本發(fā)明涉及護膚品
技術(shù)領域：
，特別是涉及一種抑制黑色素沉著組合物及其應用。
背景技術(shù)：
：隨著現(xiàn)代生活水平的提高，人們越來越注重外部形象。以美好的形象在各自活動和場合增加自信，同時在美好的外表下，追求皮膚的健康，以健康的皮膚和美好的形象展現(xiàn)人們對高端生活的追求。東方女性歷來推崇“膚如雪，凝如脂”的肌膚至高境界。人們已經(jīng)不再滿足于以粉等來掩飾面部瑕疵，而是更加追求自然的美白效果更加關(guān)注健康的美白方式。黑色素的形成過程，存在于黑色素細胞組織中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下逐步轉(zhuǎn)化為純黑色素和褐黑素，進而黑色素細胞組織將黑色素轉(zhuǎn)移至表皮基底層細胞中，隨著細胞的新陳代謝而被帶到角質(zhì)層中，隨著角質(zhì)化細胞脫落。但當黑色過速增長或分布不均時，就會造成局部皮膚過黑及色素沉著。世界上第一款美白產(chǎn)品于1897年正式問世于日本資生堂，其發(fā)展經(jīng)歷以下階段：第一階段：“增白”階段。主要以表面遮蓋，物理性增白成分為主，簡單強調(diào)產(chǎn)品令肌膚更加白的表觀特性，如早期的增白粉蜜等。但其給皮膚帶來諸多弊端，不僅對肌膚無實質(zhì)性增白，促白作用，還會因長期使用造成毛孔或皮脂腺堵塞，影響排汗和新陳代謝，導致皮膚疾病(如局部炎癥、痤瘡等)的發(fā)生，其“增白”只是一種遮蓋性暫時的增白。第二階段：“漂白”階段。常通過天然礦物等物理磨剝成分或果酸等化學成分，磨剝或刺激表皮角質(zhì)層細胞使其快速脫落，從而達到換膚漂白的目的，如磨砂膏或煥膚霜等。長期使用可至肌膚免疫力下降，是一種典型的治標不治本的美白方式。第三階段：“協(xié)同”美白階段。通過添加多種美白成分，多方位干擾黑色的形成或加速其分解代謝，相對前者而言，第三代無論在原料選擇和美白機理認知和應用方面都有了質(zhì)的飛躍，能解決皮膚美白的基本問題，但它依然停留在外部干擾阻擾美白階段。因此，美白類化妝品是人們所追求的，在市場上具有很高的占有率。美白類化妝品從物理性遮蓋美白到物理性和化學性剝離，再到干擾黑色素正常的新陳代謝，發(fā)展到“協(xié)同效應”美白。美白產(chǎn)品從問世以來一直發(fā)展，但不恰當?shù)拿腊淄緩?，給消費者帶來了不同程度的皮膚傷害，使得皮膚衰老加快，甚至破壞了皮膚原有的防御功能，讓皮膚更加敏感，更容易受到傷害。傳統(tǒng)美白化妝品采用果酸等化學成分直接剝離角質(zhì)層，長期使用可使得肌膚免疫力下降，角質(zhì)層變薄，呈現(xiàn)紅血絲等新的肌膚問題。通常角質(zhì)層剝離后，皮膚干燥或油性肌膚則會出現(xiàn)油光的鏡面反射，非鏡面反射方向，看到的皮膚暗淡無光。因此需要開發(fā)健康的美白產(chǎn)品。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，本發(fā)明的目的是提供一種具有美白功效的抑制黑色素沉著組合物。具體的技術(shù)方案如下：一種抑制黑色素沉著組合物，包括煙酰胺、肌醇、木瓜蛋白酶和橘皮苷提取物。在其中一些實施例中，所述抑制黑色素沉著組合物包括如下質(zhì)量份的組分：在其中一些實施例中，所述抑制黑色素沉著組合物包括如下質(zhì)量份的組分：在其中一些實施例中，所述抑制黑色素沉著組合物包括如下質(zhì)量份的組分：本發(fā)明的另一目的是提供上述抑制黑色素沉著組合物在化妝品中的應用。在其中一些實施例中，所述化妝品選自化妝水、乳液、膏霜、精華液或彩妝。本發(fā)明的另一目的是提供一種化妝品，包括上述抑制黑色素沉著組合物。本發(fā)明的原理和優(yōu)點如下：1皮膚黑色素生成機制1.1影響皮膚呈色的因素人類的皮膚顏色首先是由人種決定的，還與遺傳基因有關(guān)，同一種族的人，由于基因的個體差異，其皮膚的顏色也存在著一定的差別。