本發(fā)明屬于骨組織修復材料的制備技術領域，具體涉及一種利用相轉(zhuǎn)變?nèi)芫钢苽涞牧u基磷灰石涂層雜化材料及制備方法。

背景技術：

羥基磷灰石(hap)，分子式為ca10(po4)6(oh)2，是一種由有機和無機納米雜化體所組成的復合物，與人體和動物硬組織骨、牙齒的無機基質(zhì)具有相似的組成，具有良好的生物相容性、生物活性、骨傳導和骨結(jié)合能力，在當代生物醫(yī)學與組織工程學中都有巨大的潛在應用前景。然而，目前所制備的羥基磷灰石材料大多都是惰性的、缺乏界面活性，因此成功的制備出具有生物活性的羥基磷灰石有機-無機雜化材料的關鍵在于設計出一種具備靈活可控的界面粘附模板材料。目前許多學者采用膠原蛋白、絲素蛋白、殼聚糖、甲克素等為仿生礦化模板誘導羥基磷灰石的生成。但是這些制備技術仍然存在價格昂貴、生物降解快、機械強度低、制備成分不單一、工藝復雜，并且適用于少數(shù)基材以及原材料來源單一等缺點，因此開發(fā)一種新型、簡單、綠色環(huán)保，且適用于多種基材的生物涂層用于仿生礦化制備羥基磷灰石的技術仍是科學家們面臨的一項挑戰(zhàn)。簡而言之，對于生物礦化來說開發(fā)具有生物功能化的有機和無機材料仍然是一個至關重要的挑戰(zhàn)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種操作簡單、綠色環(huán)保、具有普適性的羥基磷灰石/相轉(zhuǎn)變?nèi)芫竿繉与s化材料的制備方法。

解決上述技術問題所采用羥基磷灰石/相轉(zhuǎn)變?nèi)芫竿繉与s化材料的制備方法為：在基材表面負載溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物或粘附溶菌酶二維納米薄膜后，將基材浸入氯化鈣水溶液中螯合鈣離子，然后將螯合鈣離子的基材浸入模擬體液或模擬唾液中，在密閉條件下37～70℃孵化7～14天，得到羥基磷灰石/相轉(zhuǎn)變?nèi)芫竿繉与s化材料。

上述在基材表面負載溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的方法與公布號cn105039953a的發(fā)明專利申請公開的方法相同；在基材表面粘附溶菌酶二維納米薄膜的方法與公布號cn105153443a的發(fā)明專利申請中公開的在基材表面形成生物蛋白質(zhì)二維納米薄膜(即溶菌酶二維納米薄膜)的方法相同。

上述制備方法中，優(yōu)選將基材浸入氯化鈣水溶液中浸泡48小時，且每隔12小時更換一次氯化鈣水溶液，用以螯合鈣離子，其中所述氯化鈣水溶液中氯化鈣的濃度為0.002～2mol/l，優(yōu)選氯化鈣的濃度為0.01～0.05mol/l。

上述制備方法中，進一步優(yōu)選在密閉條件下70℃孵化7天。

上述的基材為au、ag、cu、pt、ti、si、sio2、ito、石英、云母、玻璃、牙齒、zro2、聚對苯二甲酸、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、聚四氟乙烯、醫(yī)用導管、木材、碳纖維、棉纖維、陶瓷中的任意一種。

本發(fā)明通過模擬自然界生物礦化，以化學性質(zhì)穩(wěn)定、易于改性的天然生物大分子溶菌酶為蛋白質(zhì)模板，成功的利用其表面豐富的功能性基團通過螯合作用將鈣離子固定至基材表面，之后通過靜電相互作用力在體外進行模擬生物礦化的過程成功誘導羥基磷灰石(hap)的成核并結(jié)晶，制備出與天然骨成分相近、結(jié)構相似且機械強度高、表面積大、生物活性好的生物活性涂層材料——羥基磷灰石/相轉(zhuǎn)變?nèi)芫竿繉与s化材料(hap@ptl)。

本發(fā)明制備的羥基磷灰石/相轉(zhuǎn)變?nèi)芫竿繉与s化材料，不僅具有優(yōu)越的機械穩(wěn)定性，而且具有良好的生物相容性和高的骨誘導性、骨傳導性，可以作為組織修復材料指引新組織的形成和骨的誘導礦化，有望成為新型的硬組織替代材料。

