本發(fā)明屬于骨科植入體制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗菌仿生多孔鈦植入體及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種冷凍鑄造和熱氧化技術(shù)制備抗菌仿生多孔鈦植入體的方法。

背景技術(shù)：

鈦及鈦合金作為骨替代材料具有良好的生物相容性和力學(xué)性能等眾多優(yōu)點(diǎn)，但由于鈦及鈦合金植入體的彈性模量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然人體骨皮質(zhì)，作為承載骨替代材料植入體內(nèi)后，與骨組織之間僅以機(jī)械整合而非牢固的生物性結(jié)合，尤其是當(dāng)植入體表面細(xì)菌的生長和繁殖引起的植入體松動(dòng)及周圍骨組織炎癥反應(yīng)等嚴(yán)重并發(fā)癥，將增加骨植入手術(shù)后失敗的風(fēng)險(xiǎn)從而限制其在臨床上的應(yīng)用。

新型骨植入體需要與骨組織活體細(xì)胞之間產(chǎn)生特殊的響應(yīng)及相互作用，從而在生理環(huán)境下能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)展成有生命力的新生骨組織或器官，即良好的骨整合性能。因此，獲得類似人體骨組織孔隙形貌和孔徑大小同時(shí)具有良好力學(xué)性能的仿生多孔鈦植入體成為骨植入體的重要研究方向之一。形成良好的骨植入體-骨結(jié)合界面是種植體種植成功的關(guān)鍵所在，調(diào)控成骨細(xì)胞在材料表面的行為和成骨細(xì)胞的黏附增殖能力，以及抑制骨植入體-骨結(jié)合界面細(xì)菌的生長和繁殖對(duì)于形成良好的骨結(jié)合界面至關(guān)重要，所以如何同時(shí)實(shí)現(xiàn)植入體的納米化表面改性及使其具備抗菌性能的研究也成為研發(fā)新一代抗菌仿生多孔鈦植入體的熱點(diǎn)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種兼具良好的抗菌功能、優(yōu)異的骨整合性能和力學(xué)性能的抗菌仿生多孔鈦植入體及其制備方法和應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種抗菌仿生多孔鈦植入體，所述抗菌仿生多孔鈦植入體呈圓柱體結(jié)構(gòu)，具有沿圓柱體外周向圓柱體中央呈放射狀各向異性的多孔結(jié)構(gòu)，所述多孔結(jié)構(gòu)的孔徑沿圓柱體外周向圓柱體中央呈由小到大的梯度分布，所述多孔結(jié)構(gòu)的孔基底表面具有針狀微納結(jié)構(gòu)。

上述的抗菌仿生多孔鈦植入體中，優(yōu)選的，所述抗菌仿生多孔鈦植入體的孔隙度為40％～70％、開孔率為90％～99％、平均孔徑大小為80μm～150μm、壓縮強(qiáng)度為30mpa～165mpa，彈性模量為1gpa～4gpa，所述抗菌仿生多孔鈦植入體對(duì)革蘭氏陰性菌的滅菌率大于90％，對(duì)革蘭氏陽性菌的滅菌率大于85％。

作為一個(gè)總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法，包括以下步驟：

(1)漿料制備：將鈦粉末與介質(zhì)溶劑在水浴加熱條件下持續(xù)攪拌混合，得到漿料，漿料中鈦粉的體積分?jǐn)?shù)為10％～20％；

(2)冷凝固化：將步驟(1)所得漿料倒入預(yù)冷的模具中于20℃～25℃下進(jìn)行冷凝固化，模具內(nèi)設(shè)有圓柱形腔體，模具保持密封隔熱，冷凝固化后，脫模干燥，得到干燥坯樣；

(3)燒結(jié)：將步驟(2)所得干燥坯樣先在真空條件下以速率1℃/min～5℃/min加熱升溫至400℃～600℃，然后在惰性氣氛下以速率5℃/min～10℃/min升溫至1200℃～1300℃進(jìn)行燒結(jié)，燒結(jié)持續(xù)時(shí)間為1h～4h，然后冷卻至室溫，得到多孔鈦植入物試樣；