同樣是中國人，有的皮膚顏色較白，有的顏色較黑，兩者差別很大。一般來說，嬰兒皮膚的顏色是人的皮膚本色，具有基因的性質(zhì)，隨著年齡的增長，人體皮膚的顏色也會發(fā)生較大變化。這與皮膚老化以及外界環(huán)境的影響關(guān)系很大。皮膚老化和皮膚內(nèi)外環(huán)境的影響，是導致皮膚發(fā)暗，色素沉著，產(chǎn)生色斑等因素。人體皮膚的顏色主要由黑色素細胞合成黑色素的數(shù)量，類型以及在角質(zhì)形成細胞周圍分布的模式來決定的。黑色素細胞是人類的一個小細胞，它主要的功能是合成黑色素并形成和分布色素沉著。1.2黑色素的合成機理在正常狀態(tài)下，人類皮膚的顏色取決于黑色素的含量和分布，而黑素細胞的結(jié)構(gòu)功能和數(shù)量直接影響皮膚黑素的含量，是產(chǎn)生黑素的決定因素。在皮膚表皮基底層存在黑色素細胞，黑素細胞屬于腺細胞，具有呈樹狀突起，它起源于胚胎神經(jīng)嵴，隨胚胎發(fā)育移行至表皮基底層，并通過樹狀突起以1:36的比例與角質(zhì)形成細胞構(gòu)成一個表皮黑素單位。在表皮黑素單位中，黑素細胞與角質(zhì)形成細胞之間相互影響，尤其是角質(zhì)形成細胞可通過接觸幾分泌堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、內(nèi)皮素(et-1)、神經(jīng)細胞生長因子(ngf)、白介素1(1l-1)、白介素6(1l-6)、腫瘤壞死因子(tnf)等對黑素細胞的形態(tài)，結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生明顯影響。黑素細胞樹狀突起實際為一管道，黑素細胞內(nèi)所產(chǎn)生的黑素由此樹枝狀管道運輸?shù)浇琴|(zhì)形成細胞內(nèi)，在角質(zhì)形成細胞溶酶體內(nèi)溶解，隨著表皮細胞脫落而排出。皮膚中的黑素能將日光中的有害光線過濾，消除紫外線引起的自由基，防止彈力纖維變形所導致皮膚老化，能保護dna使其免受傷害因素引起的致突變效應，從而降低皮膚癌的發(fā)病幾率。因此黑素對人體具有一定的生理保護功能，皮膚中約有400萬個黑素細胞，通過致突斑與基底膜相連。在電鏡下，黑素細胞核呈橢圓形，胞質(zhì)清亮，有形成黑素的膜性細胞器即黑素小體。皮膚黑素合成的主要四步驟為：(1)黑色素細胞受到紫外線，神經(jīng)因素，內(nèi)分泌、炎癥或激活黑色素細胞，啟動酪氨酸攝取與分布，酪氨酸酶合成；(2)黑色素小體形成，黑色素在小體中合成，黑素體儲存黑素；(3)黑色素通過細胞樹突將黑素顆粒轉(zhuǎn)運至角朊細胞；(4)角朊細胞中的黑素顆粒隨表皮細胞移動，伴隨角質(zhì)細胞脫落而排出。在黑素合成過程中，受到許多因素的影響，首先是酪氨酸酶的活性，此酶為含銅的氧化酶，其活性與其銅離子含量相關(guān)聯(lián)，體內(nèi)生化過程與物理環(huán)境的改變，可對酪氨酸酶產(chǎn)生影響。從酪氨酸向多巴轉(zhuǎn)化和多巴向多巴醌轉(zhuǎn)化中，都是由酪氨酸酶催化進行的。酪氨酸酶直接控制著黑素合成的起始和速度，決定了后續(xù)步驟是否進行下去。當各種因素導致酪氨酸酶活性增加時，黑色素合成增加，當酪氨酸酶活性被抑制時，黑色素合成減少。最新研究表明，黑色素合成過程中除了酪氨酸酶起作用外，還有3種酶對黑色素的合成也發(fā)揮不可忽視的作用。即多巴色素互變酶，5-6二羥基吲哚-2羧酸氧化酶和過氧化物酶。多巴色素互變酶催化多巴向5,6二羥基吲哚-2羧酸的轉(zhuǎn)化，dhhca氧化酶催化5,6二羥基吲哚-2羧酸向5,6-二酮基吲哚酸轉(zhuǎn)化。上述四種酶可以單獨作用也可以協(xié)同作用，促進黑色素合成。