本發(fā)明涉及一種生物材料，具體是一種基于乳鐵蛋白活性的新型生物材料的制備方法。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代社會(huì)人口老齡化問題的加劇，骨創(chuàng)傷、骨腫瘤以及其它骨骼疾病的發(fā)病率居高不下，直接導(dǎo)致了大量的骨折和骨缺損患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年骨缺損患者超過500萬人，其中因骨質(zhì)疏松引起的脊柱和四肢骨骼等的骨折患者人數(shù)在200萬人以上，因骨腫瘤切除、人工關(guān)節(jié)周圍骨溶解、脊柱融合等需進(jìn)行骨移植手術(shù)的患者約40萬例，而這些患者大多面臨著植骨治療。

目前，傳統(tǒng)植骨治療手段主要包括自體骨移植和異體骨移植。自體骨移植一直稱為行業(yè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其來源有限，供體骨形狀和結(jié)構(gòu)不合適，又會(huì)對(duì)患者造成二次創(chuàng)傷，使用受到一定限制。而異體骨移植也存在免疫排斥反應(yīng)以及攜帶疾病的可能，直接影響植骨治療的效果。因此研究開發(fā)生物相容性好生物性能接近自體骨組織，無免疫排斥反應(yīng)的人造骨組織一直是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究和探索的熱點(diǎn)。而隨著醫(yī)學(xué)工程的發(fā)展，骨組織工程的出現(xiàn)逐漸引起了廣泛的關(guān)注。其主要原理是將種子細(xì)胞種植于復(fù)合了細(xì)胞因子的支架材料上，形成三維復(fù)合體，植入骨缺損部位，在生物材料逐步降解的同時(shí)，種植的骨細(xì)胞不斷增殖，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，逐漸完成自體骨替代植入骨的過程，最后達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的。因此，支架材料、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子是骨組織工程的重要組成部分。

2、國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

羥基磷灰石（hap）作為骨組織的重要組成成分，是目前公認(rèn)的最具潛力的骨組織替代材料，但單一的羥基磷灰石機(jī)械性差，作為骨替代材料的可靠性差。納米技術(shù)的應(yīng)用使羥基磷灰石在生物、化學(xué)、力學(xué)等方面都有了顯著變化。人體骨組織中的羥基磷灰石主要是納米針狀單晶體結(jié)構(gòu)，沿一定的方位分布在膠原組織中。因此，根據(jù)天然骨組織的形成機(jī)制，采用仿生的方法制備的成分、結(jié)構(gòu)與天然骨相似的hap/col類骨修復(fù)材料既具有良好的力學(xué)性能，也可以作為骨生長(zhǎng)因子的良好載體。

骨組織是一種受損后仍能恢復(fù)的組織，新骨的形成主要包括破骨細(xì)胞的再吸收和成骨細(xì)胞分泌類骨質(zhì)基質(zhì)及礦化等過程。關(guān)于hap/col的成骨機(jī)理，hayashik等提出植入體內(nèi)的hap材料在缺損處為修復(fù)早期的微血管形成及宿主內(nèi)骨系細(xì)胞的附著提供支撐，hap晶體的刺激使骨細(xì)胞活躍而圍繞hap顆粒并以其為中心形成成骨區(qū)，即多中心成骨，在骨鹽沉積過程中由hap提供晶核以加速鈣化成骨。weinleanderm等提出了hap與骨質(zhì)可進(jìn)行離子交換，hap表面的負(fù)電荷可選擇性地使鈣、磷離子在其表面沉積，從而刺激新骨的生長(zhǎng)。hap降解產(chǎn)生的鈣及磷酸根離子可被周圍新生骨組織利用，刺激和促進(jìn)更多新骨生成。而col不僅可以誘導(dǎo)礦物沉積，還可誘導(dǎo)組織產(chǎn)生趨化因子，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和骨修復(fù)。膠原纖維中的纖維蛋白在凝血酶的作用下可聚合成可塑性良好的纖維蛋白凝膠，以彌補(bǔ)hap在可塑性上的缺陷。

