本發(fā)明涉及弓形蟲減毒活疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種用于預(yù)防弓形蟲感染的減毒活疫苗及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

弓形蟲病(toxoplasmosis)是由弓形蟲引起的一種人獸共患寄生蟲病。全球約有三分之一的人口受其感染。懷孕期間感染弓形蟲，弓形蟲可通過胎盤垂直傳播到胎兒繼而引起孕婦妊娠期流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒畸形、死產(chǎn)及阻礙幼兒的正常生長，嚴(yán)重的危害了人類的生育健康。弓形蟲可以感染幾乎所有的溫血動物、傳染性強(qiáng)、流行范圍大、宿主譜廣，該疾病在急性期尚可用藥物控制，一旦轉(zhuǎn)為慢性期，目前無藥可醫(yī)。研制弓形蟲疫苗迫在眉睫，利用疫苗防控該疾病最有效的方式。

目前，正在研究的弓形蟲疫苗的類型主要包括全蟲(滅)活疫苗、蟲體特異組分疫苗、亞單位疫苗、病毒等活載體疫苗和蛋白及dna疫苗等，其中重組亞單位疫苗或基因工程亞單位疫苗。該疫苗具有安全性高，穩(wěn)定性好，產(chǎn)量高，不會產(chǎn)生免疫病理反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已研制成功的該類疫苗，如以貓白血病病毒(felv)的gp70重組蛋白為抗原，以鋁膠和皂角苷(qs21)為佐劑制備的抗貓白血病病毒疫苗，已經(jīng)在美國和歐洲批準(zhǔn)上市銷售。在抗弓形蟲疫苗的研究中，重組蛋白疫苗的研究進(jìn)展也較為迅速，這些抗原具有一定的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且在抗弓形蟲感染試驗(yàn)中表現(xiàn)有一定的免疫保護(hù)力。dna疫苗可經(jīng)肌肉注射、皮內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射等多種途徑接種，方式多樣便于操作。當(dāng)接種dna疫苗后，重組質(zhì)粒直接被體細(xì)胞攝取并表達(dá)分泌出抗原蛋白，成為內(nèi)源性抗原，與mhcclassi類分子結(jié)合，形成抗原肽/mhci分子復(fù)合物，并遞呈至細(xì)胞表面，與特異性cd8+t淋巴細(xì)胞結(jié)合。但上述研究均沒有重大進(jìn)展，不能夠有效的防控弓形蟲病，在小鼠實(shí)驗(yàn)中僅僅能夠延長存活時間，不能達(dá)到保護(hù)作用。為了增強(qiáng)免疫效果，提高免疫保護(hù)率，減毒活疫苗作為弓形蟲疫苗將成為一個重要的研究方向。目前國際上僅有的能上市的弓形蟲減毒活疫苗是s48，但是它僅限于對當(dāng)?shù)氐纳窖蚝途d羊的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種用于預(yù)防弓形蟲感染的減毒活疫苗及其應(yīng)用，該減毒活疫苗對于弓形蟲急性感染、慢性感染及先天性感染均具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，不僅能夠預(yù)防弓形蟲的正常感染，同時能夠有效阻斷弓形蟲通過母嬰途徑進(jìn)行的垂直傳播，是具有巨大應(yīng)用價值的疫苗，可用于預(yù)防弓形蟲的慢性感染、急性感染已及先天性感染。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于預(yù)防弓形蟲感染的減毒活疫苗，為以pbs作為溶劑制成的弓形蟲弱毒蟲株rhδgra17速殖子混懸液。