黑色素的形成不僅是黑色素細胞的細胞內(nèi)生化結(jié)果，同時與之相鄰的角質(zhì)細胞(每個黑色素細胞周圍約有36個角質(zhì)細胞)、成纖維細胞、吞噬細胞以及角質(zhì)細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮素對黑色素形成也有較大影響。2美白機理黑色素的形成過程，存在于黑色素細胞組織中的酪氨酸在酪氨酸酶催化作用下轉(zhuǎn)化成純黑色素和褐色素。黑色素細胞組織將轉(zhuǎn)移至表皮基底層細胞中，隨著細胞的新陳代謝而被帶到角質(zhì)層中，最后隨著角化細胞脫落，但當黑色素過速增長或分布不均勻時，就會造成局部皮膚過黑或色素沉著。皮膚美白主要有兩種途徑，一種途徑防止色素生成；另外一種途徑，則是促使已生成的色素通過角質(zhì)細胞的剝落而排泄出皮膚或體外。皮膚白皙透亮，除了黑色素含量多少和分布是否均勻，還取決于皮膚的保濕度和皮膚細膩程度，決定眼睛光學視覺效果。陽光照到皮膚上，首先會有一部分光剛照射到皮膚上，會因皮膚的狀態(tài)，以及看肌膚的角度不同，呈現(xiàn)不同的皮膚暗啞或透亮白皙。如果光接觸到的皮膚非常平滑，那這光束整齊的向一個方向反彈走，叫鏡面反射。如果眼睛正好在反射的方向上就能接收到這部分光，否則就看不到。如果光接觸到的皮膚很粗糙，那么光線就會化整為零，向各個方向反射都有，叫做漫反射——眼睛不管在哪個方向總能接收到一部分。剩余的一部分光在皮膚里遇到各種不透光成分又被陸續(xù)反彈出來了，光也被散落在各個方向上了，叫做散射，——眼睛不管在哪個方向總能接收到一部分。還有一部分光直接就被皮膚里的各種物質(zhì)吸收掉，消失在皮膚里。因此，所以我們看到的皮膚，其實就是鏡面反射(只在特定角度)+漫反射+散射的光的總和。這個總量越高，皮膚就看起來越亮。本專利采用煙酰胺和肌醇阻斷黑色素通過細胞樹突將黑色顆粒轉(zhuǎn)運至角質(zhì)細胞，并加速角質(zhì)形成細胞新陳代謝；采用脂質(zhì)包裹的木瓜蛋白酶，促進角質(zhì)表層死細胞的剝離和去除，黑色素伴隨角質(zhì)細胞脫落而排出，激發(fā)表皮細胞的更新，令肌膚光滑潤白；采用橘皮苷提取物可以增強普通皮膚美白，主要集中提升角化細胞的結(jié)構(gòu)，改善橋粒斑蛋白和角蛋白的分布，促進casepase-14蛋白的表達。促進角蛋白絲均勻分布，促進橋粒斑蛋白分布在細胞膜至上，使得表皮角化細胞平坦且有張力，細胞間隙變小，減少散射光的面積，散射光影響皮膚的光潔和透明，令肌膚白皙透亮。3美白劑優(yōu)選傳統(tǒng)的皮膚美白劑，往往采用過氧化氫，氯化銨基汞以及各種酚類衍生物，這些化合物能使黑色素組織迅速瓦解，達到快速美白之功效。但因其對皮膚的腐蝕性，細胞毒性和過敏性，使其具有極大危害性，在許多國家的衛(wèi)生規(guī)范中已經(jīng)禁用。本專利采用煙酰胺和肌醇阻斷黑色素通過細胞樹突將黑色顆粒轉(zhuǎn)運至角質(zhì)細胞，并加速角質(zhì)形成細胞新陳代謝；采用脂質(zhì)包裹的木瓜蛋白酶，促進角質(zhì)表層死細胞的剝離和去除，黑色素伴隨角質(zhì)細胞脫落而排出，激發(fā)表皮細胞的更新，令肌膚光滑潤白；采用橘皮苷提取物可以增強皮膚美白，主要集中提升角化細胞的結(jié)構(gòu)，改善橋粒斑蛋白和角蛋白的分布，促進casepase-14蛋白的表達。促進角蛋白絲均勻分布，促進橋粒斑蛋白分布在細胞膜至上，使得表皮角化細胞平坦且有張力，細胞間隙變小，減少散射光的面積，散射光影響皮膚的光潔和透明，令肌膚白皙透亮。其美白劑優(yōu)選如下表：3.1煙酰胺&肌醇1)煙酰胺煙酰胺，又名維生素b3，白色結(jié)晶或結(jié)晶粉末，幾乎無色無味，可溶于水，乙醇等。在美白功效上區(qū)別于傳統(tǒng)美白成分單純通過抑制酪氨酸酶的活性，減少皮膚黑色素的生成達到皮膚美白，或通過祛斑成分還原色素，減少皮膚黑色素的沉積量而達到美白。