī)分7組，每組7只，取增毒尿囊液，以10倍依次稀釋?zhuān)拷M滴一個(gè)病毒濃度，各組小鼠在乙醚淺麻醉下以病毒尿囊液30μl滴鼻，觀察14天內(nèi)死亡數(shù)。按reed-muench法計(jì)算，結(jié)果ld50為101.81。
④對(duì)乙型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用
取icr小鼠120只，體重13～16g，♂♀兼用，隨機(jī)分為6組，每組20只。(1)空白對(duì)照組：等量ns10ml/kg；(2)模型組：等量ns10ml/kg；(3)利巴韋林組：0.5g/kg；(4)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(5)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(6)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg。以上各組小鼠均灌胃給藥，給藥容量10ml/kg，1次/天，連續(xù)給藥五天。第一天給藥1h后除空白對(duì)照組外，其余各組在乙醚淺麻醉下，以血凝試驗(yàn)640以上的尿囊液給小鼠滴鼻感染，每鼠40μl(20個(gè)ld50致死量)，觀察14天內(nèi)動(dòng)物感染后發(fā)病及死亡情況。
(2)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明顆粒43.2g/kg劑量組均可明顯延長(zhǎng)乙型流感病毒感染小鼠的存活天數(shù)(p＜0.05)；也可降低甲型流感病毒感染小鼠死亡數(shù)，但與模型組比較無(wú)顯著性差異。表明本發(fā)明顆粒對(duì)甲型流感病毒感染小鼠具有一定的保護(hù)作用。見(jiàn)表9。
表9對(duì)乙型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用
##p＜0.01與正常對(duì)照組比較
*p＜0.05**p＜0.01與模型組比較
4.對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)及肺病變的影響
(1)實(shí)驗(yàn)方法
取icr小鼠72只，體重13～16g，♂♀各半。隨機(jī)分6組，每組12只。(1)空白對(duì)照組：等量ns10ml/kg；(2)模型組：等量ns10ml/kg；(3)利巴韋林組：0.5g/kg；(4)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(5)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(6)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg。以上各組小鼠均灌胃給藥，給藥容量10ml/kg，1次/天，連續(xù)給藥五天。除空白對(duì)照組外，其余各組于給藥第1天，在乙醚淺麻醉下以病毒尿囊液滴鼻感染小鼠，每鼠30μl(20個(gè)ld50攻擊量)。然后繼續(xù)給藥4天。末次給藥后將小鼠禁食(不禁水)，次日進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：①小鼠稱(chēng)重后脫頸處死，解剖，取全肺稱(chēng)重，計(jì)算各鼠肺指數(shù)值(g/10g體重)和肺指數(shù)抑制率[(藥物組-模型組)/模型組×100％]；②各組隨機(jī)選取10只小鼠，取肺，用1％甲醛溶液固定后，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片，he染色后作病理組織學(xué)檢查，觀察肺部病變程度。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
①對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明顆粒43.2g/kg劑量組可明顯降低乙型流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)值，
表10對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響
##p＜0.01與空白對(duì)照組比較
*p＜0.05與模型組比較
②對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺病變的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下并見(jiàn)表14(對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺病理學(xué)檢查)。
空白對(duì)照組(10例)：本組10例肺組織均呈正常形態(tài)。支氣管腔內(nèi)無(wú)滲出物，黏膜上皮無(wú)變性壞死脫落，管壁及其周?chē)M織無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔未增厚，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物。