上述用于預(yù)防弓形蟲感染的減毒活疫苗可應(yīng)用于急性弓形蟲感染的免疫保護(hù)。

上述用于預(yù)防弓形蟲感染的減毒活疫苗可應(yīng)用于先天性弓形蟲感染的免疫保護(hù)。

上述用于預(yù)防弓形蟲感染的減毒活疫苗可應(yīng)用于慢性弓形蟲感染的免疫保護(hù)。

本發(fā)明的有益效果在于：提供了一種用于預(yù)防弓形蟲感染的減毒活疫苗，確立了其免疫劑型，探明了該疫苗的免疫接種程序及接種量，通過動物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對于弓形蟲急性感染、慢性感染及先天性感染均具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，不僅能夠預(yù)防弓形蟲的正常感染，同時能夠有效阻斷弓形蟲通過母嬰途徑進(jìn)行的垂直傳播，是具有巨大應(yīng)用價值的疫苗，可用于預(yù)防弓形蟲的慢性感染、急性感染以及先天性感染。

附圖說明

圖1為rhδgra17弱毒疫苗免疫小鼠攻蟲后存活時間示意圖；

圖2a和圖2b分別為rhδgra17弱毒疫苗免疫小鼠攻20個pru包囊后存活時間及腦包囊數(shù)示意圖；

圖3為rhδgra17減毒活疫苗免疫小鼠igg抗體水平的變化示意圖，其中圖3a為免疫25天時igg及igg1和igg2的抗體水平示意圖，圖3b為免疫70天時igg、igg1和igg2的抗體水平示意圖；

圖4為免疫小鼠各種細(xì)胞因子的濃度示意圖，其中圖4a-圖4d分別為免疫小鼠ifn-γ、il-12、il-2、il-10的濃度示意圖。

圖5為免疫小鼠感染rh后腹水(圖5a、圖5c)及血清(圖5b、圖5d)中的th1型細(xì)胞因子(il-12(圖5a、b)和ifn-γ(圖5c、d))的表達(dá)水平示意圖；

圖6為免疫母鼠中腦包囊的數(shù)量示意圖；

圖7為懷孕期間免疫小鼠各種細(xì)胞因子的表達(dá)水平示意圖，其中圖7a-圖7d分別為懷孕期間免疫小鼠ifn-γ、il-12、il-2、il-10的表達(dá)水平示意圖。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，需要說明的是，以下實(shí)施例以本技術(shù)方案為前提，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的范圍并不限于本實(shí)施例。

一、減毒活疫苗的制備

將hff細(xì)胞接種25t的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入8ml10％fbs的dmem培養(yǎng)基，在37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全長滿之后，換成8ml2％fbs的dmem培養(yǎng)基加入100ulrhδgra17蟲株，37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至弓形蟲從細(xì)胞中逸出，收集從hff中剛剛逸出的rhδgra17速殖子將細(xì)胞懸液過3μm濾器除去細(xì)胞碎片，然后用無菌pbs調(diào)整速殖子的濃度為500個/200μl。

二、免疫接種小鼠

免疫前，將購買回來的昆明小鼠先飼養(yǎng)一周的時間來減少應(yīng)激反應(yīng)。將小鼠分為兩大組，一組為免疫組：每只小鼠腹腔注射免疫200μl(500個)rhδgra17速殖子；另一組為對照組：每只小鼠腹腔注射200μl無菌pbs。

三、免疫效果評價

3a)急性弓形蟲感染組：免疫后第70天，各取18只rhδgra17免疫組及空白對照組昆明鼠，分別腹腔注射1000個i型rh速殖子；1000個toxodb#9pys和tgc7速殖子，并攻蟲后每天觀察小鼠健康狀態(tài)，記錄小鼠死亡時間，攻蟲后35天后，將存活小鼠安樂致死。

3b)慢性弓形蟲感染組：免疫后第70天，各取20只rhδgra17免疫組及空白對照組昆明鼠，經(jīng)口感染10個ii型pru包囊，并攻蟲后每天觀察小鼠健康狀態(tài)，記錄小鼠死亡時間在攻蟲后35天后，將存活小鼠安樂致死，觀察其腦組織中的包囊數(shù)。

