本申請為專利申請201310298737.1的分案申請，原案發(fā)明名稱為“一種禽流感疫苗組合物及其制備方法和應用”。

本發(fā)明涉及獸用生物制品，特別是涉及一種禽流感疫苗及其在預防和/或治療不同亞型禽流感病毒的藥物中的應用。

背景技術：

禽流感(avianinfluenza，ai)是禽流行性感冒的簡稱，由禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)引起的多種禽類感染的急性呼吸道傳染病，也能感染人類，被國際獸醫(yī)局(oie)和我國《家畜家禽防疫條例》列為a類烈性傳染病。

流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，含有囊膜、為多形態(tài)的負鏈rna病毒。根據(jù)流感病毒內(nèi)部核蛋白(nucleoprotein，np)和基質(zhì)蛋白(matrixprotein，mp)抗原及其基因特性的不同，可將流感病毒分為甲(a)、乙(b)、丙(c)三種類型，其中，能夠引起大流行的流感病毒主要是甲型。禽流感病毒即為甲型流感病毒，其基因組共由8個單獨的負鏈rna片段組成，由片段1至片段8依次為pb1、pb2、pa、ha、np、na、m、ns。

根據(jù)位于禽流感病毒囊膜上的血凝素ha(hemagglutinins，由禽流感基因組的第4個片段編碼)和神經(jīng)氨酸酶na(neuraminidase，由禽流感基因組的第6個片段編碼)抗原性的不同，禽流感病毒可分為若干個亞型，目前已知的ha有16個亞型(h1-h16)、na有9個亞型(n1-n9)，這兩種不同的亞型之間可以進行自由組配，從而形成一個龐大而復雜的禽流感病毒家族。正是由于流感病毒基因組自身的特點決定了其不斷發(fā)生抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，從而使得新的流行毒株不斷出現(xiàn)。目前，世界上的許多國家和地區(qū)都對該病進行過相關報道，常見的且能感染人的高致病性禽流感病毒以h5n1、h7n7、h9n2為代表，以快速爆發(fā)和高死亡率為主要臨床特征，常常導致飼養(yǎng)的雞群全部死亡；這一事件也表明家禽是人畜傳播潛在的中間宿主。特別地，近期發(fā)生的禽流感h7n9疫情，不僅使感染的人類出現(xiàn)高死亡現(xiàn)象，而且?guī)韾盒缘倪B鎖反應，使家禽業(yè)這一整個產(chǎn)業(yè)都遭遇重大的危機，給人類和家禽的預防、控制流感疫情帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。

截止到目前，接種疫苗仍然是預防和控制禽流感病毒大流行的最有效手段。由于禽流感病毒的變異速度遠遠大于變異株相應疫苗的制備速度，尤其是ha和na抗原性的變異頻率較高，而且不同亞型之間幾乎上不產(chǎn)生交叉免疫保護。如果禽流感疫苗的生產(chǎn)隨著病毒的變異而不斷更新，那么針對流感病毒流行株相應疫苗的生產(chǎn)周期較長、生產(chǎn)成本較高，造成人力、物力的浪費，還可能達不到預想的防控效果。因而，制備通用流感疫苗已博得世界各國科學家和疫苗生產(chǎn)公司的青睞，所謂的通用流感疫苗是指一種能夠預防所有流感病毒毒株，并可誘導持久性保護性免疫的流感疫苗。

由禽流感病毒基因組第7片段編碼的m蛋白(matrixproteins)為基質(zhì)蛋白，其基因含有兩個開放的閱讀框(orf)，可轉(zhuǎn)錄出兩個rna分子，分別翻譯出兩種基質(zhì)蛋白m1和m2。其中，基質(zhì)蛋白m2是禽流感病毒蛋白中除ha、na外的第三種跨膜蛋白，由三個區(qū)域(即n端24個氨基酸殘基組成的胞外域、19個氨基酸組成的跨膜區(qū)、54個氨基酸殘基組成的胞漿尾)組成，不含糖基，具有高度保守性。特別地，m2胞外部分的n端24氨基酸肽段(即m2e)在所測得的禽流感和人流感病毒中，其基因序列幾乎完全相同。這表明以m2蛋白作為抗原的主要成分，可對不同亞型的禽流感病毒產(chǎn)生保護性免疫，是研究交叉保護性流感疫苗的理想候選抗原。另外，現(xiàn)有的研究結(jié)果還表明：m2蛋白的功能主要包括兩點，(1)在流感病毒表面血凝素糖蛋白的合成過程中，m2蛋白作為質(zhì)子通道控制高爾基體跨膜轉(zhuǎn)移通道的ph值，從而導致ha的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；(2)在病毒脫殼時，m2蛋白可酸化病毒粒子形成病毒包涵體顆粒的內(nèi)部環(huán)境，引起細胞質(zhì)內(nèi)的ha和m1、m1和rnps之間或者rnps蛋白自身解聚。

