本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及熱休克蛋白70在診斷預(yù)防治療膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)中最為常見(jiàn)的腫瘤之一，2010年who的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，膠質(zhì)瘤約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的45％以上。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)腦膠質(zhì)瘤病因及發(fā)病機(jī)制的深入研究，使本病的診斷和治療取得了很大的進(jìn)步。但是腦膠質(zhì)瘤的最終預(yù)后并未有根本性改觀，患者在診斷后往往僅有一年左右的生存時(shí)間。而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā)、高死亡率主要有兩方面的因素：一是膠質(zhì)瘤內(nèi)高度增生的血管網(wǎng)，為膠質(zhì)瘤的增殖提供了充足養(yǎng)分，并介導(dǎo)了膠質(zhì)瘤的侵襲；另一個(gè)則是膠質(zhì)瘤高度的侵襲性和復(fù)發(fā)性。因此，對(duì)該疾病發(fā)生、發(fā)展中的相關(guān)機(jī)制仍需要進(jìn)行更深入的研究。

腫瘤疫苗正在成為腫瘤生物治療的一種重要手段，越來(lái)越得到了人們廣泛重視，研制開(kāi)發(fā)療效好、應(yīng)用范圍廣的腫瘤疫苗已成為目前腫瘤防治研究的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。腫瘤疫苗抗腫瘤作用的機(jī)理主要依賴(lài)于其中的腫瘤抗原，尤其是腫瘤特異性抗原發(fā)揮了重要作用。腫瘤抗原進(jìn)入體內(nèi)后通過(guò)抗原遞呈激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤的特異性細(xì)胞進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。

熱休克蛋白(heatshockproteins，hsps)是生物體(或離體培養(yǎng)的細(xì)胞)在不良環(huán)境因素作用下產(chǎn)生的具有高度保守性的應(yīng)激蛋白，普遍存在于整個(gè)生物界。熱休克蛋白按分子量大小分為以下幾個(gè)家族：熱休克hsp(相對(duì)分子質(zhì)量為22～32kda)、hsp60、hsp70、hsp90、hsp100和泛素(相對(duì)分子質(zhì)量為7～8kda)，其中最重要、誘導(dǎo)后表達(dá)量最大的是hsp70家族。hsp70是熱休克蛋白家族中最重要的成員之一，它具有分子伴侶功能，參與蛋白質(zhì)合成、加工、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程。它在腫瘤細(xì)胞特別是在惡性腫瘤細(xì)胞中常有高水平表達(dá)，可以通過(guò)基因調(diào)解以及免疫應(yīng)答來(lái)發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞凋亡作用。由此，hsp70與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤免疫、腫瘤治療中耐藥性和腫瘤的預(yù)后等都有密切關(guān)系，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要作用。明確hsp70的調(diào)控機(jī)制以及作用過(guò)程，有利于腫瘤發(fā)病機(jī)制的闡明，并為腫瘤的診治提供更充分的理論依據(jù)。然而，關(guān)于hsp70的臨床應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。我們將hsp70設(shè)計(jì)為治療腫瘤的靶點(diǎn)，并以此為腦膠質(zhì)瘤治療設(shè)計(jì)新的抗癌藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供熱休克蛋白hsp70用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲的應(yīng)用；給予某種腫瘤相關(guān)性的抗原蛋白與過(guò)表達(dá)的熱休克蛋白hsp70，制備成腦膠質(zhì)瘤的靶向抑制劑，用于膠質(zhì)瘤的免疫治療。

本發(fā)明提出的熱休克蛋白70在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述產(chǎn)品的功能具有如下(1)至(6)中至少一種：

(1)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖；

(2)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡；

(3)抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)；

(4)抑制膠質(zhì)瘤侵襲；

(5)抑制膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移；

(6)治療和/或預(yù)防膠質(zhì)瘤。

優(yōu)選地，所述熱休克蛋白70的獲得方式為d1)或d2)：

d1)體外合成；

d2)將編碼所述熱休克蛋白70的核酸分子導(dǎo)入受體中進(jìn)行表達(dá)。

優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為藥物。

本發(fā)明還提出的一種產(chǎn)品，其活性成分為熱休克蛋白70；所述產(chǎn)品的功能具有如下(1)至(6)中至少一種：

(1)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖；

(2)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡；

(3)抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)；

(4)抑制膠質(zhì)瘤侵襲；

(5)抑制膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移；

(6)治療和/或預(yù)防膠質(zhì)瘤。

優(yōu)選地，所述熱休克蛋白70的獲得方式為d1)或d2)：

d1)體外合成；

d2)將編碼所述熱休克蛋白70的核酸分子導(dǎo)入受體中進(jìn)行表達(dá)。

優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為藥物。

本發(fā)明涉及的熱休克hsp70合成蛋白具有抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、抑制膠質(zhì)瘤侵襲、抑制膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移、治療和/或預(yù)防膠質(zhì)瘤的功能。本發(fā)明對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的治療具有重大價(jià)值，可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲；給予某種腫瘤相關(guān)性的抗原蛋白與過(guò)表達(dá)的熱休克蛋白hsp70，制備成腦膠質(zhì)瘤的靶向抑制劑，用于腦膠質(zhì)瘤的免疫治療。

