本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及icbp90抗體及其表達抑制劑在制備促進糖皮質(zhì)激素治療效果的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：免疫調(diào)節(jié)細胞因子巨噬細胞遷移抑制因子(mif)是一種多功能促炎細胞因子，在先天免疫中起關(guān)鍵作用，反向調(diào)控糖皮質(zhì)激素(gcs)的抗炎作用，引起糖皮質(zhì)激素抵抗或不敏感，這是糖皮質(zhì)激素治療幾種常見的炎性疾病和淋巴細胞性白血病的主要障礙。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，gc)是脂溶性類固醇激素，由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的甾體類化合物，其分泌受下丘腦-垂體-腎上腺調(diào)節(jié)。gc通過細胞膜擴散進入細胞質(zhì)中，與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoidreceptor，gr)結(jié)合而發(fā)揮作用。但是不同個體對gc的反應(yīng)并不一致，部分患者表現(xiàn)為對激素反應(yīng)性降低甚至無反應(yīng)，即為糖皮質(zhì)激素抵抗(glucocorticoidresistant)。關(guān)于糖皮質(zhì)激素抵抗的機制已被重視、研究多年，但至今不明了。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于通過研究轉(zhuǎn)錄因子icbp90能與mif啟動子catt重復(fù)序列結(jié)合調(diào)控其表達，并且gr-icbp90在細胞內(nèi)以復(fù)合蛋白形式存在，其存在導(dǎo)致gc能夠通過gr上調(diào)mif的表達，提出通過減少icbp90的橋梁作用來降低mif導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素抵抗，從而提高糖皮質(zhì)激素的藥用效果。所以本發(fā)明提供icbp90抗體及其表達抑制劑在制備促進糖皮質(zhì)激素治療效果的藥物中的應(yīng)用。為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：1.icbp90抗體在制備促進糖皮質(zhì)激素治療效果的藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療糖皮質(zhì)激素抵抗的相關(guān)病癥。2.icbp90表達抑制劑在制備促進糖皮質(zhì)激素治療效果的藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療糖皮質(zhì)激素抵抗的相關(guān)病癥。進一步，所述相關(guān)病癥為免疫炎癥病癥、變態(tài)反應(yīng)性病癥、過敏性病癥和血液系統(tǒng)疾病。進一步，所述變態(tài)反應(yīng)性病癥為風濕熱、風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、風濕性心肌炎、大動脈炎、結(jié)節(jié)性動脈周圍炎、腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。進一步，所述血液系統(tǒng)疾病為急性淋巴細胞性白血病、再生障礙性貧血、粒細胞減少癥、血小板減少癥和過敏性紫癜。進一步，所述icbp90表達抑制劑為icbp90shrna。進一步，所述icbp90shrna識別的靶序列如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了icbp90抗體和icbp90抑制劑在生物制藥領(lǐng)域的新用途，對mif反向調(diào)控糖皮質(zhì)激素的抗炎效應(yīng)提出新的有效解決方法，進一步提高糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用人群，提高糖皮質(zhì)激素治療效果，并為糖皮質(zhì)激素藥物作用深入研究和開發(fā)提供了一個新的方向。