技術實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種新型的禽流感疫苗，該疫苗既能對不同亞型禽流感病毒產(chǎn)生交叉保護性免疫，又能在減少免疫劑量的條件下達到明顯的免疫效果，還能延長疫苗的免疫保護時間。

本發(fā)明的主要目的在于提供一種禽流感疫苗組合物，所述的禽流感疫苗組合物包括脂質(zhì)體、免疫量的m2和/或3m2e蛋白；所述m2蛋白的序列為seqidno.2，所述3m2e蛋白的序列為seqidno.4。

本發(fā)明所述的m2蛋白基因的核苷酸序列可以為seqidno.1。

本發(fā)明所述的3m2e蛋白基因的核苷酸序列可以為seqidno.3，其中，所述的3m2e是指將m2蛋白膜外部分n端的24個氨基酸肽段m2e串聯(lián)成三拷貝的形式。

優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體膜材包括磷脂、固醇類；更優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體的膜材包括卵磷脂、豆磷脂、腦磷脂、磷脂酰乙醇胺、膽固醇、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇乙酰、牛膽酸鈉、蛋磷脂酰膽堿、磷脂酰絲胺酸、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鯨蠟磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、硬質(zhì)酰胺、二氧乙烯十六烷基醚、四氧乙烯十二烷基醚中的一種或幾種。

脂質(zhì)體的膜材主要由磷脂與膽固醇構(gòu)成，這兩種成分不但是形成脂質(zhì)體雙分子層的基礎物質(zhì)，而且本身也具有極為重要的生理功能。其中，磷脂類包括天然磷脂和合成磷脂二類，磷脂的結(jié)構(gòu)特點為一個磷酸基和一個季銨鹽基組成的親水性基團，以及由兩個較長的羥基組成的親脂性基團；膽固醇是兩親性物質(zhì)，與磷脂混合使用，可以調(diào)節(jié)雙分子層的流動性、減低脂質(zhì)體膜的通透性等。由它們所形成的“人工生物膜”易被機體消化分解，不像合成微囊(如尼龍微型膠囊)那樣往往在機體中難以排除。

優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體是中性脂質(zhì)體、負電性脂質(zhì)體或正電性脂質(zhì)體；更優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體為正電性脂質(zhì)體。

優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體將m2和/或3m2e包裹于脂質(zhì)體內(nèi)或鑲嵌于脂質(zhì)體膜中或由于電荷作用而吸附于膜上。

優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體為小單室、大單室和多室脂質(zhì)體共存的脂質(zhì)體。

優(yōu)選地，所述的流感疫苗單位劑量中含流感病毒m2和/或3m2e蛋白組分的含量為40-500μg，優(yōu)選為50-100μg。

本發(fā)明所述的脂質(zhì)體是一種生物膜雙分子層囊性微球，由水相中脂質(zhì)雙層疏水區(qū)的脂肪鏈通過疏水鍵相互聚集自行收縮排列而形成。

本發(fā)明所述的流感疫苗在脂質(zhì)體的作用下，可在注射部位形成抗原庫，使抗原緩慢釋放，引起注射部位的炎性反應，增加細胞的穿透能力，提高注射部位的抗原遞呈細胞濃度，使抗原易被抗原遞呈細胞吞噬，并誘導產(chǎn)生細胞因子如il-2、il-4、il-6、il-12、tnf-α、ifn-α、il-10、ifn-γ等；而且由于巨噬細胞攝取脂質(zhì)體后破壞其膜結(jié)構(gòu)，以及補體依賴的脂質(zhì)體免疫溶解作用，產(chǎn)生抗原釋放并形成免疫復合物，而經(jīng)后者又能使其維持長期的效價抗體及產(chǎn)生免疫記憶所致。在脂質(zhì)體膜的保護下，抗原分子可以不受體液成分的破壞，脂質(zhì)體類疫苗可用于多種黏膜途徑的免疫接種。更重要地，脂質(zhì)體還是理想的免疫佐劑，能同時激活機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，通過誘導抗原遞呈細胞產(chǎn)生協(xié)同刺激因子，增加主要組織相容性抗原的表達，使抗原遞呈成熟，增強抗原的遞呈作用。

總而言之，脂質(zhì)體是用作疫苗的傳遞載體和免疫佐劑的良好選擇。

優(yōu)選地，所述的禽流感疫苗組合物進一步包括免疫調(diào)節(jié)組分，所述免疫調(diào)節(jié)組分優(yōu)選維生素e。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述的禽流感疫苗組合物的方法，所述制備方法包括：

