本發(fā)明涉及一種利福昔明子宮注入劑及其制備方法與應用。
背景技術：
奶牛子宮內的炎癥炎主要有子宮炎、臨床型子宮內膜炎、亞臨床型子宮內膜炎、子宮蓄膿等幾種臨床癥狀類型，是我國奶牛產后常見的生殖系統(tǒng)疾病，不僅能夠影響奶牛的發(fā)情與妊娠，降低奶牛產奶量，誘發(fā)奶房炎等疾病，嚴重時還會造成奶牛繁殖能力的喪失，某些急性病牛還可引起敗血癥而導致死亡，嚴重阻礙我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，同時造成巨大的經濟損失。該類疾病主要由產后子宮中微生物感染而致，文獻報道臨床分離的主要病原菌包括：大腸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、非溶血性鏈球菌、溶血性鏈球菌、胎兒彎曲菌、綠膿桿菌和不動桿菌等。
奶牛子宮炎癥在臨床發(fā)病率35％左右，對奶牛生產性能影響很大。目前，子宮類炎癥的防治上，存在兩大問題急需解決：(1)考慮到牛奶的食品安全問題，要盡量選擇低殘留藥物治療，減少棄奶期時間；(2)臨床上多成革蘭氏陽性菌合并革蘭氏陰性菌等混合感染，單純使用頭孢類藥物的效果不顯著；因此，急需廣譜、高效、安全、低殘留的用于奶牛子宮類炎癥防治的子宮注入劑類產品。
利福昔明(rifaximin)屬利福霉素類衍生物，是首個非氨基糖苷類半合成抗菌藥。利福昔明的特點是抗菌譜廣、抗菌活性強，在腸道內易形成較高血藥濃度。對革蘭陽性需氧菌中的金黃色葡菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、艱難梭菌有高度抗菌活性；對革蘭陰性大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森菌及革蘭陽性厭氧菌也有很好的抗菌活性。利福昔明的抗菌譜和抗菌活性與利福平相似，其抗革蘭陽性菌的作用強于新霉素。
利福昔明具有局部給藥的獨特優(yōu)勢：具有口服不易吸收、安全、高效、低殘留、無休藥期等優(yōu)點。該藥物首先由意大利阿爾法韋士曼公司(alfawassermann)開發(fā)研制、是用于人醫(yī)臨床預防由腸道菌群引起的腸道感染和腹瀉及治療胃腸道外科手術感染的抗感染藥，1987和1998年分別在意大利和墨西哥上市，商品名為
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種利福昔明子宮注入劑及其制備方法，本發(fā)明所提供的利福昔明子宮注入劑對奶牛子宮炎癥(包括子宮炎、子宮內膜炎、子宮蓄膿等)具有顯著療效。
本發(fā)明所提供的利福昔明子宮注入劑，其由下述原輔料制成：利福昔明(原料藥)0.05～0.5g、單硬脂酸甘油酯0.125～1.25g、助懸劑0.125～1.25g、植物油加至25g。
進一步地，所述利福昔明子宮注入劑由下述原輔料制成：利福昔明0.1～0.5g、單硬脂酸甘油酯0.125～1.25g、助懸劑0.125～1.25g、植物油加至25g。
更進一步地，所述利福昔明子宮注入劑為下述1)-9)中的任一種：
1)由下述原輔料制成：
利福昔明0.1～0.2g、單硬脂酸甘油酯0.75～1.25g、助懸劑0.125～0.75g、植物油加至25g；