模型組(10例)：本組大部分肺組織均呈中至重度支氣管炎小葉性肺炎及間質(zhì)性肺炎，且充血、出血較明顯，部分肺組織為輕至中度肺泡炎。表現(xiàn)為支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死，腔內(nèi)見(jiàn)壞死細(xì)胞及滲出物。病變支氣管壁及其周?chē)谓M織結(jié)構(gòu)不清，有多量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。肺泡壁普遍增厚，其內(nèi)血管擴(kuò)張，并有多少不等的上述炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
利巴韋林組(10例)：本組7例肺組織呈輕至中度支氣管炎及間質(zhì)性肺炎，2例較重，1例基本正常。表現(xiàn)為支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死，腔內(nèi)見(jiàn)壞死細(xì)胞及滲出物。病變支氣管壁及其周?chē)谓M織結(jié)構(gòu)不清，有多量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。肺泡壁普遍增厚，其內(nèi)血管擴(kuò)張，并有多少不等的上述炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
本發(fā)明顆粒小劑量組(10例)：本組肺組織亦呈輕至中度支氣管炎、小葉性肺炎及間質(zhì)性肺炎，少數(shù)病例較重。表現(xiàn)為支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死，腔內(nèi)見(jiàn)壞死細(xì)胞及滲出物。病變支氣管壁及其周?chē)谓M織結(jié)構(gòu)不清，有多量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。肺泡壁普遍增厚，其內(nèi)血管擴(kuò)張，并有多少不等的上述炎細(xì)胞浸潤(rùn)?？傮w病變程度略輕于模型組。
本發(fā)明顆粒中劑量組(10例)：本組病變形態(tài)與小劑量組相似，表現(xiàn)為支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死，腔內(nèi)見(jiàn)壞死細(xì)胞及滲出物。病變支氣管壁及其周?chē)谓M織結(jié)構(gòu)不清，有多量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。肺泡壁普遍增厚，其內(nèi)血管擴(kuò)張，并有多少不等的上述炎細(xì)胞浸潤(rùn)。但總體病變程度輕于模型組和小劑量組。
本發(fā)明顆粒大劑量組(10例)：本組病變形態(tài)與小劑量組相似，表現(xiàn)為支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死，腔內(nèi)見(jiàn)壞死細(xì)胞及滲出物。病變支氣管壁及其周?chē)谓M織結(jié)構(gòu)不清，有多量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。肺泡壁普遍增厚，其內(nèi)血管擴(kuò)張，并有多少不等的上述炎細(xì)胞浸潤(rùn)。但總體病變程度略輕于模型組和小劑量組。
表11對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺病變的影響
#p<0.01與正常對(duì)照組比較
*p<0.05**p<0.01與模型組比較
注：1.病變積分根據(jù)病變程度不同，依次標(biāo)記為“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”。
“-”為無(wú)明顯改變，記為0分；“+”為輕度病變改變，記為1分；
“++”為中度病理改變，記為2分；“+++”為重度病理改變，記為3分；
“++++”為極重度病理改變，記為4分。
積分值越高，表示病變程度越重。
2.統(tǒng)計(jì)采用秩和檢驗(yàn)。
上述結(jié)果顯示：乙型流感病毒感染小鼠為肺炎性病變。主要表現(xiàn)為支氣管炎、小葉性肺炎和間質(zhì)性肺炎。本發(fā)明顆粒高、中劑量組能減輕乙型流感病毒所致小鼠的肺部感染，具有抗乙型流感病毒的作用。
(二)本發(fā)明的抗菌作用
(一)體外抑菌作用[1、2、3]
1.方法
(1)細(xì)菌培養(yǎng)
取標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽苞桿菌和臨床分離菌株金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、不動(dòng)桿菌、肺炎克雷百氏菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、洋蔥假單孢桿菌、枸櫞酸腸桿菌、肺炎雙球菌、乙型鏈球菌、科代葡萄球菌菌株少許，分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h。取18h培養(yǎng)的各菌株?duì)I養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用營(yíng)養(yǎng)肉湯作10－3稀釋用于實(shí)驗(yàn)。