煙酰胺是通過抑制黑色素顆粒的形成，以及黑色素顆粒在向表皮細胞上行至角質(zhì)層，影響皮膚顏色或形成色斑這一階段起到抑制作用，有效抑制黑色素向角質(zhì)細胞傳遞，當有部分黑色素不可避免的達到表皮皮膚后，煙酰胺又能通過加速角質(zhì)層細胞新陳代謝速度從而促進含有黑色素的細胞脫落，從內(nèi)而外，實現(xiàn)改善膚質(zhì)，凈白肌膚的效果。2)肌醇肌醇，中文別名：肌糖；環(huán)己六醇；纖維醇(肌糖)。肌醇廣泛分布在動物和植物體內(nèi)，是動物、微生物的生長因子。環(huán)己六醇在自然界存在有多個順、反異構(gòu)體，天然存在的異構(gòu)體為順-1，2，3，5-反-4，6-環(huán)己六醇。肌醇在80℃以上從水或乙酸中得到的肌醇為白色晶體，熔點253℃，密度1.752克/厘米3(15℃)，味甜，溶于水和乙酸，無旋光性?？捎捎衩捉菀褐刑崛?。肌醇是廣泛存在于食物中的一種物質(zhì)，結(jié)構(gòu)類似于葡萄糖。純的肌醇為一種穩(wěn)定的白色結(jié)晶，能溶于水而有甜味，耐酸、堿及熱。在動物細胞中，它主要以磷脂的形式出現(xiàn)，有時則稱為肌醇磷脂。在谷物中則常與磷酸結(jié)合形成六磷酸酯即植酸，其中大豆中的肌醇則為游離狀態(tài)。肌醇廣泛分布在動物和植物體內(nèi)，是動物、微生物的生長因子。肌醇能夠增加生長因子，保持真皮層干細胞傾于穩(wěn)定，有利于促進成纖維細胞間質(zhì)透明質(zhì)酸，膠原蛋白，彈性蛋白生成。本專利主要采用煙酰胺和肌醇的科學組合，最大限度的發(fā)揮煙酰胺抑制黑素向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)移，加速皮膚的新城代謝，使得含有黑色素的角質(zhì)層細胞更快的剝離，達到肌膚白皙健康。3.2木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶(本申請采用木瓜蛋白酶脂質(zhì)體，購自kobo)來自于天然木瓜，具有水解膠原蛋白的作用，促進角質(zhì)細胞剝離與消除：可完美替代aha類產(chǎn)品，促進角質(zhì)層更新，年輕光滑肌膚。3.3橘皮苷提取物橘皮苷提取物(購自一丸化學)通過抑制黑素合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄作用，增強磷酸化的保外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(p-erk1/2)的表達水平減少酪氨酸酶，酪氨酸相關(guān)蛋白酶1及2的水平。皮膚只有在光反射下，皮膚才會呈現(xiàn)不同的狀態(tài)并出現(xiàn)外觀的變化，角質(zhì)層是光進入皮膚和反射的大門，必須在通常皮膚護理外保持角質(zhì)層清晰以呈現(xiàn)健康的皮膚。光潔的皮膚呈現(xiàn)的狀態(tài)，細胞間隙小，精細的表皮細胞，細胞有張力等維度。除了皮膚的保濕度，角化細胞的狀況對皮膚的光潔透明影響很大。本專利采用的橘皮苷提取物可以增強普通皮膚美白，主要集中提升角化細胞的結(jié)構(gòu)，改善橋粒斑蛋白和角蛋白的分布，促進casepase-14蛋白的表達。橋粒斑蛋白是一種鏈接內(nèi)部和外部細胞的蛋白，它對在表皮層中形成角蛋白絲起著重要的作用，橋粒斑蛋白鏈接角蛋白和細胞橋粒從而使細胞具有強度和張力。本專利的組合物可以促進角蛋白絲均勻分布，促進橋粒斑蛋白分布在細胞膜之上，使得表皮角化細胞平坦且有張力，細胞間隙變小。半胱氨酸蛋白酶-14(caspase-14)屬于半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，是最新在人體中發(fā)現(xiàn)的一種半胱氨酸蛋白酶，其功能與絲聚集蛋白的新陳代謝有關(guān)，絲聚角蛋白產(chǎn)生天然保濕因子nmf；與角蛋白的聚合和柔韌性有關(guān)；半胱氨酸蛋白酶-14(caspase-14)的無序會損害皮膚的屏障功能。caspase-14使角蛋白具有柔韌性，并使得細胞保持張力。