2)由下述原輔料制成：
利福昔明0.1～0.2g、單硬脂酸甘油酯0.125～0.75g、助懸劑0.75～1.25g、植物油加至25g；
3)由下述原輔料制成：
利福昔明0.1～0.1875g、單硬脂酸甘油酯0.25～0.75g、助懸劑0.25～0.75g、植物油加至25g；
4)由下述原輔料制成：
利福昔明0.1～0.5g、單硬脂酸甘油酯0.25～0.75g、助懸劑0.25～0.75g、植物油加至25g；
5)由下述原輔料制成：
利福昔明0.1g、單硬脂酸甘油酯0.75g、助懸劑0.75g、植物油加至25g；
6)由下述原輔料制成：
利福昔明0.1875g、單硬脂酸甘油酯0.25g、助懸劑0.25g、植物油加至25g；
7)由下述原輔料制成：
利福昔明0.2g、單硬脂酸甘油酯1.25g、助懸劑0.125g、植物油加至25g；
8)由下述原輔料制成：
利福昔明0.2g、單硬脂酸甘油酯0.125g、助懸劑1.25g、植物油加至25g；
9)由下述原輔料制成：
利福昔明0.5g、單硬脂酸甘油酯0.25g、助懸劑0.25g、植物油加至25g。
所述利福昔明子宮注入劑中，所述植物油選自下述至少一種：大豆油、茶油、玉米油、花生油和棉籽油，優(yōu)選大豆油。
所述利福昔明子宮注入劑中，所述助懸劑選自下述至少一種：吐溫80、司盤80和大豆磷脂，優(yōu)選司盤80。
所述利福昔明子宮注入劑中，所述利福昔明原料藥的粒徑為5～10μm。
本發(fā)明所述利福昔明子宮注入劑的性狀為橙紅色至暗紅色油狀混懸液。
本發(fā)明所述利福昔明子宮注入劑可按照如下步驟制備：由所述植物油、所述單硬脂酸甘油酯和所述助懸劑制成高分子化合物溶劑體系，再將所述利福昔明的無菌微粉加入，持續(xù)攪拌研磨制成利福昔明子宮注入劑。
具體可包括如下步驟：
1)將部分量的所述植物油和所述單硬脂酸甘油酯混合后，加熱熔化，得到混合體系；
2)向所述混合體系中加入所述助懸劑、所述利福昔明和剩余量的所述植物油，研磨均勻，即得所述利福昔明子宮注入劑。
上述制備方法中，步驟1)中，所述加熱的條件為：60～80℃加溫15～30分鐘；
所述植物油的用量為所述植物油總量的40％～60％。
上述制備方法中，步驟2)中，所述研磨在膠體磨中進行；
步驟2)之后所述方法還包括過濾及加熱滅菌的預處理步驟；
所述加熱滅菌的條件為：150～160℃滅菌2～3小時。
本發(fā)明所提供的利福昔明子宮注入劑對奶牛子宮炎癥(包括子宮炎、子宮內膜炎、子宮蓄膿等)具有顯著療效。
本發(fā)明利福昔明子宮注入劑臨床用于治療奶牛子宮炎的用量為：1支/次。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
(1)給藥方便快捷，減少了大量的人力物力，動物應激反應小，減少動物體的損傷；
(2)局部用藥，黏膜吸收較差，藥物不會進入乳汁，使用藥物后，奶牛的牛奶中無藥物殘留；
(3)臨床上混合感染情況多，與常用的頭孢類子宮注入劑相比，抗菌譜更廣，更具有臨床實用價值；
(4)生產工藝簡單，得到的制劑均勻、分散性、穩(wěn)定性好，易于擴大化生產；