(4)表面微納結(jié)構(gòu)處理：將步驟(3)所得多孔鈦植入體試樣進(jìn)行超聲清洗并干燥，將所得干燥坯樣在惰性氣氛下以速率10℃/min～15℃/min升溫至850℃～900℃后，在惰性氣氛的氣流中持續(xù)加入丙酮，并控制惰性氣體的流速為50sccm～300sccm進(jìn)行燒結(jié)，燒結(jié)持續(xù)時(shí)間為45min～60min，燒結(jié)后冷卻至室溫，得到抗菌仿生多孔鈦植入體。

上述的抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法中，優(yōu)選的，所述步驟(1)中，所述介質(zhì)溶劑為莰烯，所述水浴加熱的溫度為60℃～65℃。

上述的抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法中，優(yōu)選的，所述步驟(1)中，所述攪拌的時(shí)間為2h～4h，所述攪拌的速度為800r/min～1000r/min，攪拌同時(shí)在攪拌容器上放置覆蓋物以減少溶劑蒸發(fā)。

上述的抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法中，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述模具的預(yù)冷溫度與冷凝固化溫度相同，所述模具的預(yù)冷時(shí)間為30min～120min，所述冷凝固化的時(shí)間為4h～6h。

上述的抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法中，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，在冷凝固化后和脫模干燥前，于-18℃～-20℃低溫下保存12h～24h，進(jìn)一步固化試樣；所述干燥為真空冷凍干燥，所述干燥的時(shí)間為24h～48h。

上述的抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法中，優(yōu)選的，所述步驟(4)中，所述超聲清洗先后采用丙酮、無水乙醇和雙蒸水作為清洗液，各清洗15min～20min；所述干燥的溫度為60℃～80℃，所述干燥的時(shí)間為4h～6h。

上述的抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法中，優(yōu)選的，所述步驟(4)中，所述丙酮為液態(tài)的丙酮；燒結(jié)后停止加入丙酮，控制惰性氣體的流速為500sccm～600sccm條件下自然冷卻至室溫。

作為一個(gè)總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的抗菌仿生多孔鈦植入體或者上述的制備方法制得的抗菌仿生多孔鈦植入體的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明通過冷凍鑄造法(即步驟(1)至步驟(3))控制模具中介質(zhì)冷凝固化的方向，即控制冷凝固化時(shí)介質(zhì)沿模具外周至模具中央的溫差(即圓柱體內(nèi)腔的徑向溫差，如外周20℃至中央60℃形成的溫差)，實(shí)現(xiàn)多孔鈦植入體呈向圓柱體中央放射狀各向異性且孔徑梯度分布的孔隙形貌，其多孔結(jié)構(gòu)與天然人體骨骼組織非常相似。

(2)本發(fā)明通過控制和優(yōu)化冷凍鑄造中包括混合漿料的鈦粉體積比、燒結(jié)溫度、燒結(jié)速度和燒結(jié)時(shí)間等工藝參數(shù)，實(shí)現(xiàn)制備的抗菌仿生多孔鈦植入體具備良好的孔隙率、孔徑大小和優(yōu)異的力學(xué)性能，有效的滿足骨細(xì)胞長入多孔鈦植入體內(nèi)形成生物性的骨整合的條件。

(2)本發(fā)明通過熱氧化法(即步驟(1))實(shí)現(xiàn)多孔鈦植入體內(nèi)所有三維孔隙基底表面均勻生長出納米針狀結(jié)構(gòu)，針狀結(jié)構(gòu)的長約100～200nm。與傳統(tǒng)多孔材料相比，本發(fā)明的仿生多孔鈦植入體孔隙中均勻分布的針狀納米結(jié)構(gòu)通過調(diào)控成骨細(xì)胞在材料表面的吸附作用、生物學(xué)響應(yīng)等方面促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖、分化性能和體內(nèi)骨形成、沉積和鈣化，隨著植入時(shí)間的延長，成骨細(xì)胞在其孔隙中分化更加成熟，形成牢固的生物性骨整合，具有很顯著的進(jìn)步。同時(shí)針狀納米結(jié)構(gòu)通過物理效應(yīng)有效抑制植入體周圍的細(xì)菌的生長，是一種新型兼具抗菌功能和良好骨整合性能且具有良好生物相容性的表面改性仿生多孔鈦植入體。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的抗菌仿生多孔鈦植入體橫斷面的sem圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的抗菌仿生多孔鈦植入體孔基底表面針狀微納結(jié)構(gòu)的sem圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。