張興棟等在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上提出了鈣磷陶瓷誘導(dǎo)骨發(fā)生的機(jī)制假說，羥基磷灰石骨誘導(dǎo)的步驟如下：鈣磷陶瓷植入機(jī)體非骨部位，吸附bmps等內(nèi)源性骨生長(zhǎng)因子，誘使間充質(zhì)細(xì)胞向材料內(nèi)趨化和遷移。骨生長(zhǎng)因子作用于間充質(zhì)細(xì)胞相應(yīng)受體，經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，引起級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)和相關(guān)基因表達(dá)，并使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨母細(xì)胞，分泌骨粘連素等骨細(xì)胞間特異性的粘連分子。骨母細(xì)胞將具有類似自然骨特定化學(xué)組成和三維多孔結(jié)構(gòu)的陶瓷錯(cuò)位識(shí)別為自然骨，停泊、黏附于其內(nèi)表面，進(jìn)而骨母細(xì)胞自分泌bmp等生長(zhǎng)因子引起自身及相應(yīng)細(xì)胞分化、增殖、成熟為骨。

因而，生長(zhǎng)因子是骨組織的發(fā)育、維持、再生等過程中的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)。目前在骨組織工程中應(yīng)用較多的骨生長(zhǎng)因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bmp）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（igf）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（egf）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fgf）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（tgf-β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vegf）等。但這幾種骨生長(zhǎng)因子現(xiàn)階段主要還是通過基因工程學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)手段獲得，不但其生產(chǎn)設(shè)備繁復(fù)，而且其制備工藝也相當(dāng)復(fù)雜，因此造成其制作成本高，價(jià)格昂貴，難以大規(guī)模生產(chǎn)，限制了其在實(shí)驗(yàn)及臨床中的廣泛應(yīng)用。

而lf是一種80kda左右的鐵結(jié)合糖蛋白，廣泛分布于哺乳動(dòng)物乳汁和其他多種組織及其分泌液中，人乳中l(wèi)f濃度約為1.0～3.2mg/ml，其含量?jī)H次于酪蛋白，占普通母乳總蛋白的20%，易于獲取。并且有研究表明，lf對(duì)成骨細(xì)胞的增值有良好的促進(jìn)作用，且該作用呈劑量依賴關(guān)系。另外已有報(bào)道lf對(duì)體外骨細(xì)胞的影響和作用機(jī)制以及局部注射lf對(duì)骨細(xì)胞的影響和作用機(jī)制，這些研究確定了lf是一種新型的骨生長(zhǎng)因子，它對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的總作用效果是增加了骨含量，即促進(jìn)了骨形成又抑制了骨吸收。

grey等人也研究報(bào)道了lf對(duì)于鼠前體成骨細(xì)胞dna的合成具有促進(jìn)作用，說明lf對(duì)于成骨樣細(xì)胞的有絲分裂具有促進(jìn)作用。使用mapk抑制劑對(duì)鼠成骨樣前體細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)對(duì)lf誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞有絲分裂受到了抑制作用，說明lf是通過調(diào)控mapk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化的，并且能夠顯著地抑制成骨細(xì)胞的凋亡。lf可以減少由于依托皂苷所導(dǎo)致的成骨細(xì)胞凋亡率達(dá)60%。對(duì)鼠骨髓的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)lf可呈劑量依賴地抑制破骨細(xì)胞的生成，而且當(dāng)lf濃度為100μg/ml時(shí)作用最大，可以完全地抑制破骨細(xì)胞的生成。因此大量實(shí)驗(yàn)研究表明，lf不僅具有抗菌、抗炎、調(diào)控骨再生預(yù)防骨質(zhì)流失等多種生物活性，還可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖抑制成骨細(xì)胞凋亡，從而可作為一種新型的骨生長(zhǎng)因子應(yīng)用于骨組織工程。