(5)本發(fā)明制劑相對于注射液而言，藥物釋放緩速，生物利用度高，對局部組織刺激性低，臨床療效顯著，具有極高的推廣價值。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
本發(fā)明提供的利福昔明子宮注入劑是一種分布均勻的制劑，具體制備方法包括以下步驟：
a.將植物油(如中性大豆油)經過濾和加熱滅菌之后放冷；
b.取適量經預處理的植物油，加入0.125～1.25g的單硬脂酸甘油酯；
c.60～80℃加溫15～30分鐘，待硬脂酸甘油酯融化，攪拌均勻后，冷卻至40℃左右，加入0.125～1.25g的助懸劑(如司盤80)、0.05～0.5g的利福昔明(粒徑5～10μm)，再補加植物油至總量為25g；
d.研磨均勻，制得利福昔明子宮注入劑；
f.將藥裝入推注管中，密封，滅菌，燈檢，包裝。
下述實施例中對子宮注入劑的沉降體積比的檢測方法：用具塞量筒取供試品50ml，密塞，用力振搖1分鐘，記下混懸液的開始高度h0，靜置3小時，記下混懸物的最終高度h，按下式計算，結果如下：沉降比體積f＝h/h0，不低于0.20即合格。
無菌檢驗的方法：
取本品10支，置滅菌的分液漏斗中，加0.1％無菌蛋白胨溶液100ml，用無菌十四烷酸異丙酯洗滌4次，每次200ml，充分振搖，取水層用薄膜過濾法處理，用無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(ph7.0)為沖洗液，每次沖洗量為100ml，沖洗3次，依法檢查(附錄137頁)，應符合規(guī)定。
實施例1、利福昔明子宮注入劑的處方篩選
1、組方中單硬脂酸甘油酯含量的篩選(注：表中單硬脂酸甘油酯簡稱甘油酯)
表1
制備方法如下：
1)將利福昔明無菌粉經超微粉碎得到利福昔明無菌微粉(粒徑5～10μm)；
2)將大豆油經過濾和加熱滅菌(150℃滅菌3小時)后，置于室溫下備用；
3)取適量經預處理的大豆油，加入硬脂酸甘油酯以及助懸劑司盤80；加熱并攪拌(80℃加溫15分鐘)，待硬脂酸甘油酯融化之后，加入利福昔明；
5)在無菌膠體磨中研磨均勻，制得利福昔明子宮注入劑。
由表1結果可知，當單硬脂酸甘油酯的含量為0.3％(w/w，g/g)時，產品的沉降指標達不到質量標準的要求；當單硬脂酸甘油酯的含量為0.5～5.0％(w/w，g/g)時，產品的各項指標達完全符合質量標準的要求，因此確定處方中單硬脂酸甘油酯的含量為0.5～5.0％(w/w，g/g)。
2、組方中司盤-80含量的篩選
表2
制備方法同上。
由表2所示的結果可知，當司盤-80的含量為0.3％(w/w，g/g)時，產品的沉降指標達不到質量標準的要求；當司盤-80的質量含量為0.5～5.0％(w/w，g/g)時，產品的各項指標達完全符合質量標準的要求，因此確定處方中司盤-80含量為0.5～5.0％(w/w，g/g)。
實施例2、制備利福昔明子宮注入劑
制備方法如下：
1)將利福昔明無菌粉經超微粉碎得到粒徑5～10μm的利福昔明無菌微粉；
2)將大豆油經過濾和加熱滅菌(150℃滅菌3小時)后，置于室溫下備用；
3)取適量經預處理的大豆油(為大豆油總用量的40％％)，加入單硬脂酸甘油酯；加熱并攪拌(80℃加溫15分鐘)，待單硬脂酸甘油酯融化，攪拌均勻后，冷卻至40℃，加入司盤80、利福昔明，再加大豆油至全量；
4)在無菌膠體磨中研磨均勻，制得利福昔明子宮注入劑。