實(shí)施例1：

一種本發(fā)明的抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法，包括以下步驟：

(1)漿料制備：將鈦粉末與介質(zhì)溶劑莰烯在60℃水浴箱中持續(xù)磁力攪拌混合2小時(shí)，攪拌速度為800r/min，在攪拌容器的上方放置覆蓋物，減少溶劑莰烯蒸發(fā)。所得漿料混合物中鈦粉的體積分?jǐn)?shù)占10％。

(2)冷凝固化：將圓柱形模具置于水浴箱中預(yù)冷30分鐘，預(yù)冷溫度為20℃，將配制好的漿料緩緩倒入預(yù)冷的模具中，模具內(nèi)腔為圓柱形，模具的上下端保持密封隔熱，控制冷凝固化溫度在20℃，冷凝固化時(shí)間為4小時(shí)。冷凝固化后，取出模具放置在-20℃低溫下保存12h，進(jìn)一步固化試樣。取出試樣脫模后放入冷凍真空干燥箱中干燥24h，得到干燥坯樣。

(3)燒結(jié)：將干燥坯樣置于燒結(jié)爐中，先在真空條件下以速率為1℃/min加熱升溫至400℃，然后在氬氣氣氛下以速率為5℃/min升溫至1200℃進(jìn)行燒結(jié)，燒結(jié)持續(xù)時(shí)間為1h，自然冷卻至室溫，得到多孔鈦植入物試樣。

(4)表面微納結(jié)構(gòu)處理：將燒結(jié)后得到的多孔鈦植入體試樣先后用丙酮、無水乙醇和雙蒸水作為清洗液，在超聲波清洗機(jī)中各清洗15min，然后于高溫干燥箱中80℃干燥4小時(shí)。將干燥坯樣置于燒結(jié)爐中，在氬氣氣氛下以速率為10℃/min升溫至850℃，氬氣流中持續(xù)加入25℃丙酮，控制氬氣氣體流速為50sccm進(jìn)行燒結(jié)，燒結(jié)持續(xù)時(shí)間為45min，然后停止通丙酮，控制氬氣氣體流速為500sccm條件下自然冷卻至室溫，得到抗菌仿生多孔鈦植入體，該抗菌仿生多孔鈦植入體具有表面針狀微納結(jié)構(gòu)。

如圖1和圖2所示，為本實(shí)施例制備的抗菌仿生多孔鈦植入體橫斷面和孔隙表面的sem圖，由圖可以看出，該植入體具有多孔結(jié)構(gòu)，沿圓柱體外周向圓柱體中央呈放射狀各向異性且孔徑呈由小到大的梯度分布，該多孔結(jié)構(gòu)與天然人體骨骼組織非常相似，多孔植入體的孔隙表面具有針狀微納結(jié)構(gòu)，針狀結(jié)構(gòu)的長約100～200nm，說明本發(fā)明的方法可以制備出納米針狀表面改性的抗菌仿生多孔鈦植入體。經(jīng)測試，本實(shí)施例的多孔鈦植入體的孔隙度58.32±1.08％、開孔率97.70％、平均孔徑大小126.17±18.64μm、壓縮強(qiáng)度58.51±20.38mpa及彈性模量1.70±0.52gpa。植入物生物相容性達(dá)到與臨床應(yīng)用要求。植入體孔隙中的針狀納米結(jié)構(gòu)能促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖、分化性能和體內(nèi)骨形成、沉積和鈣化，隨著植入時(shí)間的延長，成骨細(xì)胞在其孔隙中分化更加成熟，形成牢固的生物性骨整合。

本實(shí)施例制備的抗菌仿生多孔鈦植入體可應(yīng)用于骨科植入物領(lǐng)域，還可應(yīng)用于其它相關(guān)的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

實(shí)施例2：

一種本發(fā)明的抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)漿料制備：將鈦粉末與介質(zhì)溶劑莰烯在65℃水浴箱中持續(xù)磁力攪拌混合4小時(shí)，攪拌速度為1000r/min，在攪拌容器的上方放置覆蓋物，減少溶劑莰烯蒸發(fā)。所得漿料混合物中鈦粉的體積分?jǐn)?shù)占20％。