附圖說(shuō)明

圖1為具有代表性的患者膠質(zhì)瘤組織hsp70免疫組化切片。

圖2為圖1統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的柱狀圖。

圖3為圖3為具有代表性的whoⅳ級(jí)的患者膠質(zhì)瘤組織hsp70、gfap、iba-1和cd45免疫熒光的結(jié)果圖。

圖4為第14天對(duì)照組的代表性的t1、t2和hsp70組的mri圖像。

圖5為圖4統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的柱狀圖。

圖6為第21天對(duì)照組的代表性的t1、t2和hsp70組的mri圖像。

圖7為圖6統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的柱狀圖。

圖8為westernblot觀察hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞中hsp70的表達(dá)量圖。

圖9為rt-pcr觀察hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞中hsp70的表達(dá)水平圖。

圖10為transwell體系觀察hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞遷移能力圖。

圖11為圖10統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的柱狀圖。

圖12為transwell體系觀察hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后遷移能力圖。

圖13為圖12統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的柱狀圖。

圖14為第14天對(duì)照組的代表性的t1、t2和hsp70過(guò)表達(dá)組的mri圖像。

圖15為圖14統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的柱狀圖。

圖16為第21天對(duì)照組的代表性的t1、t2和hsp70過(guò)表達(dá)組的mri圖像。

圖17為圖16統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的柱狀圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1熱休克蛋白70(hsp70)的表達(dá)水平與患者膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)

為了解釋熱休克蛋白70(hsp70)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度的關(guān)系，申請(qǐng)人利用免疫組化的方法在三種臨床病理分級(jí)的病人腦膠質(zhì)瘤組織切片(whoⅱ-ⅳ)利用免疫組化標(biāo)記hsp70的表達(dá)水平，如圖1所示，圖1為具有代表性的患者膠質(zhì)瘤組織hsp70免疫組化切片，其中褐色標(biāo)記的為hsp70陽(yáng)性的組織，放大倍數(shù)為10×；對(duì)圖1中hsp70陽(yáng)性的組織進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其結(jié)果如圖2所示，其中n＝21，**p<0.01，*p<0.05。

從圖1和圖2可以發(fā)現(xiàn)hsp70在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平明顯增高，而且與膠質(zhì)瘤惡性程度密切相關(guān)，不同級(jí)別之間存在顯著性差異。

隨后我們分別用紅色熒光標(biāo)記hsp70，綠色熒光的gfap、iba-1和cd45分別標(biāo)記膠質(zhì)瘤細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞以及血源性細(xì)胞。如圖3所示，圖3為具有代表性的whoⅳ級(jí)的患者膠質(zhì)瘤組織hsp70、gfap、iba-1和cd45免疫熒光的結(jié)果，放大倍數(shù)為10×；由圖3發(fā)現(xiàn)hsp70主要表達(dá)于組織中的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在間質(zhì)細(xì)胞中上也有少量表達(dá)。

以上結(jié)果說(shuō)明熱休克蛋白70(hsp70)在膠質(zhì)瘤組織中廣泛表達(dá)，hsp70的表達(dá)水平與患者膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)，并且hsp70主要來(lái)源于膠質(zhì)瘤細(xì)胞和間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞。

實(shí)施例2瘤內(nèi)注射熱休克蛋白70(hsp70)能夠在體抑制小鼠膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)

研究結(jié)果表明，外源性的熱休克蛋白70(hsp70)參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展過(guò)程。針對(duì)hsp70如何影響膠質(zhì)瘤的進(jìn)程的問(wèn)題，申請(qǐng)人構(gòu)建原位小鼠腦膠質(zhì)瘤模型，采用瘤內(nèi)注射hsp70的方法觀察腫瘤的體積。

實(shí)驗(yàn)按照以下步驟實(shí)施：

計(jì)數(shù)5×10⁵個(gè)gl261小鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用立體定位儀將細(xì)胞注射至小鼠側(cè)腦室(n＝8)，構(gòu)建模型。

待接種細(xì)胞后第6天，將小鼠隨機(jī)分為兩組；利用同樣的方法，對(duì)照組給予單劑量瘤內(nèi)注射5mg牛血清白蛋白(bsa)，試驗(yàn)組給予單劑量瘤內(nèi)注射5mg重組熱休克蛋白70(rhhsp70)；兩組蛋白都經(jīng)過(guò)純化和去內(nèi)毒素處理。