在生物材料領(lǐng)域，蛋白質(zhì)的吸附是植入材料與組織相互作用的第一步，所以蛋白質(zhì)與生物材料的相互作用是骨組織工程的設(shè)計(jì)關(guān)鍵。羥基磷灰石作為骨修復(fù)材料植入體內(nèi)時(shí)，其表面吸附的生長(zhǎng)因子對(duì)骨重建具有至關(guān)重要的作用。本發(fā)明從hap/col與lf的相互作用機(jī)制入手，將來源較廣的lf負(fù)載于hap/col植入材料上，實(shí)現(xiàn)骨生長(zhǎng)因子的緩慢釋放，從而提高h(yuǎn)ap/col復(fù)合材料的成骨活性，獲得一種具有較高生物活性的新型骨組織工程復(fù)合材料。

目前已知的骨生長(zhǎng)因子主要有：包括bmp在內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族（tgfs）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fgf）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（pdgf）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vegf）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（igf）等。但這些內(nèi)源性的骨生長(zhǎng)因子主要通過兩種方法獲得，一種是從體液或血液等組織分離提取，但生長(zhǎng)因子在體內(nèi)的屬于微量多肽或蛋白，提取困難。另一種是通過基因工程學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)手段獲得，不但其生產(chǎn)設(shè)備繁復(fù)，而且其制備工藝也相當(dāng)復(fù)雜，因此造成其制作成本高，價(jià)格昂貴，難以大規(guī)模生產(chǎn)，限制了其在實(shí)驗(yàn)及臨床中的廣泛應(yīng)用。并且骨生長(zhǎng)因子的半衰期較短，容易在體內(nèi)降解和被體液稀釋，達(dá)不到理想的效應(yīng)濃度，但如果采用首次大劑量給藥，容易導(dǎo)致局部毒性和血管瘤樣病變，也限制了其應(yīng)用范圍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是一種基于乳鐵蛋白活性的新型復(fù)合生物材料的制備方法，該產(chǎn)品具有良好的生物相容性，與常規(guī)材料相比具有更高的成骨活性。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種基于乳鐵蛋白活性的新型生物材料的制備方法，其特征在于，步驟如下：

將hap/col粉末加入乳鐵蛋白溶液中，hap/col粉末的加入量為乳鐵蛋白質(zhì)量的的0.2%～1%，30～40℃反應(yīng)5～30h，過濾離心，取上清液，并用超純水對(duì)復(fù)合物粉末沖洗去除雜質(zhì)，采用冷凍干燥的方式對(duì)得到的hap-lf復(fù)合材料進(jìn)行干燥處理。

進(jìn)一步地，羥基磷灰石/膠原粉末的制備方法：取80～120ml膠原蛋白溶液，逐滴加入1～2mol/l的ca(no3)2攪拌10～30min后滴加0.5～1mol/l的(nh4)2hpo4溶液，控制反應(yīng)溫度10℃以下，繼續(xù)攪拌30～90min，以0.5～1mol/l氫氧化鈉滴定溶液ph至6～8，同時(shí)收集白色沉淀，蒸餾水反復(fù)洗滌沉淀，凍干后制得羥基磷灰石/膠原粉末，其中，滴加的ca(no3)2和(nh4)2hpo4的體積比為=1:1。

進(jìn)一步地，所述的膠原蛋白溶液為：將膠原溶于0.04～0.06mol/l的醋酸溶液中，制備0.5～1%酸性膠原溶液，低溫下添加na2hpo4·12h2o使終濃度為0.01～0.03mol/l，用2～3mol/l的naoh溶液調(diào)ph至中性備用。

進(jìn)一步地，所述乳鐵蛋白溶液的制備方法為：將乳鐵蛋白粉末溶于ph為4～8的磷酸鹽緩沖溶液中，使終濃度為0.2～5mg/ml，經(jīng)過充分?jǐn)嚢枞芙庵?，將溶液通過0.1～0.45μm孔徑的膜，收集透過液備用。