(2)冷凝固化：將圓柱形模具置于水浴箱中預(yù)冷30分鐘，預(yù)冷溫度為20℃。將配制好的混合漿料緩緩倒入預(yù)冷的模具中，橫具內(nèi)腔為圓柱形，模具的上下端保持密封隔熱。冷凝固化溫度控制在20℃，固化時(shí)間為4小時(shí)。取出模具放置在-20℃低溫下保存12h，進(jìn)一步固化試樣。取出試樣脫模后放入冷凍真空干燥箱中干燥24h。

(3)燒結(jié)：將干燥坯樣置于燒結(jié)爐中，先在真空條件下以速率為5℃/min加熱升溫至400℃，然后在氬氣氣氛下以速率為10℃/min升溫至1200℃進(jìn)行燒結(jié)，燒結(jié)持續(xù)時(shí)間為4h，自然冷卻至室溫，得到多孔鈦植入物試樣。

(4)表面微納結(jié)構(gòu)處理：燒結(jié)后的多孔鈦植入體試樣先后用丙酮、無水乙醇和雙蒸水作為清洗液，在超聲波清洗機(jī)中各清洗15min，然后于高溫干燥箱中80℃干燥4小時(shí)。將干燥坯樣置于燒結(jié)爐中，在氬氣氣氛下以速率為15℃/min升溫至850℃，氬氣流中持續(xù)加入25℃丙酮，控制氬氣氣體流速為300sccm進(jìn)行燒結(jié)，燒結(jié)持續(xù)時(shí)間為45min，然后停止通丙酮，控制氬氣氣體流速為500sccm條件下自然冷卻至室溫，得到抗菌仿生多孔鈦植入體。

經(jīng)測試，利用上述本實(shí)施例的方法制備了納米針狀表面改性的抗菌仿生多孔鈦植入體，該抗菌仿生多孔鈦植入體呈圓柱體結(jié)構(gòu)，具有沿圓柱體外周向圓柱體中央呈放射狀各向異性的多孔結(jié)構(gòu)，多孔結(jié)構(gòu)的孔徑沿圓柱體外周向圓柱體中央呈由小到大的梯度分布，多孔結(jié)構(gòu)的孔表面具有針狀微納結(jié)構(gòu)。本實(shí)施例的產(chǎn)品的孔隙度45.99±2.15％、開孔率92.50％、平均孔徑大小94.35±2.01μm、壓縮強(qiáng)度147.12±15.53mpa及彈性模量2.99±0.12gpa。植入物生物相容性達(dá)到臨床應(yīng)用要求。植入體孔隙中的針狀納米結(jié)構(gòu)能促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖、分化性能和體內(nèi)骨形成、沉積和鈣化，隨著植入時(shí)間的延長，成骨細(xì)胞在其孔隙中分化更加成熟，形成牢固的生物性骨整合。

實(shí)施例3：

一種本發(fā)明的抗菌仿生多孔鈦植入體的制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)漿料制備：將鈦粉末與介質(zhì)溶劑莰烯在60℃水浴箱中持續(xù)磁力攪拌混合4小時(shí)，攪拌速度為800r/min，在攪拌容器的上方放置覆蓋物，減少溶劑莰烯蒸發(fā)。所得漿料混合物中鈦粉的體積分?jǐn)?shù)占15％。

(2)冷凝固化：將圓柱形模具置于水浴箱中預(yù)冷30分鐘，預(yù)冷溫度為25℃。將配制好的混合漿料緩緩倒入預(yù)冷的模具中，模具內(nèi)腔為圓柱形，模具的上下端保持密封隔熱。冷凝固化溫度控制在25℃，固化時(shí)間為4小時(shí)。取出模具放置在-20℃低溫下保存12h，進(jìn)一步固化試樣。取出試樣脫模后放入冷凍真空干燥箱中干燥24h。

(3)燒結(jié)：將干燥坯樣置于燒結(jié)爐中，先在真空條件下以速率為1℃/min加熱升溫至400℃，然后在氬氣氣氛下以速率為10℃/min升溫至1300℃進(jìn)行燒結(jié)，燒結(jié)持續(xù)時(shí)間為1h，自然冷卻至室溫，得到多孔鈦植入物試樣。