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：圖1為實施例1的共免疫沉淀后樣品westernblot檢測圖；圖2為實施例1的對照及不同濃度地塞米松刺激下，icbp90表達westernblot檢測圖；圖3為hela細胞中icbp90和gr共聚焦顯微鏡圖，icbp90(綠色)和gr(藍色)；圖4為ra細胞中icbp90和gr共聚焦顯微鏡圖，icbp90(藍色)和gr(紅色)；圖5為對照shrna和grshrna分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞后的檢測圖，其中a為mif的mrna含量圖及蛋白wb圖，b為icbp90的mrna含量圖及蛋白wb圖，c為gr的mrna含量圖及蛋白wb圖；圖6為對照shrna和icbp90shrna分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞后檢測圖，其中a為mif的mrna含量圖及蛋白wb圖，b為gr的mrna含量圖及蛋白wb圖，c為icbp90的mrna含量圖及蛋白wb圖；圖7為空載體和pcmv-gr分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞后檢測圖，其中a為mif的mrna含量圖及蛋白wb圖，b為icbp90的mrna含量圖及蛋白wb圖，c為gr的mrna含量圖及蛋白wb圖；圖8為空載體和pcmv-icbp90分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞后檢測圖，其中a為mif的mrna含量圖及蛋白wb圖，b為gr的mrna含量圖及蛋白wb圖，c為icbp90的mrna含量圖及蛋白wb圖；圖9為用對照shrna、icbp90shrna和icbp90shrna+grshrna分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞后的檢測圖，a為icbp90的mrna含量圖，b為icbp90的蛋白wb圖；圖10為用空載體、pcmv-icbp90和pcmv-icbp90+gr分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞后的檢測圖，a為icbp90的mrna含量圖，b為icbp90的蛋白wb圖；圖11為實施例4檢測各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的mrna含量圖，其中a為各shrna轉(zhuǎn)染后grmrna含量圖，b為各pcmv轉(zhuǎn)染的grmrna含量圖，c為shrna轉(zhuǎn)染的mifmrna含量圖，d為各pcmv轉(zhuǎn)染的mifmrna含量圖；圖12為各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后總細胞裂解物中的熒光素酶活性測定圖，a-f分別為0.01pm、1pmdex、10pmdex、100pmdex、1nmdex刺激后的總細胞裂解物中的熒光素酶活性圖；圖13為各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人滑膜成纖維細胞后，對比或加10nmdex處理后細胞凋亡率圖；圖14為各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cem-c7細胞后，對比或加1pmdex處理后細胞凋亡率圖；圖15為各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代t細胞后，對比或加1pmdex處理后細胞凋亡率圖；圖16為各抗體、dex或/和mif處理后流式細胞凋亡檢測圖。具體實施方式下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。細胞和試劑：人外周血急性淋巴細胞(cem-c7)t細胞來自americantypeculturecollection，培養(yǎng)基：含有10％fbs的rpmi1640(低內(nèi)毒素,0.5eu/ml)(biowhittaker)；早期傳代初級類風濕滑膜成纖維細胞(earlypassageprimaryrheumatoidsynovialfibroblasts),培養(yǎng)基：含有10％fbs的dmem；用于細胞培養(yǎng)的地塞米松(dexamethasone，d4902-25mg)得自sigma-aldrich；抗體anti-gr(ma1510)、anti-ap-1(ma5-15881)和anti-icbp90(ab57083)分別來自thermo和abcam；icbp90shrna質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)uniprot數(shù)據(jù)庫中公開的icbp90cds序列(nm001048201.1)所預(yù)測干擾靶點的具體序列如下：seqidno1：gtcatttaccacgtgaaatac或seqidno2：gatctttccggcaacaagagg或seqidno3：gctacgatggcatctacaagg使用hushshrnaplasmid,pgfp-v-rs(origene)質(zhì)粒鏈接靶序列，設(shè)計的引物及質(zhì)粒構(gòu)建委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進行合成。