本發(fā)明的有益效果為：（1）將具有成骨活性的乳鐵蛋白作為一種新型的骨生長(zhǎng)因子應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域，解決了目前各種骨生長(zhǎng)因子獲取較難，價(jià)格昂貴的問題。（2）利用乳鐵蛋白與羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合材料之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)了乳鐵蛋白的緩慢釋放，解決了負(fù)載生長(zhǎng)因子半衰期短的問題。（3）一定程度得提高了羥基磷灰石/膠原蛋白植入材料的促成骨活性，解決了單一生物材料生物活性較低的問題。

說明書附圖

圖1本發(fā)明的工藝流程圖。

圖2水熱法合成hap掃描電鏡圖。

圖3羥基磷灰石氮?dú)馕矫摳角€（a）圖。

圖4bjh孔徑分布(b)圖。

圖5hap/col對(duì)lf的吸附曲線。

圖6兩種hap/col結(jié)合lf后的tg-dtg曲線；（a）hap/col,(b)hap/col-lf,(c)lf。

圖7hap,hap-lf以及l(fā)f的紅外表征圖。

圖85hap/col-lf復(fù)合物在pbs中的釋放率。

圖9hap-lf不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解釋說明。

（1）羥基磷灰石的合成：采用caco3和cahpo4·2h2o的混合物為前驅(qū)物，通過水熱合成得到晶粒完整、分散性好、端面粒度在100nm以下的ha粉體。

（2）hap/col復(fù)合材料的制備：取80～120ml膠原蛋白溶液，逐滴加入1～2ml磷酸，攪拌10～30min后滴加0.02～0.04mol/l氯化鈣溶液，繼續(xù)攪拌30～90min，以0.5～1mol/l氫氧化鈉滴定溶液ph至6～8，同時(shí)收集白色沉淀，凍干后制得羥基磷灰石/膠原粉末。

（3）乳鐵蛋白溶液的配置：將乳鐵蛋白粉末溶于ph為4～8的磷酸鹽緩沖溶液(pbs)中，使終濃度為0.2～5mg/ml，經(jīng)過充分?jǐn)嚢枞芙庵?，將溶液通過0.1～0.45μm孔徑的膜，收集透過液備用。

（4）hap/col-lf復(fù)合物的制備：將hap/col粉末加入乳鐵蛋白溶液中，羥基磷灰石與乳鐵蛋白量的比為0.2%～1%，30～40℃，800～1200r/min反應(yīng)5～30h。

（5）過濾離心：反應(yīng)結(jié)束后，3000～10000r/min離心5分鐘，去上清，并用2ml超純水對(duì)復(fù)合物粉末沖洗1～5遍，以去除hap-lf復(fù)合物之外的其它雜質(zhì)。

（6）產(chǎn)品干燥：采用冷凍干燥的方式對(duì)得到的hap-lf復(fù)合材料進(jìn)行干燥處理。干燥后粉末中水分含量小于5%。

本發(fā)明所得到的hap-lf新型復(fù)合生物材料相關(guān)的研究方法如下：

（1）合成羥基磷灰石的掃描電鏡觀察

用吸耳球吹走待測(cè)的天然hap表面的灰塵，去離子水洗凈樣品后，放于恒溫干燥箱中干燥，待樣品徹底干燥后用導(dǎo)電膠將樣品貼于掃描電境的載物臺(tái)表面，再將載物臺(tái)放入掃描電鏡的真空腔內(nèi)，調(diào)節(jié)鏡頭的位置和焦距，逐一對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

（2）合成羥基磷灰石的比表面積表征

采用全自動(dòng)比表面孔徑分析儀asap2020對(duì)合成的羥基磷灰石的比表面積進(jìn)行分析。樣品烘干后，取0.6g裝入樣品管進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理溫度為150℃。其次抽真空，抽氣真空值為500μmhg。而后進(jìn)行吸附脫附分析，150℃反應(yīng)6h，升溫速率為10℃/min。