(4)表面微納結(jié)構(gòu)處理：燒結(jié)后的多孔鈦植入體試樣先后用丙酮、無水乙醇和雙蒸水作為清洗液，在超聲波清洗機(jī)中各清洗15min，然后于高溫干燥箱中80℃干燥4小時(shí)。將所得干燥坯樣置于燒結(jié)爐中，在氬氣氣氛下以速率為10℃/min升溫至850℃，氬氣流中持續(xù)加入25℃丙酮，控制氬氣氣體流速為200sccm進(jìn)行燒結(jié)，燒結(jié)持續(xù)時(shí)間為45min，然后停止通丙酮，控制氬氣氣體流速為500sccm條件下自然冷卻至室溫，得到抗菌仿生多孔鈦植入物。

經(jīng)測試，利用上述本實(shí)施例的方法制備了納米針狀表面改性的抗菌仿生多孔鈦植入體，該抗菌仿生多孔鈦植入體呈圓柱體結(jié)構(gòu)，具有沿圓柱體外周向圓柱體中央呈放射狀各向異性的多孔結(jié)構(gòu)，多孔結(jié)構(gòu)的孔徑沿圓柱體外周向圓柱體中央呈由小到大的梯度分布，多孔結(jié)構(gòu)的孔表面具有針狀微納結(jié)構(gòu)。本實(shí)施例的植入體的孔隙度54.19±2.01％、開孔率94.49％、平均孔徑大小104.16±16.05μm、壓縮強(qiáng)度113.37±25.18mpa及彈性模量2.85±0.25gpa。植入物生物相容性達(dá)到與臨床應(yīng)用要求。植入體孔隙中的針狀納米結(jié)構(gòu)能促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖、分化性能和體內(nèi)骨形成、沉積和鈣化，隨著植入時(shí)間的延長，成骨細(xì)胞在其孔隙中分化更加成熟，形成牢固的生物性骨整合。

體外抗菌實(shí)驗(yàn)：

本發(fā)明進(jìn)行的體外抗菌實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3三種仿生多孔鈦植入體能明顯抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。

以下是本發(fā)明進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)的例子，抗菌性能檢測方法如下：(1)lb培養(yǎng)基制法：用天平稱取10g胰化蛋白胨、5g酵母膏、10g氯化鈉、20g瓊脂，將上述成分充分溶解于1000ml蒸餾水中，將配好的溶液用0.1mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)ph至7.0，分裝后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃下滅菌20min后備用。(2)磷酸鹽緩沖劑(pbs)制法：將2.84g磷酸氫二鈉和1.36g磷酸二氫鉀溶解于1000ml蒸餾水中，將配好的溶液調(diào)節(jié)ph至7.2～7.4，壓力蒸汽121℃滅菌30分鐘后備用。(3)本實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)樣品針對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抗菌性能進(jìn)行了檢測。其中革蘭氏陰性菌選取的代表菌種是大腸桿菌，革蘭氏陽性菌選取代表菌種為金黃色葡萄球菌。進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)的樣品是致密鈦對(duì)照試樣和本發(fā)明的抗菌仿生多孔鈦試樣，每種樣品各4組。將樣品用丙酮、無水乙醇及蒸餾水清洗后，在121℃下高壓滅菌30分鐘備用。將滅菌后試樣放置在培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)皿中滴入1000μl滅菌pbs緩沖液。用pbs液將接種后的菌種稀釋成濃度為1×10⁵的標(biāo)準(zhǔn)菌液；移液槍吸取100μl菌液滴到試樣表面，均勻涂開，并在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。移液槍從試樣表面吸取80μl菌液并均勻滴在lb培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將菌液涂抹均勻。涂好的培養(yǎng)皿放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后取出培養(yǎng)皿，計(jì)算每個(gè)試樣表面所含的菌落總數(shù)。抗菌率計(jì)算公式為：

其中k為樣品抗菌率，a為空白樣品即致密鈦上的細(xì)菌平均數(shù)，b為抗菌仿生多孔鈦測試樣品上的細(xì)菌平均數(shù)。

抗菌試驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)致密鈦對(duì)照試樣和抗菌仿生多孔鈦試樣采用平板法進(jìn)行了抗菌性能檢測，并求出了滅菌率。表1為抗菌仿生多孔鈦試樣對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的滅菌率，結(jié)果顯示本發(fā)明的抗菌仿生多孔鈦植入體對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都表現(xiàn)出良好的抗菌效果。

表1抗菌仿生多孔鈦的抗菌測試結(jié)果

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。