實施例1共同免疫沉淀和免疫印跡顯示蛋白質(zhì)相互作用用6孔板(1×106個細胞/孔)培養(yǎng)的cem-c7細胞，收集細胞使用含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液(0.5％triton-x-100,150mmnacl,12.5mmβ-glycerolphosphate,1.5mmmgcl2,2mmegta,10mmnaf,1mmna3vo4,2mmdtt)將其裂解，裂解物離心收集上清并與蛋白a/gsepharose(amersham)、anti-icbp90或anti-gr抗體孵育至少4小時；孵育完畢后將sepharose用pbs洗滌4次，并加入dtt的sds樣品緩沖液煮沸10分鐘。然后樣品用westernblot檢測，以證明icbp90-gr復(fù)合物存在，icbp90為轉(zhuǎn)錄因子，gr(glucocorticoidreceptor，糖皮質(zhì)激素受體)。用loadingbuffer(0.125mmtris-hcl(ph6.8),30％(vol/vol)glycerol,and2％(wt/vol)deoxycholate)處理蛋白質(zhì)樣品，冰浴，25ma下電泳1小時，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)pvdf膜，然后與相應(yīng)一抗(groricbp90antibody)孵育，最后曝光。曝光結(jié)果如圖1所示，由圖1可以得知，cem-c7細胞中存在icbp90-gr復(fù)合物。進一步以地塞米松(dex)刺激，wb曝光結(jié)果如圖2所示，由圖2可知，在1pmdex的刺激下，蛋白的表達有所增加。實施例2免疫熒光共聚焦顯微鏡(immunofluorescenceconfocalmicroscopy)使用奧林巴斯bx51顯微鏡或徠卡tcssp2共聚焦系統(tǒng)在10×和100×物鏡下進行細胞成像。對hela細胞和ra細胞中icbp90和gr的共聚焦顯微鏡分析，觀察icbp90與gr在hela細胞和ra細胞核中共定位情況，當添加dex時，二者熒光檢測信號增強；icbp90(綠色)和gr(藍色)在hela細胞定位如圖3所示，icbp90(藍色)和gr(紅色)在ra細胞定位如圖4所示。實施例3icbp90和gr相互作用及功能用對照shrna(shrnacontrol)和grshrna分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞40小時后，再加入10nmdex培養(yǎng)8小時后，通過qpcr和western印跡分別檢測mif、icbp90和gr的mrna及細胞內(nèi)蛋白含量。檢測結(jié)果如圖5所示，圖5a為mifmrna和細胞內(nèi)mif蛋白含量，圖5b為icbp90mrna和細胞內(nèi)icbp90含量，圖5c為grmrna和細胞內(nèi)gr蛋白含量。用對照shrna(shrnacontrol)和icbp90shrna分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞40小時后，再加入10nmdex培養(yǎng)8小時后，通過qpcr和western印跡分別檢測mif、icbp90和grmrna及細胞內(nèi)蛋白含量。檢測結(jié)果如圖6所示，圖6a為mifmrna和細胞內(nèi)mif蛋白含量，圖6b為grmrna和細胞內(nèi)gr含量，圖6c為icbp90mrna和細胞內(nèi)icbp90蛋白含量。用空載體(pcmvcontrol)和pcmv-gr分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞40小時后，再加入10nmdex培養(yǎng)8小時后，通過qpcr和western印跡分別檢測mrna和細胞內(nèi)蛋白含量。檢測結(jié)果如圖7所示，圖7a為mifmrna和細胞內(nèi)mif蛋白含量，圖7b為icbp90mrna和細胞內(nèi)icbp90含量，圖7c為grmrna和細胞內(nèi)gr蛋白含量。用空載體(pcmvcontrol)和pcmv-icbp90分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞40小時后，再加入10nmdex培養(yǎng)8小時后，，通過qpcr和western印跡分別檢測mrna和細胞內(nèi)蛋白含量。