(2)二倍稀釋法(試管法)
取滅菌試管11支，第1管加入營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基1.6ml,其余每管1ml，取本發(fā)明顆粒藥液(1g/ml)0.4ml加入第一管中，混勻后取1ml至第2管，依次稀釋?zhuān)?0管吸出1ml棄去，第11管不加藥液作為對(duì)照。每管加入菌液0.1ml，37℃培養(yǎng)20h，取出觀察mic。
取環(huán)丙沙星(1mg/ml)按上述方法，依次稀釋?zhuān)囵B(yǎng)，作陽(yáng)性對(duì)照。
2.結(jié)果
本發(fā)明顆粒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和臨床分離菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乙型鏈球菌、科代葡萄球菌、洋蔥假單孢桿菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，mic在37.5mg～50mg/ml(按生藥量計(jì)算)，表明本發(fā)明顆粒具有體外抗菌作用。見(jiàn)表12。
表12本發(fā)明顆粒的體外抗菌活性(n＝2)
(二)體內(nèi)抗菌作用[1、2]
1.對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護(hù)作用
(1)實(shí)驗(yàn)方法
①菌液制備
取臨床分離金黃色葡萄球菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置37℃孵箱培養(yǎng)18h。取出，劃線于血平板上(10％羊紅細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板)，37℃孵箱培養(yǎng)20h。取出，用6ml5％的胃膜素(ph7.2)洗脫菌落，并用4ml生理鹽水溶液將血平板沖洗干凈，合并后吹打，使菌落分散并分別用生理鹽水配成0.33ml/ml、0.20ml/ml、0.11ml/ml、0.06ml/ml濃度菌液備用。
②選擇合適的菌液濃度
取icr小鼠40只，♀♂各半，體重18～22g。隨機(jī)分組，每組1個(gè)濃度，腹腔注射金黃色葡萄球菌菌液，每鼠0.5ml，觀察感染小鼠死亡數(shù)，結(jié)果感染小鼠死亡率分別為100％、100％、90％、40％。故實(shí)驗(yàn)選用0.11ml/ml濃度菌液。
③對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護(hù)作用
取18～22gicr小鼠140只，隨機(jī)分組，每組20只，♀♂兼用。(1)正常對(duì)照組：等量ns10ml/kg；(2)模型組：等量ns10ml/kg；3)抗病毒顆粒組：6g/kg；(4)林可霉素組：0.3g/kg；(5)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(6)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(7)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg。以上各組小鼠均灌胃給藥，給藥容量30ml/kg，1次/天×5天。第3天給藥后1h，除空白對(duì)照組以外，其余各組均腹腔注射金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液0.5ml/鼠(菌液濃度0.11ml/ml)。然后繼續(xù)給藥2天。觀察各組動(dòng)物7日內(nèi)死亡情況。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本發(fā)明顆粒20g/kg和40g/kg劑量組對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠可降低其死亡率，并可延長(zhǎng)感染小鼠的存活天數(shù)，與模型組比較具有顯著性差異(p<0.05)，表明本發(fā)明顆粒對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠具有明顯的保護(hù)作用。見(jiàn)表132。
表13對(duì)金黃色葡萄球菌感染小數(shù)死亡的保護(hù)作用
##p＜0.01與正常對(duì)照組比較
*p＜0.05**p＜0.01與模型組比較
2.對(duì)肺炎雙球菌感染小鼠的保護(hù)作用
(1)實(shí)驗(yàn)方法
①菌液制備
取臨床分離肺炎雙球菌接種入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置37℃孵箱培養(yǎng)18h。取出，劃線于血平板上(1％羊紅細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板)，37℃孵箱培養(yǎng)24h，取出。用6ml5％的胃膜素(ph7.2)洗脫菌落，并用4ml生理鹽水溶液將血平板沖洗干凈，合并后吹打，使菌落分散。用生理鹽水配成1ml/ml、0.5ml/ml、0.33ml/ml、0.25ml/ml濃度菌液備用。
②選擇合適的菌液濃度