所得利福昔明子宮注入劑的性狀為橙紅色至暗紅色油狀混懸液。
對上述產品進行沉降體積比及無菌檢測，其均符合子宮注入劑的質量標準。
實施例3、制備利福昔明子宮注入劑
制備方法如下：
1)將利福昔明無菌粉經超微粉碎得到粒徑5～10μm的利福昔明無菌微粉；
2)將大豆油經過濾和加熱滅菌(150℃滅菌3小時)后，置于室溫下備用；
3)取適量經預處理的大豆油(為大豆油總用量的50％)，加入單硬脂酸甘油酯；加熱并攪拌(80℃加溫15分鐘)，待單硬脂酸甘油酯融化，攪拌均勻后，冷卻至40℃，加入司盤80、利福昔明，再加大豆油至全量；
4)在無菌膠體磨中研磨均勻，制得利福昔明子宮注入劑。
所得利福昔明子宮注入劑的性狀為橙紅色至暗紅色油狀混懸液。
對上述產品進行沉降體積比及無菌檢測，其均符合子宮注入劑的質量標準。
實施例4、制備利福昔明子宮注入劑
制備方法如下：
1)將利福昔明無菌粉經超微粉碎得到粒徑5～10μm的利福昔明無菌微粉；
2)將茶油經過濾和加熱滅菌(160℃滅菌2小時)后，置于室溫下備用；
3)取適量經預處理的大豆油(為大豆油油總用量的60％)，加入單硬脂酸甘油酯；加熱并攪拌(60℃加溫30分鐘)，待單硬脂酸甘油酯融化，攪拌均勻后，冷卻至40℃，加入司盤80、利福昔明，再加大豆油至全量；
4)在無菌膠體磨中研磨均勻，制得利福昔明子宮注入劑。
所得利福昔明子宮注入劑的性狀為橙紅色至暗紅色油狀混懸液。
對上述產品進行沉降體積比及無菌檢測，其均符合子宮注入劑的質量標準。
實施例5、制備利福昔明子宮注入劑
制備方法如下：
1)將利福昔明無菌粉經超微粉碎得到粒徑5-10μm利福昔明無菌微粉；
2)將玉米油經過濾和加熱滅菌(150℃滅菌2小時)后，置于室溫下備用；
3)取適量經預處理的玉米油(為玉米油總用量的50％)，加入單硬脂酸甘油酯；加熱并攪拌(80℃加溫30分鐘)，待單硬脂酸甘油酯融化，攪拌均勻后，冷卻至40℃，加入吐溫-80、利福昔明，再加玉米油至全量；
4)在無菌膠體磨中研磨均勻，制得利福昔明子宮注入劑。
所得利福昔明子宮注入劑的性狀為橙紅色至暗紅色油狀混懸液。
對上述產品進行沉降體積比及無菌檢測，其均符合子宮注入劑的質量標準。
實施例6、制備利福昔明子宮注入劑
制備方法如下：
1)將利福昔明無菌粉經超微粉碎得到粒徑5-10μm利福昔明無菌微粉；
2)將棉籽油經過濾和加熱滅菌(150℃滅菌2小時)后，置于室溫下備用；
3)取適量經預處理的棉籽油(為棉籽油總用量的40％％)，加入單硬脂酸甘油酯；加熱并攪拌(80℃加溫15分鐘)，待單硬脂酸甘油酯融化，攪拌均勻后，冷卻至40℃，加入大豆磷脂、利福昔明，再加棉籽油至全量；
5)在無菌膠體磨中研磨均勻，制得利福昔明子宮注入劑。
所得利福昔明子宮注入劑的性狀為橙紅色至暗紅色油狀混懸液。
對上述產品進行沉降體積比及無菌檢測，其均符合子宮注入劑的質量標準。
實施例7、制備利福昔明子宮注入劑
制備方法如下：
1)將利福昔明無菌粉經超微粉碎得到粒徑5-10μm利福昔明無菌微粉；
2)將茶油經過濾和加熱滅菌(150℃滅菌2小時)后，置于室溫下備用；
3)取適量經預處理的茶油(為茶油總用量的60％)，加入單硬脂酸甘油酯；加熱并攪拌(80℃加溫15分鐘)，待單硬脂酸甘油酯融化，攪拌均勻后，冷卻至40℃，加入大豆磷脂、利福昔明，再加茶油至全量；