檢測結(jié)果如圖8所示，圖8a為mifmrna和細胞內(nèi)mif蛋白含量，圖8b為grmrna和細胞內(nèi)gr含量，圖8c為icbp90mrna和細胞內(nèi)icbp90蛋白含量。圖5-圖8所有數(shù)據(jù)是三次測量的平均值±sd，所有實驗都均重復(fù)兩次，**p<0.01，*p<0.05，顯示的蛋白印跡分別是三個獨立實驗。由圖5-圖8結(jié)果表明，活化的gr可增加icbp90和mif表達，同樣icbp90可以增加icbp90和mif表達，說明icbp90和gr不僅在空間結(jié)構(gòu)上是相互作用的且具有功能。實施例4gr通過結(jié)合icbp90調(diào)節(jié)mif表達icbp90下調(diào)對比icbp09加gr都下調(diào)對風濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細胞mifmrna表達和蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響，用對照shrna、icbp90shrna和icbp90shrna+grshrna分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞，40小時后再加入10nmdex培養(yǎng)8小時，48小時后，通過qpcr和western印跡分別檢測icbp90mrna和細胞內(nèi)icbp90蛋白含量。檢測結(jié)果如圖9所示，由圖9可知，icbp90下調(diào)可導(dǎo)致mif表達顯著降低，而icbp90下調(diào)情況下再下調(diào)gr并不能調(diào)控mif，用基因敲除將細胞中icbp90mrna減少70％，但是icbp90shrna+grshrna和只有icbp90shrna并沒有區(qū)別(圖9a)，但是細胞內(nèi)的icbp90卻減少了(圖9b)；用空載體(pcmvcontrol)、pcmv-icbp90和pcmv-icbp90+gr分別轉(zhuǎn)染類風濕滑膜成纖維細胞，48小時后，通過qpcr和western印跡分別檢測icbp90mrna和細胞內(nèi)icbp90蛋白含量。檢測結(jié)果如圖10所示，由圖10可知，通過pcmv載體對icbp90的上調(diào)可使細胞icbp90mrna增加約50％，但是和pcmv-icbp90+gr沒有太大差異(圖10a)，而icbp90蛋白表達增加(圖10b)。圖9-10說明gc激活的gr對mif的調(diào)控是以icbp90作為橋梁實現(xiàn)的。圖11a為檢測各shrna轉(zhuǎn)染的grmrna含量，圖11b為檢測各pcmv轉(zhuǎn)染的grmrna含量，圖11c為檢測各shrna轉(zhuǎn)染的mifmrna含量，圖11d為檢測各pcmv轉(zhuǎn)染的mifmrna含量。由圖11a和圖11b可知在類風濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細胞中icbp90也改變了gr表達，也伴隨著mifmrna(圖11c)和細胞內(nèi)mif含量(圖11d)的表達顯著降低和增加，但是當添加gr干預(yù)時，mif表達沒有變化，所以以上進一步證明gr通過結(jié)合icbp90調(diào)節(jié)mif表達。圖10-圖11所有數(shù)據(jù)是三次測量的平均值±sd，所有實驗都均重復(fù)兩次，**p<0.01，*p<0.05，顯示的蛋白印跡分別是三個獨立實驗。實施例5icbp90或gr影響糖皮質(zhì)激素刺激mif表達通過icbp90或gr調(diào)節(jié)人類t細胞中的糖皮質(zhì)激素活化的mif表達。將cem-c7細胞(dex敏感)用50ng攜帶0,5,6,7和8個catt重復(fù)的mif啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒和250ngicbp90shrna或?qū)φ誷hrna、grshrna或?qū)φ誷hrna共轉(zhuǎn)染，作為內(nèi)部對照，同時轉(zhuǎn)染10ng的prl-tk，培養(yǎng)12小時后，然后分別檢測對照和用0.01pm、1pmdex、10pmdex、100pmdex、1nmdex刺激后的總細胞裂解物中的熒光素酶活性，使用td-20/20光度計(turnerdesigns)和dualluciferase報告系統(tǒng)(promega)測量熒光素酶的活性，檢測結(jié)果如圖12所示，由圖12a-f可知，1pmdex刺激顯示出最高的mif轉(zhuǎn)錄，在不同dex濃度影響下，icbp90對mif轉(zhuǎn)錄的影響，觀察到grshrna在對照和dex誘導(dǎo)對mif表達在mif-794catt5-8長度依賴性有相似作用。