取icr小鼠40只,♀♂各半,體重18～22g隨機(jī)分組，每組1個(gè)濃度，腹腔注射肺炎雙球菌菌液0.5ml/鼠，觀察感染小鼠死亡數(shù)，結(jié)果感染小鼠死亡率分別為100.0％，100.0％，60.0％，30.0％。故實(shí)驗(yàn)選用0.45ml/ml濃度菌液(小鼠死亡率估計(jì)80～90％之間)。
③對(duì)肺炎雙球菌感染小鼠死亡的保護(hù)作用
取18～22gicr小鼠140只隨機(jī)分組，每組20只，♀♂兼用。(1)正常對(duì)照組：等量ns10ml/kg；(2)模型組：等量ns10ml/kg；3)抗病毒顆粒組：10ml/kg；(4)林可霉素組：0.3g/kg；(5)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(6)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(7)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg。以上各組小鼠均灌胃給藥，給藥容量30ml/kg，1次/天×5天。第3天給藥1小時(shí)后，除正常對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射肺炎雙球菌培養(yǎng)液0.5ml/鼠(菌液濃度0.45ml/ml)。然后繼續(xù)給藥2天。觀察各組動(dòng)物7日內(nèi)死亡情況。
(2)結(jié)果
本發(fā)明顆粒43.2g/kg劑量組對(duì)肺炎雙球菌感染小鼠可降低其死亡率,延長(zhǎng)存活天數(shù)，與模型組比較具有顯著性差異(p<0.05)。表明本發(fā)明顆粒對(duì)肺炎雙球菌感染小鼠具有保護(hù)作用。見(jiàn)表14。
表14對(duì)肺炎雙球菌感染小鼠死亡的保護(hù)作用
##p＜0.01與正常對(duì)照組比較
*p＜0.05**p＜0.01與模型組比較
三、本發(fā)明顆粒的抗炎作用
(一)對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹的影響[2]
1.實(shí)驗(yàn)方法
取雄性km小鼠50只，體重25～27g。按體重隨機(jī)分為5組：分別為(1)空白對(duì)照組：生理鹽水10ml/kg；(2)抗病毒顆粒組：6g/kg；(3)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(4)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(5)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg。各組按上述劑量灌胃給藥，同時(shí)立即用2％巴豆油0.05ml涂于小鼠左耳兩側(cè)，在致炎4小時(shí)后處死小鼠，剪下左右兩耳，用打孔器(直徑9mm)分別在同一部位取下圓耳片，電子天平稱(chēng)重，計(jì)算耳殼重量，比較各組小鼠耳殼腫脹度(小鼠左耳殼重－小鼠右耳殼重)，并計(jì)算腫脹百分率(腫脹度/右耳殼重)。
2.結(jié)果
結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。顯示，本發(fā)明顆粒童炎康顆粒10.8、21.6、43.2g/kg三個(gè)劑量組能明顯減輕小鼠耳殼腫脹度及腫脹率，與空白對(duì)照組比較差異非常顯著(p<0.05、0.01)，提示本發(fā)明顆?？蓪?duì)抗巴豆油所致的炎癥反應(yīng)，具有抗炎作用。見(jiàn)表15。
表15對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹的影響
*p<0.05**p<0.01與空白對(duì)照組比較
(二)對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響[1]
1.實(shí)驗(yàn)方法
取昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重19～21g。按體重隨機(jī)分為5組：分別為(1)空白對(duì)照組：生理鹽水10ml/kg；(2)抗病毒顆粒組：6g/kg；(3)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(4)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(5)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg。各組按上述劑量灌胃給藥，給藥2min后，再次尾靜脈注射0.5％伊文思藍(lán)0.1ml/10g，同時(shí)腹腔注射0.6％乙酸0.2ml/只。20min后脫頸椎處死小鼠，用5ml生理鹽水沖洗腹腔，用注射器抽出腹腔洗液約4.5ml。2000rpm離心5min，于590nm處測(cè)定紫外吸收度值(a)。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。顯示，童炎康顆粒21.6、43.2g/kg兩劑量組均能減少小鼠腹腔內(nèi)依文思藍(lán)的吸收度值，與空白對(duì)照組比較差異非常顯著(p<0.05、0.01)，表明本發(fā)明顆粒能抑制急性炎癥時(shí)毛細(xì)血管通透性的增加，具有抗炎作用。見(jiàn)表16。