(1)將m2、3m2e蛋白分別用含穩(wěn)定劑的緩沖液制備成禽流感抗原原液；

(2)將脂質(zhì)體原料溶于有機溶劑中，將所述脂質(zhì)體溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜；在膜材中加入所述緩沖液，并加入幾粒小玻璃珠，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待薄膜從瓶壁上完全脫落后，靜置得空脂質(zhì)體；

(3)將所述禽流感抗原原液加入制得的空脂質(zhì)體中，用高壓勻漿機高壓均質(zhì)循環(huán)脂質(zhì)體顆粒，除菌過濾，即成所述禽流感疫苗組合物。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中的所述穩(wěn)定劑為氨基酸、單糖、二糖、多元醇中的一種或幾種；所述步驟(2)中的所述有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一種或幾種；所述步驟(2)中所述膜材的終濃度為1％-5％(w/w)，優(yōu)選為2％(w/w)；所述步驟(2)中所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為30-65℃,所述高壓壓力為15-30kpa；所述步驟(1)、(2)中的所述緩沖液為ph值為5.4-7.8范圍內(nèi)的磷酸鹽緩沖液、tris-hcl緩沖液、碳酸鈉緩沖液、生理鹽水中的一種或幾種。

本發(fā)明所述禽流感疫苗組合物制備方法，還包括薄膜法與冷凍干燥法相結(jié)合法、逆相蒸發(fā)法與冷凍干燥法結(jié)合、薄膜分散法、冷凍干燥法、注入法、加壓擠出法、熔融法、復乳法、凍融法、表面活性劑處理法、前脂質(zhì)體法、空白前脂質(zhì)體法、ph及醋酸梯度法等。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述的禽流感疫苗在制備預防和/或治療不同亞型禽流感的藥物中的應用。

本發(fā)明提供了所述的m2或3m2e蛋白以及流感疫苗在制備預防和/或治療不同亞型禽流感的藥物中的應用。

本發(fā)明所述的流感疫苗在制備用于保護動物免患不同亞型禽流感所引起的疾病的疫苗中的應用時，所用流感疫苗的免疫量為0.3ml/羽。所述流感疫苗在給予免疫動物時，可以通過腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服途徑、靜脈注射或鼻內(nèi)途徑，優(yōu)選為通過皮下注射或肌肉注射。

基于此，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：

(1)本發(fā)明所述的流感疫苗具有廣譜性，能抗多種型或亞型的禽流感病毒，免疫動物后可誘導動物產(chǎn)生抗多種亞型禽流感病毒的抗體；

(2)本發(fā)明所述的流感疫苗具有持久性，在脂質(zhì)體的作用下具有緩慢釋放抗原的效能，給予動物免疫后可使機體延緩腎排泄和代謝，從而延長作用時間。

(3)本發(fā)明所述的禽流感疫苗利用脂質(zhì)體所具有的生物膜雙分子層形成的囊泡微球?qū)⒘鞲幸呙缢乖闹饕M分m2和/或3m2e蛋白進行包含。該疫苗在脂質(zhì)體的作用下，能將包含的抗原高效、靶向地載給抗原遞呈細胞，能同時刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，具有廣譜性和持久性，且可被機體降解無毒副作用，該疫苗有利于大規(guī)模生產(chǎn)。

序列表中：

序列1為m2核苷酸序列；

序列2為m2氨基酸序列；

序列3為3m2e核苷酸序列；

序列4為3m2e氨基酸序列。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

本實施例中所用的“免疫量”是指提供針對流感疫苗的免疫劑量，主要取決于以下因素：被免疫動物的物種、品種、年齡、重量大小、健康狀態(tài)以及動物之前是否接受過對抗同樣病毒的疫苗。

本實施例中所用的免疫調(diào)節(jié)組分優(yōu)選為維生素e(ve)。

本實施例中所用的穩(wěn)定劑優(yōu)選為海藻糖。

本實施例中所用的h9亞型禽流感病毒分離株包含禽流感病毒h9亞型sz株(aivaninfluenzavirush9subtypestrainsz)，其保藏編號為：cctccno:v201240，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學)，保藏日期：2012年9月16日。

下述實施例中所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1人工合成m2、3m2e蛋白

根據(jù)ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)報道的a/duck/hongkong/y439/97(h9n2，登錄號：af156462)中m2、m2e蛋白基因的核苷酸序列(詳見序列表seqidno.1和seqidno.3)，經(jīng)人工分別合成m2、3m2e蛋白的氨基酸多肽序列(詳見序列表seqidno.2和seqidno.4)，所合成多肽序列經(jīng)高效液相色譜純化，分別得到純化后的m2、3m2e蛋白。然后，將m2、3m2e蛋白分別用含1％海藻糖的生理鹽水制備成1mg/ml的儲備液。