通過結(jié)合icbp90，糖皮質(zhì)激素可以通過gr以濃度依賴的方式刺激mif表達。實施例6icbp90可以減少糖皮質(zhì)激素抵抗icbp90和gr之間不用形成蛋白質(zhì)復(fù)合物可以減少糖皮質(zhì)激素抵抗。培養(yǎng)的人類風濕滑膜成纖維細胞用對照或icbp90shrna轉(zhuǎn)染24小時后，用10nmdex處理另外24小時并同時加入mif，pbs洗滌細胞一次，用細胞凋亡熒光(hochest33258invitrogen)染色細胞20分鐘，用免疫熒光儀讀取熒光值，結(jié)果如圖13所示。由圖13可知，icbp90敲除可增加類風濕滑膜成纖維細胞的凋亡，凋亡效率與敲除糖皮質(zhì)激素受體gr基本相同。用對照shrna、icbp90shrna或grshrna轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人t細胞(cem-c7)；20小時后用1pmdex處理24小時，并同時加入mif，然后用pbs洗滌一次細胞，并將細胞凋亡熒光染色至facs分析。圖14為各轉(zhuǎn)染后用1pmdex處理對應(yīng)的凋亡率柱形圖。由圖14可知，icbp90敲除可增加人t細胞的凋亡，凋亡效率與敲除糖皮質(zhì)激素受體gr基本相同。基因型大于5的人mif表達比基因型是5的人高，因此更容易產(chǎn)生gc抵抗，在基因型6/7的人類原代t細胞中icbp90與gr之間不用形成蛋白質(zhì)復(fù)合物可以減少糖皮質(zhì)激素抵抗。用對照shrna、icbp90shrna或grshrna轉(zhuǎn)染用淋巴細胞分離培養(yǎng)基衍生的原代人t細胞；20小時后用1pmdex處理24小時，然后用pbs洗滌一次細胞，并將細胞凋亡熒光染色至facs分析。圖15為各轉(zhuǎn)染后用1pmdex處理對應(yīng)的凋亡率柱形圖。由圖15可知，icbp90敲除可顯著增加人t細胞的凋亡，凋亡效率與敲除糖皮質(zhì)激素受體gr基本相同。用對照抗體(controlab)、icbp90抗體(icbp90ab)或grab處理t細胞(cem-c7)，并設(shè)計不同的dex或/和mif處理方案，各方案如表1所示，再用annexinv-fitc凋亡檢測，其檢測結(jié)果如圖16所示，各方案對應(yīng)圖16上標記。表1各抗體、dex和mif處理細胞對應(yīng)表方案dexrmifcontrolabicbp90abgraba-----b+----c++---d+-+--e+--+-f++-+-g+---+-表示無，+表示有由圖16可知icbp90ab可顯著增加人t細胞的凋亡，凋亡效率與糖皮質(zhì)激素受體gr抗體基本相同。由以上實驗可知，icbp90ab或icbp90抑制劑能降低糖皮質(zhì)激素抵抗，促進糖皮質(zhì)激素治療相關(guān)病癥的作用，所述相關(guān)病癥如免疫炎癥病癥、變態(tài)反應(yīng)性病癥、過敏性病癥或血液系統(tǒng)疾病。所述變態(tài)反應(yīng)性病癥具體表現(xiàn)為風濕熱、風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、風濕性心肌炎、大動脈炎、結(jié)節(jié)性動脈周圍炎、腎小球腎炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。所述血液系統(tǒng)疾病為急性淋巴細胞性白血病、再生障礙性貧血、粒細胞減少癥、血小板減少癥或過敏性紫癜。最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院<120>icbp90抗體及其表達抑制劑在制備促進糖皮質(zhì)激素治療效果的藥物中的應(yīng)用<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>icbp90shrna識別的靶序列<400>1gtcatttaccacgtgaaatac21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>icbp90shrna識別的靶序列<400>2gatctttccggcaacaagagg21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>icbp90shrna識別的靶序列<400>3gctacgatggcatctacaagg21當前第1頁12