表16對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響
*p<0.05**p<0.01與空白對(duì)照組比較
四、本發(fā)明顆粒的鎮(zhèn)痛作用
(一)對(duì)醋酸刺激致小鼠疼痛反應(yīng)的影響[2]
1.方法
取km小鼠100只，體重19～22g，♀♂各半。隨機(jī)分為5組，分別為(1)空白對(duì)照組：生理鹽水10ml/kg；(2)抗病毒顆粒組：6g/kg；(3)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(4)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(5)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg。各組按上述劑量按10ml/kg灌胃給藥。給藥后各小鼠即腹腔注射0.6％乙酸0.2ml/只，觀察注射乙酸后15min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的扭體反應(yīng)數(shù)和扭體反應(yīng)次數(shù)。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果用χ2檢驗(yàn)(計(jì)數(shù)資料)和t檢驗(yàn)(計(jì)量資料)。顯示，本發(fā)明顆粒10.8、21.6g/kg和43.2g/kg三個(gè)劑量組對(duì)小鼠扭體反應(yīng)無(wú)明顯抑制作用
表17對(duì)乙酸刺激致小鼠疼痛反應(yīng)的影響
*p<0.05**p<0.01與空白對(duì)照組比較
(二)對(duì)電刺激致小鼠足跖疼痛反應(yīng)的影響[6]
1.實(shí)驗(yàn)方法
取昆明種小鼠100只，體重19～21g，♀♂各半。隨機(jī)分為5組：分別為(1)空白對(duì)照組：生理鹽水10ml/kg；(2)抗病毒顆粒組：6g/kg；(3)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg；(4)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg；(5)本發(fā)明顆粒3組：43.20g/kg。用ysd-4g藥理生理多用儀進(jìn)行測(cè)定。首先將小鼠放在導(dǎo)電銅絲板上，通電后調(diào)節(jié)電壓輸出鈕，使電壓由低到高，以秒表記錄時(shí)間。當(dāng)小鼠出現(xiàn)第一聲尖叫時(shí)立即斷電，記錄電壓和頻率值，作為該小鼠的痛閾值(若用藥前到達(dá)痛閾值超過(guò)15秒者剔除不用)。然后各組按上述劑量灌胃給藥，于給藥后0.5h、1h、2h、3h，①在原電壓和頻率的情況下，測(cè)定小鼠出現(xiàn)尖叫的動(dòng)物數(shù)；②電壓由低到高，測(cè)定小鼠出現(xiàn)第一聲尖叫的痛閾值(若用藥后到達(dá)痛閾值超過(guò)45秒者即切斷刺激，作為鎮(zhèn)痛作用)。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)(計(jì)數(shù)資料)和t檢驗(yàn)(計(jì)量資料)。顯示，本發(fā)明顆粒10.8、21.6、43.2g/kg三個(gè)劑量組均未能減少小鼠對(duì)電刺激致痛反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)，也未能提高其電壓閾值百分率，與空白對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(p>0.05,0.01)，表明本發(fā)明顆粒對(duì)電刺激致小鼠足跖疼痛反應(yīng)無(wú)明顯的抑制作用。見(jiàn)表18、19。
表18對(duì)電刺激致小鼠足跖疼痛反應(yīng)的影響
n＝20
表19對(duì)電刺激致小鼠足跖疼痛的影響
n＝20*p<0.05**p<0.01與空白對(duì)照組比較
五、本發(fā)明顆粒的解熱作用
(一)對(duì)干酵母所致大鼠發(fā)熱的解熱作用[1]
(1)實(shí)驗(yàn)方法
取雄性sd大鼠80只，體重160～180g。測(cè)正常體溫，每日2次，連續(xù)3日。實(shí)驗(yàn)日每小時(shí)測(cè)體溫1次，連續(xù)3次，選取體溫變動(dòng)不高于0.3℃的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。取合格大鼠，每鼠于背部皮下注射20％干酵母溶液15ml/kg，4小時(shí)后若大鼠體溫升高>1℃者進(jìn)行分組給藥。選取發(fā)熱合格大鼠50只，隨機(jī)分為5組：(1)空白對(duì)照組：ns10ml/kg；(2)抗病毒顆粒組：6g/kg；(3)本發(fā)明顆粒1組：5.4g/kg；⑷本發(fā)明顆粒2組：10.8g/kg；(5)本發(fā)明顆粒3組：21.6g/kg。各組均按10ml/kg灌胃給藥。于給藥后60、90、120、180、240min觀察大鼠體溫變化。
(2)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明顆粒中劑量組在給藥后180分鐘時(shí)，體溫下降值與空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異(p<0.01)；本發(fā)明顆粒高劑量組在給藥后210和240分鐘時(shí)，體溫下降值與空白組相比，具有顯著性差異(p<0.01)，提示本發(fā)明顆粒具有對(duì)干酵母所大鼠發(fā)熱模型具有一定的解熱作用。見(jiàn)表20。