3c)先天性弓形蟲感染組：rhδgra17免疫組懷孕期間未感染弓形蟲；pbs注射組懷孕期間未感染弓形蟲；rhδgra17免疫組懷孕第12天經(jīng)口感染10個pru包囊；rhδgra17免疫組懷孕第18天腹腔注射200個rh速殖子；pbs免注射組懷孕第12天經(jīng)口感染10個pru包囊；pbs注射組組懷孕第18天腹腔注射200個rh速殖子。在攻蟲后每天觀察小鼠的健康狀態(tài)，記錄胎兒出生個數(shù)、胎兒體重及胎兒存活時間；除此之外，還要觀察ii型蟲株感染后，腦包囊在胎兒出生35天時的個數(shù)及腦包囊在孕鼠分娩30天時的個數(shù)。

四、不同組間抗體及細(xì)胞因子監(jiān)測：

4a)昆明小鼠免疫第28天和70天采集血清用于檢測血清中igg抗體及igg1、igg2a抗體亞類；

b)免疫后第70天，各取6只小鼠安樂致死，無菌摘取脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，用stag刺激脾淋巴細(xì)胞收集細(xì)胞上清用于il-4、il-12、il-10及ifn-γ的檢測；

4c)免疫后第70天各取3只小鼠感染1000個rh或pbs于感染后第7天收集血清及腹水用于細(xì)胞因子il-12及ifn-γ的檢測；

4d)在懷孕第18天時，取先天性弓形蟲感染組中的rhδgra17免疫組懷孕第12天經(jīng)口感染10個pru包囊、pbs免注射組懷孕第12天經(jīng)口感染10個pru包囊、pbs免注射組懷孕期間未感染弓形蟲的小鼠各5只，安樂致死，無菌摘取脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，用stag刺激脾淋巴細(xì)胞收集細(xì)胞上清用于il-4、il-12、il-10及ifn-γ的檢測。

本發(fā)明的有益效果將通過以下數(shù)據(jù)說明：

1)弓形蟲rh、pys及tgc7株急性感染試驗(yàn)

各試驗(yàn)組小鼠取6只小鼠，分別腹腔接種弓形蟲rh、pys及tgc7株速殖子10³個/只。攻蟲當(dāng)天記為0d，記錄小鼠的存活時間。結(jié)果如圖1所示，對照組小鼠無論攻rh、pys還是tgc7均在感染后10天內(nèi)死亡。而rhδgra17免疫組，無論攻10³個rh、pys及tgc7均不會死亡。死亡時間與對照組相比差異明顯(p＜0.05)。

2)弓形蟲ii型pru包囊慢性感染試驗(yàn)

在免疫后第70天，每組取10只小鼠經(jīng)口感染20個ii型pru蟲株的包囊記錄小鼠死亡時間。感染后第35天安樂處死存活的小鼠，取腦組織研磨勻漿，查看包囊數(shù)量。結(jié)果如圖2a、圖2b所示，空白對照經(jīng)口感染20個包囊后，僅有40％的小鼠活到了35天，而rhδgra17免疫小鼠全部活到了35天。在第35天檢查包囊顯示rhδgra17免疫組中小鼠腦包囊的數(shù)量較對照組明顯減少(p＜0.001)。

3)評價rhδgra17引起的免疫反應(yīng)

在免疫后第28天和第70天采集血清檢測抗弓形蟲igg含量及igg1、igg2a抗體結(jié)果如圖3a、圖3b所示在第28天rhδgra17免疫組中的igg與igg2a的含量顯著性高于空白對照組(p＜0.001)，而igg1的含量與空白對照組中的沒有明顯的差異(p＞0.05)；然而在免疫后第70天發(fā)現(xiàn)igg與igg2a的含量顯著性高于空白對照組(p＜0.001)，igg1的含量則升高且明顯的高于對照組(p＜0.001)。說明在第免疫rhδgra17在28天時誘導(dǎo)小鼠機(jī)體只產(chǎn)生了th1型免疫反應(yīng)，而在第70天時誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了混合的th1型th2型免疫反應(yīng)。

通過檢測免疫后第70天脾淋巴細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子含量發(fā)現(xiàn)如圖4a-圖4d所示。與對照組相比，rhδgra17免疫組待檢脾淋巴細(xì)胞上清中ifn-γ、il-2、il-10和il-12含量顯著性升高外(p＜0.001)，提示免疫rhδgra17弱毒疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