本發(fā)明操作過程簡便可控、條件溫和、晶體形貌可控、綠色環(huán)保、成本低廉，且適用于在多種基材表面制備羥基磷灰石，為發(fā)展普適性的羥基磷灰石生物涂層的制備提供了新的技術手段，也為實際的生物醫(yī)學應用提供了一種低成本、實用的方法，具有廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的x-射線衍射光譜。

圖2是實施例1制備的ptl、ptl-ca²⁺、hap@ptl涂層雜化材料的紅外光譜。

圖3是實施例1制備的ptl、hap@ptl涂層雜化材料的拉曼光譜。

圖4是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的能譜圖。

圖5是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖6是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的透射電鏡圖。

圖7是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的電子衍射圖。

圖8是實施例2制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖9是實施例3制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖10是實施例4制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖11是實施例5制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖12是實施例6制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖13是實施例7制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖14是實施例8制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖15是實施例9制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖16是實施例10制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖17是實施例11制備的hap@ptl涂層雜化材料的掃描電鏡圖。

圖18是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的摩擦率。

圖19是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的細胞活性檢測(cck-8測試)。

圖20是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的細胞活性檢測(alp測試)。

圖21是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料表面的細胞形貌。

圖22是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的組織甲苯胺藍染色。

圖23是實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料的組織蘇木精-伊紅染色。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于這些實施例。

實施例1

將0.1433g三(2-羧乙基)膦加入10ml10mmol/lph值為7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中，用naoh調(diào)節(jié)ph值至5.8，配制成50mmol/l的三(2-羧乙基)膦的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液；將20mg溶菌酶加入10ml10mmol/lph值為7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中，配制成2mg/ml的溶菌酶的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液；將0.2ml50mmol/l的三(2-羧乙基)膦的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液與0.2ml2mg/ml的溶菌酶的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液混合均勻，將直徑為1cm的鈦片與混合液表面接觸，室溫靜置50分鐘，在鈦片表面粘附一層溶菌酶二維納米薄膜(ptl)，其厚度約為50nm。將表面粘附溶菌酶二維納米薄膜的鈦片完全浸入0.02mol/l的氯化鈣水溶液中，常溫浸泡48小時，且每隔12小時更換一次氯化鈣水溶液，用以螯合鈣離子。將溶菌酶二維納米薄膜表面螯合鈣離子(ptl-ca²⁺)的鈦片用超純水清洗后用氮氣吹干，再將其完全浸入模擬體液中，在密閉條件下70℃孵化7天，用超純水清洗后常溫真空干燥30分鐘，得到hap@ptl涂層雜化材料。

發(fā)明人采用x-射線衍射儀、紅外光譜儀、拉曼光譜儀、掃描電鏡以及能譜儀、透射電鏡對所得樣品進行表征，結(jié)果見1～7。由圖1的x射線衍射分析證明，在溶菌酶二維納米薄膜表面生長的晶體為羥基磷灰石而不是其他磷酸鈣。在圖2的紅外光譜中，溶菌酶二維納米薄膜的酰胺鍵出現(xiàn)在1530和1675cm^-1，hap@ptl涂層雜化材料在566、602和1033cm^-1處出現(xiàn)了新峰，主要是o-p-o鍵彎曲振動。在圖3的拉曼光譜中，對比于原始的ptl出現(xiàn)了一些新的峰，主要是在430cm^-1處的p-o鍵、593cm^-1處的o-p-o鍵彎曲振動和962cm^-1處的p-o伸縮振動，962cm^-1處的峰是hap結(jié)晶最具有代表性的標志。圖4的能譜數(shù)據(jù)也證明了由溶菌酶二維納米薄膜誘導的hap的ca/p比為1.66與天然骨成分相近。由圖5～7可見，在鈦片表面形成一層均勻且致密的羥基磷灰石晶體，羥基磷灰石聚集體是由針狀的納米晶體簇沿軸向排列構成的，這種垂直排列的羥基磷灰石結(jié)構類似于天然的骨與牙齒的羥基磷灰石的形貌，電子衍射也證實了納米羥基磷灰石具有典型的(200)、(002)、(211)、(300)晶面，其中第(002)晶面表明溶菌酶二維納米薄膜誘導的羥基磷灰石晶體主要沿c軸定向生長。上述表征結(jié)果證明由溶菌酶二維納米薄膜誘導礦化的羥基磷灰石的成分及結(jié)構與天然骨組織相似。

實施例2

本實施例中，將實施例1的鈦片用zro2替換，其他步驟與實施例1相同，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖8)。