表20對(duì)干酵母所致大鼠發(fā)熱的影響
*p<0.05**p<0.01與空白對(duì)照組比較
(二)對(duì)2，4-二硝基苯酚所致大鼠發(fā)熱的解熱作用[1]
1.實(shí)驗(yàn)方法
取雄性sd大鼠60只，體重160～180g。測(cè)正常體溫，每日2次，連續(xù)3日。實(shí)驗(yàn)日每小時(shí)測(cè)體溫1次，連續(xù)3次，選取體溫變動(dòng)不高于0.3℃的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。取合格大鼠，每鼠于背部皮下注射2，4-二硝基苯酚28mg/kg，60min后若大鼠體溫升高>1℃者進(jìn)行分組給藥。選取發(fā)熱合格大鼠41只，隨機(jī)分為5組：(1)空白對(duì)照組：ns10ml/kg；(2)抗病毒顆粒組：6g/kg；(3)本發(fā)明顆粒1組：5.4g/kg；⑷本發(fā)明顆粒2組：10.8g/kg；(5)本發(fā)明顆粒3組：21.6g/kg。各組均按10ml/kg灌胃給藥。于給藥后15、30、45、60、90、120、180min觀察大鼠體溫變化。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明顆粒5.4、10.8、21.6g/kg三個(gè)劑量組在給藥后60分鐘開(kāi)始，體溫低值均大于空白對(duì)照組，其中本發(fā)明顆粒高劑量組在給藥后60、90、120分鐘時(shí)，體溫下降值與空白組相比，有顯著性差異(p<0.05或0.01)；本發(fā)明顆粒中、低劑量組在給藥后60和90分鐘時(shí)，體溫下降值與空白組相比，具有顯著性差異(p<0.01)。提示本發(fā)明顆粒具有一定的解熱作用。見(jiàn)表21。
表21對(duì)2，4-二硝基苯酚所致大鼠發(fā)熱的影響
*p<0.05**p<0.01與空白對(duì)照組比較
(三)對(duì)內(nèi)毒素所致家兔發(fā)熱的解熱作用[1]
1.方法
取大耳白家兔50只，體重1.8～2.2㎏，雌雄各半。每日測(cè)體溫2次，連續(xù)3日。實(shí)驗(yàn)日致熱前每小時(shí)測(cè)體溫1次，連續(xù)3次，選擇體溫范圍38.6～39.5℃，且體溫波動(dòng)在0.3℃內(nèi)家兔作為合格家兔。每兔均從耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素2.5μg/kg，于致熱1小時(shí)后測(cè)體溫，選擇發(fā)熱體溫達(dá)1℃以上者作為發(fā)熱合格家兔。取發(fā)熱合格家兔35只，隨機(jī)分為5組：(1)空白對(duì)照組：2ml/kg；(2)抗病毒顆粒組:6g/kg；(3)本發(fā)明顆粒1組：3g/kg；(4)本發(fā)明顆粒2組：6g/kg；(5)本發(fā)明顆粒3組：12g/kg。各組均按2ml/kg體重的容積灌胃給藥，藥后60、120、180、240、300min測(cè)量家兔體溫。
3.2結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明顆粒3、6、12g/kg三個(gè)劑量組給藥120min后體溫降低值均大于空白對(duì)照組，與對(duì)照組相比，有顯顯著性差異。表明本發(fā)明顆粒對(duì)內(nèi)毒素所致家兔發(fā)熱的體溫有良好的降低作用。見(jiàn)表18。
表22對(duì)內(nèi)毒素所致家兔發(fā)熱的影響(n＝7，
*p<0.05，**p<0.01與空白對(duì)照組比較
六、本發(fā)明顆粒的止咳作用
(一)小鼠氨水引咳法
取昆明種小鼠60只，雄性，體重18—22g，隨機(jī)分6組：(1)空白對(duì)照組：給予生理鹽水；(2)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg鼠重給藥；(3)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg鼠重給藥；(4)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg鼠重給藥；(5)小兒寶泰康組：22ml/kg鼠重給藥；(6)小兒咳喘靈組：20mg/kg鼠重給藥。(1)-(4)給藥容積均為10ml/kg，各組每天給藥一次，連續(xù)給藥5d，小兒咳喘靈組連續(xù)給藥3d。末次給藥45min，將小鼠置于500ml的鐘罩中，以超聲霧化器將25％濃氨水噴霧5秒鐘，然后觀察和記錄小鼠咳嗽的潛伏期和5分鐘內(nèi)咳嗽的次數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表23。
表23本發(fā)明顆粒對(duì)小鼠氨水所致引咳潛伏期和咳嗽次數(shù)的影響(x±s)
與空白對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明顆粒三個(gè)劑量給藥均能明顯延長(zhǎng)氨水所致小鼠引咳潛伏期，減少小鼠的咳嗽次數(shù)。表明本發(fā)明顆粒具有顯著地鎮(zhèn)咳作用.