5)在無菌膠體磨中研磨均勻，制得利福昔明子宮注入劑。
所得利福昔明子宮注入劑的性狀為橙紅色至暗紅色油狀混懸液。
對上述產品進行沉降體積比及無菌檢測，其均符合子宮注入劑的質量標準。
實施例8、利福昔明子宮注入劑的體內效果試驗
1)利福昔明子宮注入劑對奶牛的安全性試驗
在規(guī)?；膛鲭S機選擇50頭產后無子宮(內膜)炎的健康奶牛，將實施例4制備的利福昔明子宮注入劑一支(25g：0.1875g)通過輸精導管緩緩注入子宮內。記錄奶牛標識、觀察時間、試驗日期和時間、每頭奶牛給藥前及最后一次給藥后1、3、5、7、10日的產奶量及體溫等參數(shù)。通過觸診觀察奶牛子宮及陰道分泌物情況等臨床癥狀。在給藥前0日，最后一次給藥后第10日，采集子宮內容物行細菌學檢查。主要分離大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、化膿棒狀桿菌。根據(jù)收集的上述數(shù)據(jù)及臨床檢查結果確定防治奶牛子宮(內膜)炎產品對靶動物的安全性。
結果顯示，在各時間點給藥后的產奶量及體溫等參數(shù)與給藥前未見明顯變化，奶牛子宮及陰道分泌物情況等臨床癥狀。在給藥前0日和給藥后第10日分別采集子宮分泌物并分離細菌，顯示給藥后細菌檢出數(shù)與給藥前相比降低。綜合以上結果表明，奶牛按照推薦劑量單次給予利福昔明子宮注入劑后，對奶牛無不良反應，該制劑具有較高的安全性。
2)利福昔明子宮注入劑在牛體內殘留消除試驗
奶牛入選標準為無子宮(內膜)炎及相關臨床癥狀的健康奶牛，奶牛在試驗前30天內未全身性或子宮內給予抗生素。實驗選擇20頭無子宮(內膜)炎及相關臨床癥狀的健康奶牛，試驗期間奶牛正常飼養(yǎng)。給藥前，先用生理鹽水清洗子宮，將圓頭塑料管插入子宮內，將實施例4制備的利福昔明子宮注入劑一支(25g:0.1875g)通過輸精導管注入子宮內，每頭牛一支。給藥前采集空白奶樣，每頭牛在最后一次給藥后6h、12h、18h、24h、36h、42h和48h采集混合奶樣40ml，置于-40℃條件下保存待測。注意擠奶時前三把奶不能舍棄。
奶樣經兩次乙腈提取后氮氣吹干，復溶后過hlb固相萃取小柱凈化，采用uplc-ms-ms法檢測奶中藥物濃度。結果顯示，經局部給藥以后，藥物通過血液殘留到牛奶中的含量很低，20頭奶牛在給藥后6h檢測濃度為1.25～6.54μg/kg，低于歐盟規(guī)定的牛奶中的最高殘留限量，而所有試驗動物12h以后均檢測不到藥物。因此，該制劑利福昔明子宮注入劑在按推薦劑量和推薦療程給藥后，牛奶的棄奶期為0天，類似的硫酸頭孢類子宮注入劑產品(其余輔料相同)棄奶期為48小時。
3)利福昔明子宮注入劑對奶牛子宮炎的藥效學試驗
在規(guī)?；膛鲭S機選擇40頭產后患子宮(內膜)炎的奶牛開展試驗，隨機分成4組，每組10頭。其中3個受試藥物組(i、ii、iii組)，分別給予高(2支/次)、中(1支/次)、低(1/2支/次)劑量的利福昔明子宮注入劑；1個藥物對照組(iv組)，給予氟苯尼考子宮注入劑1支。上述利福昔明子宮注入劑為實施例4制備的樣品，規(guī)格為25g：0.187g。