（3）hap/col-lf復(fù)合物中l(wèi)f裝載量的測(cè)定

根據(jù)反應(yīng)前后溶液中蛋白含量的差來計(jì)算，溶液中蛋白濃度的測(cè)定采用bca法。按照說明書的具體方法，將反應(yīng)前蛋白溶液的濃度記為c1，體積為v，反應(yīng)后溶液中蛋白的濃度記為c2，沖洗掉蛋白的量為w1，羥基磷灰石的量為w2，則復(fù)合物中l(wèi)f的裝載量w%為：

裝載量還可通過熱重分析的方法進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)前后hap/col與hap/col-lf質(zhì)量下降之間的差值即為lf裝載于hap/col上的量。利用熱重分析儀對(duì)所制備的hap/col以及hap/col-lf的有機(jī)物及無機(jī)物的含量百分比及分解溫度進(jìn)行分析。熱重分析測(cè)試是在流動(dòng)的氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行，升溫速率為20℃/min，溫度范圍為20～800℃。

（4）hap/col-lf復(fù)合材料的紅外表征

將待測(cè)的天然羥基磷灰石試樣和溴化鉀在恒溫干燥箱中加熱100℃干燥數(shù)小時(shí)，然后將待測(cè)試樣和溴化鉀按照1:100的比例放入瑪瑙研缽，充分研磨，使兩者混合均勻。取適量研磨后的混合物倒入紅外專用壓片模具中，加壓28mpa，保持1分鐘后取出，混合物加入量以最終壓制的圓片為半透明狀為宜。將壓制的圓片狀樣品置于傅里葉變換紅外光譜儀上，采用透射法測(cè)定其紅外光譜，掃描時(shí)設(shè)定掃描間隔為4cm^-1，掃描次數(shù)為64次，掃描范圍從400cm^-1至4000cm^-1，掃描背景后對(duì)樣品進(jìn)行掃描，并對(duì)所得譜圖進(jìn)行校正，即得到樣品的紅外光譜圖。將待測(cè)試樣的紅外光譜圖及其具體數(shù)據(jù)與羥基磷灰石標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較，確定待測(cè)試樣的成分。

（5）lf體外釋放率的測(cè)定

將hap/col-lf復(fù)合物置于ph7～8的pbs緩沖溶液中，每24h取500μl于離心管中，采用bca的方法測(cè)其中蛋白含量。

（6）hap/col-lf復(fù)合材料的成骨活性

采用mtt法分析hap/col-lf復(fù)合物對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將成骨細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為每孔l×10⁵個(gè)/ml，然后將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。在培養(yǎng)48h后進(jìn)行檢測(cè)。吸除培養(yǎng)液，用pbs反復(fù)清洗除去死細(xì)胞，每孔加入含有0.5%mtt的α-mem100μl，于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育4h；在下觀察出現(xiàn)黑色網(wǎng)狀物后終止孵育，棄去培養(yǎng)液；每孔加入150μldmso，振蕩10min后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定其吸光值，用od值表示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

（1）合成羥基磷灰石的掃描電鏡觀察

對(duì)水熱法合成的羥基磷灰石試樣進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果如2所示。水熱合成的羥基磷灰石呈針狀，長(zhǎng)在100-150nm之間，寬在20-30nm之間。

（2）合成羥基磷灰石的比表面積表征

水熱合成的羥基磷灰石的比表面積和孔徑分布分析如圖3和圖4所示。a和b為納米級(jí)羥基磷灰石的氮?dú)馕?脫附曲線圖和孔徑分布圖。氮?dú)馕?脫附的曲線不重合，有明顯的滯后環(huán)，屬于典型的ⅳ型吸附曲線，表明羥基磷灰石樣品具有介孔結(jié)構(gòu)。由氮?dú)馕?脫附曲線，經(jīng)bet分析可知，合成的羥基磷灰石的比表面積為84.48m²/g。由b材料的孔徑分布圖可知，合成的羥基磷灰石中的孔主要分布在2-4nm和20-30nm之間。但根據(jù)合成的羥基磷灰石的形貌可以判斷出2-4nm左右的介孔屬于顆粒內(nèi)孔而20-40nm左右的介孔可能是顆粒間孔。