(二)豚鼠電刺激的止咳作用
取豚鼠30只，雌雄兼用，體重300～400g，隨機(jī)分6組：(1)空白對(duì)照組：給予生理鹽水；(2)本發(fā)明顆粒1組：5.4g/kg；(3)本發(fā)明顆粒2組：10.8g/kg鼠重給藥；(4)本發(fā)明顆粒3組：15.0g/kg鼠重給藥；(5)小兒咳喘靈組：7.0mg/kg鼠重給藥；(6)小兒寶泰康組：8.6ml/kg鼠重給藥；(1)～(5)給藥容積均為10ml/kg，各組每天給藥一次，連續(xù)給藥5d，小兒咳喘靈組連續(xù)給藥3d，末次給藥后30min，以25％的烏拉坦1g/kgip麻醉，分離氣管，插入y形氣管套管，一個(gè)支管與壓力換能器相連，連接二道生理記錄儀器，記錄呼吸運(yùn)動(dòng)。用一白金制的單極電極固定于氣管背面，另一無(wú)關(guān)電極插入胸部皮下組織中(手術(shù)過(guò)程10min做完)。于給藥45min時(shí)，采用刺激強(qiáng)度3.5v，脈沖寬度50ms，頻率10次/秒，刺激時(shí)間20s，從記錄紙讀取咳嗽次數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表24。
表24對(duì)豚鼠電刺激所致的咳嗽次數(shù)的影響(x±s)
與空白對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明顆粒10.8g/kg、21.6g/kg兩個(gè)劑量給藥均能明顯減少豚鼠電刺激所致咳嗽次數(shù)。提示本發(fā)明顆粒具有一定的鎮(zhèn)咳作用。
(三)本發(fā)明祛痰試驗(yàn)(小鼠酚紅法)
取昆明種小鼠50只，雄性，體重20～25g，隨機(jī)分5組：(1)空白對(duì)照組：給予容積生理鹽水；(2)本發(fā)明顆粒1組：10.8g/kg鼠重給藥；(3)本發(fā)明顆粒2組：21.6g/kg鼠重給藥；(4)本發(fā)明顆粒3組：43.2g/kg鼠重給藥；(5)氯化氨組：1.0g/kg鼠重給藥；各組每天給藥一次，連續(xù)給藥3d，給藥容積均為10ml/kg。末次給藥30min后，腹腔注射5％酚紅生理鹽水溶液500mg/kg，注射后30分鐘，處死動(dòng)物，分離氣管，以1ml注射器取2.24mmol/lnahco3溶液0.5ml，沖洗氣道3次，吸取灌洗液0.5ml，重復(fù)上述操作3次，共吸取灌洗液1.5ml，將沖洗液吸入試管。在波長(zhǎng)546nm處，測(cè)量od值。結(jié)果見(jiàn)表25。
表25對(duì)小鼠氣道內(nèi)酚紅排出量的影響(x±s)
與空白對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明顆粒21.6g/kg、43.2g/kg兩個(gè)劑量組小鼠氣道酚紅排出量均大于空白對(duì)照組，與空白組相比，均具有顯著性差異(*p<0.05)，提示本發(fā)明顆粒具有增加氣道分泌物，促進(jìn)痰液排出的作用。
藥理毒理試驗(yàn)：
一、急性毒性試驗(yàn)
本發(fā)明顆粒在最大濃度，最大容積一次灌胃給藥，劑量為75g(生藥)/kg體重，小鼠未見(jiàn)死亡，表明本發(fā)明顆粒毒性較低，無(wú)法測(cè)出ld50，因此改做一日內(nèi)多次最大給藥量實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明顆粒按一日內(nèi)最大給藥量225g(生藥)/kg體重(相當(dāng)于臨床用量的229倍)灌胃給藥，小鼠活動(dòng)、體重增長(zhǎng)等均正常，一周內(nèi)也未見(jiàn)其它異常情況發(fā)生。
二、長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)
用本發(fā)明顆粒18.75g/kg、37.5g/kg、75g/kg三個(gè)劑量組連續(xù)給大鼠灌胃給藥4周：
(1)結(jié)果一般體征良好，大鼠體重增長(zhǎng)、進(jìn)食量正常，與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(p>0.05)；