實施例2流感疫苗的制備

本發(fā)明所述的流感疫苗的制備方法之薄膜法與冷凍干燥法相結(jié)合，包括以下操作步驟：

(1)將大豆卵磷脂m1、膽固醇m2、維生素e(ve)m3按表1的量混合溶于v1三氯甲烷中，將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的茄型瓶中，45℃水浴作為蒸發(fā)溫度，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜。

(2)按膜材終濃度為2％(w/w)加生理鹽水v2，加入幾粒小玻璃珠，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待薄膜從瓶壁上完全脫落后，靜置約25min，使瓶中液體呈乳白色懸濁液。

(3)將不同濃度和體積的禽流感抗原液(含1％海藻糖)v3加入制得的空脂質(zhì)體中，用高壓勻漿機在15-30kpa的高壓下均質(zhì)循環(huán)脂質(zhì)體顆粒5次，除菌過濾后即為所制備的流感疫苗，單位劑量中含流感病毒m2和/或3m2e蛋白組分的含量分別為500、80、80、40μg(詳情見表1)。并對制得的流感疫苗進行適當?shù)南♂專箚挝粍┝克鞲胁《緈2和/或3m2e蛋白組分的含量均為40μg，滅菌后進行分裝，5ml/瓶。

表1不同膜材和抗原液制備出的流感疫苗

附：抗原液160μg/ml為抗原儲備液稀釋6.25×所得，抗原液80μg/ml為抗原液160μg/ml稀釋2×所得。

同時制備不含禽流感抗原組分的空白脂質(zhì)體，作為陰性對照。

實施例3動物實驗

選用3周齡spf雞120只，隨機分成6組，20只/組，分別經(jīng)皮下注射自制的流感疫苗、空白脂質(zhì)體、生理鹽水(作為空白對照)，注射劑量0.3ml/羽。

于免疫后的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第90天，分別采集并分離各試驗組的血清。同時，以間接elisa法檢測血清抗m2或m2e抗體效價，具體操作步驟為：將m2或m2e蛋白儲備溶液用生理鹽水稀釋至1μg/ml，包被96孔板，50μl/孔，4℃包被過夜；使用含5％脫脂奶粉的封閉液進行封閉；洗滌后，加入待檢的稀釋血清，50μl/孔，37℃反應2h；洗滌后，加入酶標二抗，50μl/孔，37℃孵育2h；然后，加入底物進行顯色，使用酶標儀讀取吸光光度值，檢測結(jié)果如表2所示。

表2不同時間段各試驗組elisa抗體效價的檢測結(jié)果匯總

由表2可知：不同抗原含量的流感疫苗免疫后的抗體滴度均于免疫后15天開始上升，并于第30天達到最大值，即流感疫苗1、2、4均達到1:2048，流感疫苗3的最高，高達1:4096；且持續(xù)至第60天左右，而空白脂質(zhì)體對照組和生理鹽水空白對照組均未產(chǎn)生特異性抗體。

實施例4攻毒保護實驗

免疫后第90天，將每個免疫組和對照組的20只隨機分成10只/亞組。每個免疫亞組和對照亞組分別用禽流感sz株(cctccno:v201240)及hl株(見文獻：禽流感病毒(h9n2亞型，hl株)與國內(nèi)部分省禽流感病毒(h9亞型)流行株相關性及交互免疫的研究，2007年畜牧獸醫(yī)學會年會論文集，2007，35-38)進行攻毒。

其中，禽流感病毒sz株(avianinfluenzavirus(h9subtype)strainsz)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢·武漢大學，保藏日期為2012年9月16日，保藏編號為cctccno:v201240。

通過皮下注射攻毒，攻毒劑量為0.2ml/羽攻毒。攻毒后第5天，采集氣管與泄殖腔拭子，每個樣品分別接種于5枚10日齡的spf雞胚，37℃繼續(xù)孵育，每日照檢，死胚及時取出(24h內(nèi)死胚棄去)，并檢測雞胚液血凝價，至接種后5天，將剩余活胚全部凍死后，逐胚測定血凝價，以5枚雞胚中至少有1枚雞胚液血凝價≥1:16(微量法)判為感染。對病毒感染為陰性的雞胚，應盲傳1次，再測定血凝價，檢測結(jié)果詳見表3。

表3可知：免疫后第90天，不同抗原含量的流感疫苗各免疫亞組可完全抵抗h9亞型禽流感病毒sz株(cctccno:v201240)和hl株毒株的攻擊，可獲得完全保護；而空白脂質(zhì)體對照各亞組病毒分離率分別為80％和90％，生理鹽水空白對照各亞組病毒分離率分別為90％和100％。

表3各亞組攻毒后的病毒分離結(jié)果

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>普萊柯生物工程股份有限公司

<120>一種禽流感疫苗組合物及其制備方法和應用

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