（3）hap/col-lf復(fù)合物中l(wèi)f的裝載量

由圖5可知，lf在hap/col上的吸附量逐漸趨向于一個(gè)極值，說明hap/col和lf之間存在著吸附平衡。在37℃條件下，hap/col對(duì)lf的飽和吸附量約為91.10μg.mg^-1。

hap/col-lf復(fù)合物的熱重分析如圖6所示。由圖6的tg曲線可知，hap/col材料失重5.2%，hap/col-lf失重17.844%。單一材料與復(fù)合蛋白后的材料最終重量變化之差即為材料上吸附蛋白的量。同時(shí)由圖6dtg曲線可知，在升溫過程中hap/col的質(zhì)量變化在500℃以下都經(jīng)歷了一個(gè)階段即200℃以下所發(fā)生的物理水的蒸發(fā)。而hap/col-lf的質(zhì)量變化在500℃以下都經(jīng)歷了兩個(gè)階段，即200℃以下所發(fā)生的物理水的蒸發(fā)和200-500℃時(shí)的材料表面蛋白的灰化。乳鐵蛋白的dtg曲線在200-500℃也有一個(gè)明顯的失重峰，且失重的溫度點(diǎn)與hap/col相吻合，可進(jìn)一步證明經(jīng)反復(fù)沖洗后的hap/col-lf材料表面仍有l(wèi)f吸附。500℃以上時(shí)，hap/col與hap/col-lf的tg曲線趨于平行，且從dtg曲線也可發(fā)現(xiàn)，500℃之后hap/col與hap/col-lf失重溫度點(diǎn)相同且兩條線趨于相交證明所吸附蛋白完全從兩種hap/col上脫除。

（4）hap/col-lf復(fù)合材料的紅外表征

hap與hap-lf以及l(fā)f的紅外表征圖如圖7所示。(1)nano-hap，(2)nano-hap-lf，(3)lf。hap圖譜中出現(xiàn)了hap所有的特征峰，由hap的紅外圖譜可知，565cm^-1、603cm^-1處為po4^3-的彎曲振動(dòng)峰，952cm^-1、1031cm^-1為po4^3-的伸縮振動(dòng)峰，3425cm^-1處為-oh的伸縮振動(dòng)峰。且對(duì)于hap-lf來說，在1530cm^-1附近均出現(xiàn)了一個(gè)c-h伸縮振動(dòng)峰，而此峰也同樣出現(xiàn)在了lf中，所以進(jìn)一步證實(shí)在經(jīng)過充分洗滌后，lf仍穩(wěn)定地吸附在hap表面。

（5）lf體外釋放率的測(cè)定

hap/col-lf復(fù)合物在pbs中的釋放規(guī)律如圖8所示，結(jié)果顯示，在0-7d的時(shí)間范圍內(nèi)，hap/col對(duì)lf表現(xiàn)出了良好的緩釋作用，最大釋放量達(dá)到75%左右。

（6）hap/col-lf復(fù)合材料的成骨活性

采用mtt法考察hap-lf作用于成骨細(xì)胞24h、48h和72h后的影響，結(jié)果如圖9所示。圖9中：a，b，c，d表示不同水解時(shí)間產(chǎn)生的水解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞作用的差異顯著性，相同字母代表差異不顯著（p＞0.05），不相同字母代表差異顯著（p＜0.05）。

從圖中可以看出，在復(fù)合物作用于成骨細(xì)胞48h和72h后，hap-lf組與單純的hap組相比能顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，并且作用效果最顯著。而hap組與空白對(duì)照組相比表現(xiàn)出了較差的生物相容性，但復(fù)合了lf后，其對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有了顯著的提高。所以，lf復(fù)合于hap的表面，顯著提高了hap的生物活性。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。