本專利采用的橘皮苷提取物具有催生caspase-14具有最好功效，減少散射光的面積，散射光影響皮膚的光潔和透明，令肌膚白皙透亮。本發(fā)明的優(yōu)點如下：(1)上述抑制黑色素沉著組合物針采用煙酰胺和肌醇能阻斷黑色素通過細胞樹突將黑色顆粒轉(zhuǎn)運至角質(zhì)細胞，并加速角質(zhì)形成細胞新陳代謝；(2)上述抑制黑色素沉著組合物采用脂質(zhì)包裹的木瓜蛋白酶，促進角質(zhì)表層死細胞的剝離和去除，黑色素伴隨角質(zhì)細胞脫落而排出，激發(fā)表皮細胞的更新，令肌膚光滑潤白；(3)上述抑制黑色素沉著組合物采用橘皮苷提取物可以增強普通皮膚美白，主要集中提升角化細胞的結(jié)構(gòu)，改善橋粒斑蛋白和角蛋白的分布，促進casepase-14蛋白的表達。促進角蛋白絲均勻分布，促進橋粒斑蛋白分布在細胞膜之上，使得表皮角化細胞平坦且有張力，細胞間隙變小，減少散射光的面積，散射光影響皮膚的光潔和透明，令肌膚白皙透亮。附圖說明圖1為實例樣與對照樣黑色素含量減少量的比較圖；圖2為實例樣與對照樣白度增加量的比較圖；圖3為實例樣與對照樣絡氨酸酶抑制率的比較圖；圖4為實例樣與對照樣細胞黑色素含量的比較圖。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進行更全面的描述。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。實例樣和對照樣組分配比如下(在保濕基礎配方上)：配方組分實例樣1實例樣2實例樣3對照樣1對照樣2對照樣3甘油253.003.003.003.00丁二醇365.005.005.005.00丙二醇132.002.002.002.00甜菜堿0.531.01.01.01.0尿囊素0.050.40.150.150.150.15海藻糖0.120.50.50.50.5透明質(zhì)酸nano0.010.10.020.020.020.02煙酰胺162550.5肌醇0.110.50.50.50.1橘皮柑提取物0.0520.050.50.01木瓜蛋白酶脂質(zhì)體0.0110.10.02制備方法：以實例樣3為例，加入質(zhì)量比1:1的卡波20(0.1-0.6質(zhì)量份)和精氨酸(0.1-0.6質(zhì)量份)，添加phl1％作為防腐劑，加去離子水至100質(zhì)量份，制備工藝如下：(1)按照配方配比稱取甘油，丙二醇，丁二醇，甜菜堿，尿囊素，海藻糖，透明質(zhì)酸鈉(寡聚)，加入工藝水加熱至75-80℃，以250-300r/min,攪拌20min,直至溶解透明；(2)按照配方配比稱取煙酰胺，肌醇，溫度控制為65-75℃，以300r/min，攪拌15min,直至所有添加物全部溶解；(3)按照配比稱取木瓜蛋白酶脂質(zhì)體、橘皮苷提取物溫度控制在50-60℃，以200r/min攪拌15min,直至全部溶解；(4)按照配比稱取卡波20、精氨酸，phl,溫度控制45℃以下，以100r/min，攪拌15min,靜置恢復到室溫即可。美白功效評測：人體測試實驗原理：通過測量樣品實施前后皮膚的黑色素含量(melaninvalue)，利用色度儀測量樣品實施前后皮膚的白度(wi)變化量。實驗方法：測試設備:德國ck公司多功能皮膚測試儀，型號cutometerdualmpa580，本專利選用黑色素和紅斑測試探頭。測試前準備：實驗前，受試者需要同意清潔雙手前臂內(nèi)測，用干的面巾紙擦拭干凈。清潔后受試者雙手前臂內(nèi)側(cè)做好測量區(qū)域標記。正式測試前應在符合標準房間內(nèi)靜坐至少30min，不能喝水，前臂暴露，呈測試狀態(tài)放置，保持放松。測試步驟：實驗中左右手臂內(nèi)側(cè)標記3*3cm2試驗區(qū)域，同一手臂可以標記多個區(qū)域，區(qū)域間隔1cm。測試產(chǎn)品和空白對照均隨機分布在左右手臂上。使用黑色素探頭測定儀進行受試區(qū)域和對照區(qū)域的黑色素測量。