分別在腫瘤生長(zhǎng)的第14天和第21天，利用7.0t的核磁共振掃描儀掃描顱內(nèi)腫瘤，其中顱內(nèi)白色區(qū)域?yàn)槟[瘤，計(jì)算腫瘤體積[腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)依照公式：v＝(1/2×面積總和×厚度總和)]。

如圖4所示，圖4為第14天對(duì)照組的代表性的t1、t2和hsp70組的mri圖像；結(jié)果顯示：在腫瘤形成的第14天，對(duì)照組的腫瘤體積為59.2±27.1mm³；hsp70試驗(yàn)組的腫瘤體積為27.4±13.3mm³；對(duì)二者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖5所示，結(jié)果顯示其呈現(xiàn)出顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。

如圖6所示，圖6為第21天對(duì)照組的代表性的t1、t2和hsp70組的mri圖像；結(jié)果顯示：腫瘤形成后第21天，對(duì)照組的腫瘤體積為231.9±75.3mm³，hsp70試驗(yàn)組的腫瘤體積為180.7±32.8mm³；對(duì)二者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖7所示，結(jié)果顯示其呈現(xiàn)出顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，即腫瘤體積仍然有減小的趨勢(shì)。

同時(shí)圖4和圖6的mri掃描圖片結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，hsp70處理組腫瘤組織浸潤(rùn)更差，中心凋亡區(qū)域面積較小，并且腫瘤周?chē)吔缫哺：?/p>

以上結(jié)果說(shuō)明：瘤內(nèi)注射熱休克蛋白70(hsp70)能夠在體抑制小鼠膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。

實(shí)施例3在離體的gl261細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)hsp70能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力

申請(qǐng)人在gl261膠質(zhì)瘤模型中用過(guò)表達(dá)hsp70的方法，觀察hsp70在體內(nèi)通過(guò)激活微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞，對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，以及腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞表型和功能。

申請(qǐng)人通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染的方法，在gl261小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中構(gòu)建了過(guò)表達(dá)hsp70的細(xì)胞株，隨后用免疫印跡和熒光定量pcr的方法檢測(cè)了過(guò)表達(dá)hsp70的細(xì)胞株中hsp70蛋白和mrna的表達(dá)水平。

其結(jié)果如圖8和圖9所示，圖8為westernblot觀察hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞中hsp70的表達(dá)量；圖9為rt-pcr觀察hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞中hsp70的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相較于對(duì)照轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞，hsp70過(guò)表達(dá)的gl261細(xì)胞蛋白表達(dá)水平上升，mrna表達(dá)水平上升了4倍。

transwell體系觀察hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞遷移能力，如圖10所示，針對(duì)圖10進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其結(jié)果如圖11所示，表明hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞遷移能力無(wú)顯著差異。遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，hsp70過(guò)表達(dá)和對(duì)照的腫瘤細(xì)胞遷移能力沒(méi)有明顯變化。

再加入巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，transwell體系觀察hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后遷移能力的變化，如圖12所示，針對(duì)圖12進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其結(jié)果如圖13所示，表明加入巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，hsp70過(guò)表達(dá)與空載轉(zhuǎn)染的gl261細(xì)胞遷移能力發(fā)生顯著差異(p<0.1)。巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，加入巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，hsp70過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞遷移能力則顯著下降。

實(shí)施例4過(guò)表達(dá)hsp70能夠在體內(nèi)抑制原位膠質(zhì)瘤的發(fā)生

申請(qǐng)人將hsp70過(guò)表達(dá)和對(duì)照的腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)2×10⁵個(gè)/10μl，立體定位接種至小鼠側(cè)腦室，分別構(gòu)建過(guò)表達(dá)hsp70和對(duì)照小鼠膠質(zhì)瘤模型。待腫瘤形成的第14天和第21天，核磁共振掃描儀掃描顱內(nèi)腫瘤，顱內(nèi)白色區(qū)域?yàn)槟[瘤，計(jì)算腫瘤體積[腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)依照公式：v＝(1/2×面積總和×厚度總和)]。

如圖14所示，圖14為第14天對(duì)照組的代表性的t1、t2和hsp70過(guò)表達(dá)組的mri圖像；結(jié)果顯示：第14天對(duì)照組和hsp70過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積分別為201.3±54.0mm³和80.6±31.0mm³；對(duì)二者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖15所示，顯示兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.1)，即腫瘤體積顯著減少。

如圖16所示，圖16為第21天對(duì)照組的代表性的t1、t2和hsp70過(guò)表達(dá)組的mri圖像；結(jié)果顯示：第21天對(duì)照組和hsp70過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積分別為405.5±17.5mm³和138.4±8.9mm³；對(duì)二者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖17所示，結(jié)果顯示顯示兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.1)，即過(guò)表達(dá)hsp70的腫瘤體積進(jìn)一步減小。

通過(guò)上述結(jié)果說(shuō)明：腫瘤微環(huán)境中的hsp70在體內(nèi)抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。