實施例3

本實施例中，將實施例1的鈦片用醫(yī)用導管替換，其他步驟與實施例1相同，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖9)。

實施例4

本實施例中，將實施例1的鈦片用牙齒替換，其他步驟與實施例1相同，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖10)。

實施例5

本實施例中，將實施例1的鈦片用聚四氟乙烯替換，其他步驟與實施例1相同，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖11)。

實施例6

本實施例中，將實施例1的鈦片用木頭替換，其他步驟與實施例1相同，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖12)。

實施例7

本實施例中，將實施例1的鈦片用布替換，其他步驟與實施例1相同，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖13)。

實施例8

將0.1433g三(2-羧乙基)膦加入10ml10mmol/lph值為7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中，用naoh調(diào)節(jié)ph值至9.0，配制成50mmol/l的三(2-羧乙基)膦的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液；將20mg溶菌酶加入4ml10mmol/lph值為7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中，配制成5mg/ml的溶菌酶的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液；將0.2ml50mmol/l的三(2-羧乙基)膦的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液與0.2ml5mg/ml的溶菌酶的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液混合均勻，將所得混合液滴加到鈦片表面，在潮濕環(huán)境中室溫培養(yǎng)2小時，然后將金片浸入超純水中，振蕩清洗干凈，室溫真空干燥1小時，得到負載溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的金片。將負載溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的金片完全浸入0.02mol/l的氯化鈣水溶液中，常溫浸泡48小時，且每隔12小時更換一次氯化鈣水溶液，用以螯合鈣離子。將螯合鈣離子的金片用超純水清洗后用氮氣吹干，再將其完全浸入模擬體液中，在密閉條件下70℃孵化7天，用超純水清洗后常溫真空干燥30分鐘，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖14)。

實施例9

本實施例中，將實施例8的金片用硅片替換，其他步驟與實施例8相同，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖15)。

實施例10

本實施例中，將實施例8的金片用聚丙烯替換，其他步驟與實施例8相同，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖16)。

實施例11

本實施例中，將實施例8的金片用碳纖維替換，其他步驟與實施例8相同，得到hap@ptl涂層雜化材料(見圖17)。

為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人對實施例1制備的hap@ptl涂層雜化材料進行了機械性能和生物學評價，具體試驗如下：

1、機械性能測試

使用布魯克公司的umt-5摩擦試驗機在不同摩擦環(huán)境下測試hap@ptl涂層雜化材料、表面旋涂有hap的鈦片的摩擦損傷，所用載荷f＝10n-25n，等效于實際的骨接觸壓力是0.25-0.8mpa；主軸轉(zhuǎn)速：70r/min，實驗溫度：t＝36.5℃；測試環(huán)境：干摩擦和模擬體液sbf。采用磨損率比較材料的磨損程度，其中磨損率定義為單位行程的磨損體積，其計算公式如下所示：

式中w(mm³/m)為涂層體積磨損率，s(m)為磨損行程，m(mg)為磨損質(zhì)量，ρ為涂層的密度，ρ＝3.16mg/mm³。由圖18可見，不論是在干摩擦下還是sbf潤滑的條件下，在hap@ptl涂層雜化材料的磨損率比表面旋涂有hap的鈦片都降低了約10倍。說明在兩種摩擦條件下，hap@ptl涂層雜化材料的耐磨性能明顯提高。

2、生物學評價

(1)cck-8測試

將hap@ptl涂層雜化材料、ptl、空白鈦片依次進行紫外線照射和體積分數(shù)為70％的乙醇水溶液浸泡2小時滅菌，隨后用ph＝7.4的pbs緩沖溶液反復沖洗，去除表面殘留的乙醇。將滅菌后的樣品置于24孔培養(yǎng)板中，在骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)24小時，然后將骨髓間充質(zhì)干細胞以1×10⁴個/cm²的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％co2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用dmem培養(yǎng)液作為對照，每兩天換一次培養(yǎng)液。在培養(yǎng)1、3、5、7天時，分別在24孔板的各孔中加入100μl新的dmem培養(yǎng)液和10μlcck-8溶液，然后在37℃、5％co2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時。之后輕輕吸出培養(yǎng)液，振蕩均勻后，直接用分光光度法在酶標儀上(bio-rad680，美國)測定490nm處培養(yǎng)液的吸光度。所有的樣品重復測定3次，結(jié)果取平均值。由圖19可見，培養(yǎng)1天后，三種材料上的細胞光密度值沒有明顯變化，并且三種材料之間的od值也沒有顯著差異。隨著培養(yǎng)時間延長，三種材料上的細胞密度值也不斷增加，在第3天，三種材料之間的增殖能力也沒有顯著性差異，但在第5天和第7天，雖然三種材料表面的細胞光密度值對比于第1天都有很顯著的提高，但是其中hap@ptl涂層雜化材料表面的細胞光密度值明顯高于空白鈦片的細胞od值。說明相轉(zhuǎn)變?nèi)芫副砻嬲T導礦化的羥基磷灰石涂層對細胞增殖起著決定性作用。