免疫后第70天，rhδgra17免疫組及免疫對照組腹腔攻1000個弓形蟲rh速殖子，另一組空白對照攻200μlpbs；攻蟲第7天后采集血清和腹水，檢測th1型細(xì)胞因子il-12和ifn-γ。結(jié)果如圖5a-圖5d所示：空白rh感染組中的il-12和ifn-γ含量明顯高于rhδgra17免疫rh感染組及空白pbs注射組。說明免疫rhδgra17弱毒疫苗可以降低感染rh所引起的過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。

4)弓形蟲先天性感染試驗(yàn)

免疫后第70天讓雌鼠與雄鼠交配懷孕，觀察免疫rhδgra17后對懷孕結(jié)果的影響。發(fā)現(xiàn)免疫rhδgra17后，基本不影響胎兒的數(shù)量、胎兒的體重計胎兒的存活率。說明rhδgra17可作為弱毒疫苗來抵抗孕期弓形蟲感染。

觀察小鼠免疫rhδgra17后在懷孕期間抵抗ii型pru包囊經(jīng)口感染的能力，母鼠在懷孕第12天經(jīng)口感染10個pru包囊。待母鼠分娩后分別在出生第1天和第35天觀察胎兒的個數(shù)及胎兒的體重及存活率。結(jié)果顯示：胎兒的個數(shù)、體重及存活率在rhδgra17免疫pru感染組與空白未攻pru組中基本一致沒有明顯的差異(p＞0.05)，而胎兒的個數(shù)、體重及存活率在空白pru感染組明顯的低于rhδgra17免疫pru感染組與空白未攻pru組(p＜0.05)。在35天時分析胎兒中腦包囊的個數(shù)發(fā)現(xiàn)rhδgra17免疫明顯的降低胎兒腦包囊中的個數(shù)并在一部分胎兒中沒有檢測到腦包囊。圖6顯示在母鼠分娩30天時對母鼠腦中的包囊技術(shù)發(fā)現(xiàn)，rhδgra17免疫母鼠中的腦包囊數(shù)明顯降低(p＜0.001)。

觀察小鼠免疫rhδgra17后在懷孕期間抵抗i型rh速殖子經(jīng)腹腔感染的能力，母鼠在懷孕第18天經(jīng)腹腔注射感染200個rh速殖子。待母鼠分娩后分別在出生第1天和第5天觀察胎兒的個數(shù)及胎兒的體重及存活率。結(jié)果所示：胎兒的個數(shù)、體重及存活率在rhδgra17免疫rh感染組與空白未攻rh組中基本一致沒有明顯的差異(p＞0.05)，而胎兒的個數(shù)、體重及存活率在空白rh感染組明顯的低于rhδgra17免疫rh感染組與空白未攻rh組(p＜0.05)。對母鼠觀察發(fā)現(xiàn)空白rh感染組中的母鼠在分娩第5天出現(xiàn)嚴(yán)重的弓形蟲病癥狀，而rhδgra17免疫組中的母鼠沒有明顯的臨床癥狀。結(jié)果說明rhδgra17可作為弱毒疫苗來抵抗孕期i型rh和ii型pru弓形蟲感染。

5)評價rhδgra17在懷孕期間引起的免疫反應(yīng)

在母鼠懷孕第12天經(jīng)口感染10個pru包囊，在感染后的第6天摘取脾臟，收集stag刺激的脾淋巴細(xì)胞上清檢測細(xì)胞因子。如圖7a-圖7d所示：il-2、il-10、il-12及ifn-γ在rhδgra17免疫pru感染組中的含量顯著性的高于其在空白pru感染組及空白pru未感染組中的含量(p＜0.01)。說明免疫rhδgra17在懷孕期間中引起的免疫反應(yīng)與懷孕前的免疫反應(yīng)基本一致。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可以根據(jù)以上的技術(shù)方案和構(gòu)思，給出各種相應(yīng)的改變和變形，而所有的這些改變和變形，都應(yīng)該包括在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。