整個試驗期間對給藥奶牛進行詳細觀察，記錄試驗開始后給藥前、給藥后和停藥后各組奶牛臨床癥狀的表現(xiàn)以及癥狀的發(fā)生、發(fā)展、轉歸和消失情況，記錄用藥奶牛的體溫、產奶量以及紅、腫、熱、痛等臨床癥狀，對奶牛子宮進行直腸觸診，觀察有無腫脹等臨床癥狀。最后一次給藥后第14天，采集1次每頭牛子宮頸和陰道的黏液樣本，進行細菌分離培養(yǎng)(大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、化膿棒狀桿菌)。根據(jù)收集的上述數(shù)據(jù)及臨床檢查結果確定產品的有效性。
表3各試驗組奶牛用藥前后主要病原菌的分離鑒定結果統(tǒng)計
根據(jù)試驗結果，可得以下結論：
(1)細菌清除率：經過受試藥物和對照藥物給藥后，各實驗組奶牛給藥前和給藥后子宮分泌物中主要致病菌數(shù)量改變。利福昔明子宮注入劑高劑量組細菌清除率為92.8％，中劑量組細菌清除率為86.7％，低劑量組為61.5％，對照藥組為42.8％。其中，中劑量組和高劑量組可以獲得令人滿意臨床療效，而低劑量組由于藥物劑量較小，形成局部有效濃度有限，臨床療效一般；而對照藥(氟苯尼考子宮注入劑，與實施例4的利福昔明子宮注入劑的組成及各組分含量基本相同，不同之處僅在于其原料藥采用氟苯尼考)，單次注射而言，臨床療效也不令人滿意。從清楚細菌種類來看，該藥物對奶牛子宮內膜炎常見致病菌(大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和化膿性棒狀桿菌)均有療效。
(2)奶牛體征觀察：利福昔明子宮注入劑和氟苯尼考子宮注入劑治療奶牛子宮炎，給藥前由于存在炎癥，各實驗組奶牛體溫均略有升高，給藥后各時間點奶牛體溫逐漸恢復正常。治療后奶牛的精神食欲狀態(tài)、泌奶情況，陰道分泌物及子宮狀態(tài)等各種臨床癥狀都得到了顯著改善(p＜0.01)，其中高、中劑量利福昔明子宮注入劑的效果顯著優(yōu)于低劑量利福昔明子宮注入劑和氟苯尼考子宮注入劑(p＜0.01)，并且高、中劑量組治療效果無顯著差異(p＞0.05)。
表4受試藥物和對照藥物對奶牛子宮炎的治愈率和有效率
(3)治愈率及有效率：高(2倍推薦劑量)、中(推薦劑量)、低(1/2倍推薦劑量)劑量的利福昔明子宮注入劑對奶牛子宮炎的有效率分別為90％、90％和70％；氟苯尼考子宮注入劑(對照組)對奶牛子宮炎的有效率為60％。治愈率方面，高(2倍推薦劑量)、中(推薦劑量)、低(1/2倍推薦劑量)劑量的利福昔明子宮注入劑對奶牛子宮炎的治愈率分別為90％、80％和60％；氟苯尼考子宮注入劑(對照組)對奶牛子宮炎的治愈率為50％。
4)利福昔明子宮注入劑與同類產品相比
表5利福昔明子宮注入劑與同類產品相比表
硫酸頭孢喹肟子宮注入劑的組成及各組分含量基本相同，不同之處僅在于原料藥的不同，硫酸頭孢喹肟子宮注入劑采用的原料藥為硫酸頭孢喹肟。
從表5所示結果可以看出，利福昔明子宮注入劑在抗菌譜、制劑應用和藥物殘留方面，較頭孢類產品有非常突出的優(yōu)勢，更加適合在奶牛子宮類疾病防治中推廣應用。
按照實施例8的體內效果試驗的方法對實施例2、3、5-7的產品進行相同的測試，其結果與實施例4的效果相當。表明本發(fā)明提供的利福昔明子宮注入劑安全有效、生物利用度高、對局部組織刺激小、療效顯著，具有極高的推廣價值。