(2)堿性磷酸酶測

用0.25％胰蛋白酶液將骨髓間充質(zhì)干細胞從培養(yǎng)基上消化，離心分離，去除上清液，加入dmem培養(yǎng)液。骨髓間充質(zhì)干細胞以1×10⁵個/cm²的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，將上述試驗(1)中滅菌后的樣品放入96孔板中加入500μldmem培養(yǎng)液，在37℃、5％co2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)液。當樣品在成骨誘導培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)第3、7、14、21天時，將樣品分別從培養(yǎng)板中取出，用ph＝7.4的pbs緩沖液清洗三次后，加入200μl細胞裂解液(10mmtris-hcl，2mmnacl和1％tritonx-100，ph7.5)，4℃裂解12小時。然后分別從每個孔板中收集30μl上清液加入到ph＝10的硼酸鹽緩沖液中，之后加入50μlpnpp溶液，37℃水浴加熱反應15分鐘后，加入150μl0.1mol/lnaoh水溶液終止反應。隨即用紫外-可見光分光光度計測定520nm處的吸光值。使用bca試劑盒歸一化堿性磷酸酶(alp)的活性。所有的樣品重復測定3次，結(jié)果取平均值。由圖20可見，骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)定向誘導后，三種材料表面上骨髓間充質(zhì)干細胞的alp活性隨著時間的延長都在不斷的增加。培養(yǎng)7天和14天后，hap@ptl涂層雜化材料表面的細胞alp活性均顯著地高于ptl和空白鈦片的alp活性，顯著性差異明顯(p<0.05)。說明本發(fā)明基于相轉(zhuǎn)變?nèi)芫笧槟０逭T導礦化的羥基磷灰石涂層有利于成骨細胞和其前體細胞的黏附、增殖和分化，alp活性表達也顯著增高。

(3)細胞形態(tài)的觀察

分別在上述試驗(1)中滅菌后的hap@ptl涂層雜化材料表面培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，接種密度為5000個/cm²。在檢測細胞伸展和粘附時，采用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽對細胞骨架進行染色，采用hochest33258對細胞核進行染色，然后采用激光共聚焦顯微鏡觀察培養(yǎng)5天后的細胞在樣品表面的粘附和伸展情況。由圖21可見，hap@ptl涂層雜化材料表面的骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量明顯增多，且細胞的絲狀偽足也有明顯增多，并且骨髓間充質(zhì)干細胞之間相互連成片狀。說明hap@ptl涂層雜化材料可以更好的支持骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)，且細胞相容性良好，更能促進成骨細胞的增殖分化。

(4)hap@ptl涂層雜化材料的皮下植入

將滅菌后的hap@ptl涂層雜化材料在骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天后移植于大鼠的背部皮下植入?yún)^(qū)，植入8周后，將連有周圍組織的樣品取出，并浸泡在4％的福爾馬林溶液中過夜。最后，用組織切片機將取出的組織樣品進行硬組織切片。將硬組織切片進行甲苯胺藍染色、蘇木精-伊紅染色后，于光學顯微鏡下進行觀察并拍照。由圖22～23可見，皮下植入8周后，hap@ptl涂層雜化材料呈現(xiàn)出良好的組織再生能力。并且，hap@ptl涂層雜化材料在宿主邊緣處有大量的新骨以及纖維組織形成，且新骨與宿主骨形態(tài)相相近。結(jié)合兩種染色發(fā)現(xiàn)，植入hap@ptl涂層雜化材料有明顯的新生骨質(zhì)染色，表明術后8周骨組織中的膠原成熟程度以及新生骨的能力有顯著地提高。說明hap@ptl涂層雜化材料能很好的促進成骨細胞增殖分化，并進一步實現(xiàn)骨缺損的修復。