(2)血液學(xué)檢查結(jié)果顯示：在給藥4周和恢復(fù)期時(shí)，本發(fā)明顆粒低、中、高三個(gè)劑量組各指標(biāo)與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(p>0.05)；
(3)血液生化指標(biāo)檢查結(jié)果顯示：血液生化指標(biāo)與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。
(4)臟器系數(shù)檢查結(jié)果顯示：臟器系數(shù)于給藥4周和停藥2周各劑量組與對(duì)照組比較均未見(jiàn)有顯著性差異(p>0.05)；
(5)組織學(xué)檢查結(jié)果顯示：本發(fā)明顆粒給藥4周和停藥2周，高劑量組心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、甲狀腺、胸腺、腎上腺、垂體、前列腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮等臟器組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性壞死、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)等由藥物引起的病理變化，也未見(jiàn)任何新的組織病理學(xué)改變及由藥物所致的實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性、壞死等遲發(fā)性毒性反應(yīng)。
綜上所述，本發(fā)明顆粒18.75g/kg、37.5g/kg、75g/kg三個(gè)劑量組給大鼠連續(xù)灌胃給藥4周，結(jié)果對(duì)大鼠一般體征、體重、進(jìn)食量、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、臟器系數(shù)及主要臟器心、肝、脾、肺、腎、腦、甲狀腺、胸腺、腎上腺、垂體、前列腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮等組織形態(tài)學(xué)基本無(wú)明顯影響，表明本發(fā)明顆?？诜o藥給藥毒性較小。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述：
實(shí)施例1
黃芩175g，野馬追350g，金銀花175g，鴨跖草175g，粉碎成粗粉，加10倍量70％乙醇回流提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，濾過(guò)，濾液回收乙醇并濃縮成1.30～1.35(60～65℃測(cè))的清膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加入糊精640g，甜菊素8g，檸檬酸3g，混勻，80％乙醇制粒，干燥，制成1000g，即得。
實(shí)施例2
黃芩350g，野馬追700g，金銀花350g，鴨跖草350g，粉碎成粗粉，加10倍量70％乙醇回流提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，濾過(guò)，濾液回收乙醇并濃縮成1.30～1.35(60～65℃測(cè))的清膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加入糊精640g，甜菊素8g，檸檬酸3g，混勻，80％乙醇制粒，干燥，制成1000g，即得。
實(shí)施例3
黃芩525g，野馬追1050g，金銀花525g，鴨跖草525g，粉碎成粗粉，加10倍量70％乙醇回流提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，濾過(guò)，濾液回收乙醇并濃縮成1.30～1.35(60～65℃測(cè))的清膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加入糊精640g，甜菊素8g，檸檬酸3g，混勻，80％乙醇制粒，干燥，制成1000g，即得。