使用色度儀測試受試區(qū)域和對照區(qū)域的白度。每個區(qū)域依照平行測定15次。先測量各測試區(qū)域的空白值，然后按2.0±0.1mg樣品/cm2的用量，使用乳膠指套將試驗均勻涂布于試驗區(qū)內(nèi)。30分鐘后利用黑色素探頭測量該區(qū)域的黑色素值，利用色度儀測量該區(qū)域的白度值，記錄數(shù)據(jù)。按實驗的設計分別測得每天各個區(qū)域產(chǎn)品使用前后的黑色素含量和皮膚白度，對比初始值計算出黑色素的減少量和白度的增加量。實驗結(jié)果：(1)皮膚黑色素含量的減少量如圖1及下表所示：(2)皮膚白度的增加量(如圖2及下表所示)酪氨酸酶活性抑制效果測試：試劑：0.175mol/lpbs(ph6.8),1.5mmol/l酪氨酸,2000unit/ml酪氨酸酶；實驗樣品準備：利用pbs對料體進行稀釋，稀釋后的濃度分別為10％，50％，100％；測試方法：(1)96wellplate上選取4個空，按照下表中各個物質(zhì)的添加量進行添加：(2)震蕩充分混合后放置于37℃的培養(yǎng)箱中反應；(3)25分鐘后利用酶標儀在490nm波長處測試吸光度(ab，absorbance)；(3)利用以下的公式計算酪氨酸酶活性的抑制效果：實驗結(jié)果(如圖3及下表所示)：細胞產(chǎn)生的黑色素量測試：實驗材料：b16f10，dmem培養(yǎng)基，胰蛋白酶，dpbs，70％酒精，naoh，dmso；實驗方法：(1)將b16f10細胞消化后，利用dmem培基分散細胞，利用hemacytometer來計數(shù)細胞，然后利用dmem來稀釋細胞，稀釋到濃度為5×104cells/ml。(2)稀釋后的細胞溶液分別接種到6well中，每一孔為2ml，即1×105cells/well。(3)在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。(4)待測樣品準備：待測樣品用dmem培基稀釋，稀釋后的濃度分別為：50％(該濃度通過前面的mtt測試，結(jié)果為無毒)(5)細胞培養(yǎng)24小時后，觀察細胞是否完全貼壁生長，如果細胞完全貼壁生長的話，將原培基移除，用dpbs洗滌。(6)將dpbs移除之后，分別加入前面準備好的樣品。樣品的溶度根據(jù)毒性測試的結(jié)果選擇安全濃度100ppm(2ml/well)。(7)樣品加入之后，放入37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。(8)分別收集培基和細胞，分別測試細胞外與細胞內(nèi)的黑色素的含量。(9)培基部分：13500rpmx10mins離心后，取上層清液在波長415nm處測量吸光光度。(10)細胞部分：將b16f10細胞消化后收集起來，13500rpmx10mins離心后，移除上層清液。底部的b16f10細胞中加入0.3ml的10％dmso，1nnaoh溶液，80℃水浴中裂解1小時。(11)1小時后裂解液冷卻至室溫，13500rpmx10mins離心后收集上層清液.(12)利用酶標儀在波長415nm處測量上層清液的吸光光度od。(13)配置黑色素標樣，濃度為1.0到100.0ppm，分別測試標樣的吸光光度，繪制出濃度與吸光光度的線性關(guān)系圖。(14)利用上述的線性關(guān)系圖可以得出細胞內(nèi)與細胞外黑色素的含量。實驗結(jié)果(如圖4及下表所示)：本發(fā)明通過人體對比黑色素的減少和白度增加的評測，功效疊加對照樣，功效遞增，其中實施例樣品在黑色素減少，人體白度增加方面具有明顯優(yōu)勢；通過細胞產(chǎn)生黑色素含量和抑制酪氨酸酶活性的對比試驗，也充分認證了本發(fā)明上述抑制黑色素沉著組合物具有顯著的皮膚美白提亮功效。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁12