本發(fā)明屬于獸用生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種禽流感病毒、禽腺病毒和禽呼腸孤病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
：h9n2亞型禽流感屬于低致病性禽流感，發(fā)病率高，但死亡率低。主要臨床表現(xiàn)僅為輕度呼吸道癥狀，采食量減少，產(chǎn)蛋率可從90％降至20％以下，甚至絕產(chǎn)，對(duì)商品肉雞可導(dǎo)致30％左右死亡，極易與大腸桿菌混合感染，嚴(yán)重影響家禽的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。更重要的是，該亞型aiv可以穿越宿主障礙感染哺乳動(dòng)物包括人，也有機(jī)會(huì)在人類大流行，給人類健康帶來了嚴(yán)重的威脅。目前h9n2亞型是我國雞群中存在的aiv主要亞型，占禽流感總發(fā)病率的90％以上。各種防控措施中，疫苗免疫為最重要的措施。目前，雖然h9亞型禽流感滅活疫苗已廣泛應(yīng)用，該病也得到了有效控制，但是近幾年來h9亞型禽流感在免疫雞群中時(shí)有發(fā)生。為此，通過高適應(yīng)載體表達(dá)高質(zhì)量的有效抗原同時(shí)減少原有的生產(chǎn)成本達(dá)到針對(duì)同源/非同源h9亞型aiv流行株提供免疫保護(hù)的疫苗尤為必要。我國的禽流感h9亞型主要是通過雞胚尿囊腔接種流感病毒而獲得，該生產(chǎn)體系具有一些缺陷，如大流行時(shí)疫苗的供給量往往受到spf雞胚數(shù)量的限制；有些毒株無法在雞胚中復(fù)制，因此難以獲得足夠量的病毒，只有雞胚適應(yīng)株才能獲得高產(chǎn)量病毒；受體結(jié)合特異位點(diǎn)的變異導(dǎo)致抗原性降低；疫苗生產(chǎn)下游技術(shù)一成不變且十分繁重、易于污染等等。利用動(dòng)物傳代細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗，能夠在短期內(nèi)大量增殖病毒，且無外源因子污染，能較好的維持病毒抗原穩(wěn)定，彌補(bǔ)傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)體系的諸多不足。國內(nèi)外現(xiàn)在采用的動(dòng)物傳代細(xì)胞培養(yǎng)禽流感病毒主要是mdck細(xì)胞，且在培養(yǎng)過程中需要添加一定量的胰蛋白酶，這對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)帶來一些繁瑣，而采用本專利所述的動(dòng)物傳代細(xì)胞lmh細(xì)胞在培養(yǎng)流感病毒時(shí)無需添加胰蛋白酶，且培養(yǎng)出的流感病毒血凝價(jià)和免疫原性明顯好于mdck細(xì)胞培養(yǎng)的。禽i群腺病毒是家禽常見的感染病原體，呈世界性分布，目前發(fā)現(xiàn)所有年齡的家禽均易感，只是鑒于家禽的品種、年齡所形成的致病力不同。目前發(fā)現(xiàn)禽i群腺病毒對(duì)雞具有強(qiáng)致病性，臨床上常常出現(xiàn)包涵體肝炎及心包積液-肝炎綜合征，該病可直接引發(fā)養(yǎng)雞場20-40天齡雞只出現(xiàn)30％以上的死亡率，此外其臨床上也常常與傳染性支氣管炎病毒，呼腸孤病毒，h9亞型禽流感病毒等并發(fā)感染，導(dǎo)致種蛋雞出現(xiàn)明顯呼吸道病，關(guān)節(jié)炎，及嚴(yán)重的產(chǎn)蛋下降及畸形蛋等問題。因此目前該病已經(jīng)成為嚴(yán)重影響?zhàn)B雞場生產(chǎn)性能的重大疫病之一。禽i群腺病毒中的禽腺病毒4型(fav-4)目前是世界上的研究熱點(diǎn)，其具備高致病性，可直接引發(fā)的心包積液-肝炎綜合征(或安卡拉病)，該病于1987年首發(fā)于巴基斯坦，在不到一年的時(shí)間內(nèi)殃及整個(gè)巴基斯坦肉雞養(yǎng)殖企業(yè)，之后在科威特、伊朗、前蘇聯(lián)，日本，中南美洲及墨西哥等地具有發(fā)生，甚至該病在鴿子也曾大面積爆發(fā)。禽呼腸孤病毒在全球的感染十分普遍，病毒可感染雞、火雞及其他禽類。病毒性關(guān)節(jié)炎主要發(fā)生于肉雞，也可發(fā)生于蛋雞和火雞。病毒的易感性與年齡有關(guān)，日齡越大易感性越低，1日齡雛雞最易感，16周齡以后顯著降低。傳播途徑分為垂直傳播與水平傳播兩種方式，其中垂直傳播的幾率比較低，不同毒株的水平傳播能力差異較大，病毒可長期存在于盲腸扁桃體和跗跖關(guān)節(jié)內(nèi)，因此帶毒雞是潛在的接觸感染源。目前禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型主要還是通過spf雞胚載體進(jìn)行病毒增殖，病毒滴度不高且用spf雞胚載體大規(guī)模生產(chǎn)其生產(chǎn)成本非常昂貴；目前國內(nèi)還沒有用傳代細(xì)胞源細(xì)胞進(jìn)行該病毒增殖，進(jìn)而用其生產(chǎn)滅活疫苗。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種禽流感病毒、禽腺病毒和禽呼腸孤病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法。采用病毒高適應(yīng)性的傳代細(xì)胞系lmh細(xì)胞進(jìn)行禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)滅活疫苗生產(chǎn)。生產(chǎn)的禽流感h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)滅活疫苗免疫spf雞不僅能產(chǎn)生高水平的抗禽流感病毒h9亞型的hi抗體而且還能產(chǎn)生高水平的禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型中和抗體。本發(fā)明提供的三聯(lián)疫苗效價(jià)高，對(duì)禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒具有完全的免疫保護(hù)作用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種禽流感病毒、禽腺病毒和禽呼腸孤病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：s1.細(xì)胞的制備：用無血清添加的細(xì)胞生長液培養(yǎng)制苗用lmh細(xì)胞，待lmh細(xì)胞密度達(dá)1.0×106～1.5×106個(gè)/ml，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；s2.病毒的接種和培養(yǎng)：待所述步驟s1制苗用細(xì)胞培養(yǎng)4～5天，密度達(dá)到1.2×106～1.5×106個(gè)/ml分別接種禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型毒種，并加入無血清添加的細(xì)胞維持液進(jìn)行繁殖培養(yǎng)；s3.病毒收集、濃縮和純化：將上述步驟s2得到的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行凍融3次，于4℃、5000rpm條件離心12min后，分別收集禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型上清液，tcid50和eid50檢測，合格后，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒毒液；s4.疫苗成品的配制：向步驟s3制苗病毒液中加入終濃度為0.1～0.3％v/v的福爾馬林進(jìn)行滅活，即為疫苗抗原；然后將疫苗抗原乳化制成乳劑型滅活疫苗。其中疫苗配制方法：油相制備：取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司班-804份，先將白油緩慢加溫，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備：取滅活后的禽流感病毒h9亞型抗原、滅活后禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型按照體積比1:1:1各32份加入滅菌后的吐溫-804份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相。利用ika乳化機(jī)進(jìn)行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即可。優(yōu)選地，步驟s1所述無血清添加的細(xì)胞生長液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液80～90％v/v，鳥氨酸0.3～0.6mmol/l，山崳酸0.15～0.75g/l，肉豆蔻酸0.3～0.5g/l，鳥苷0.5～1.5mg/l，二氫丹參酮i3.5～7mg/l，賴氨酸1.5～5.5g/l，甘氨酸0.75～1.0g/l，苯異亮氨酸1～3.5g/l，精氨酸2.0～5.0g/l，蘇氨酸1～3g/l，纈氨酸2～3.5g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白5～10g/ml，艾葉多糖0.05～0.15g/l，鹽酸吡哆醇3～6mg/l，生物素0.1～1.5mg/l，硫酸鋅0.3～0.8mg/l，碳酸氫鈉1-3mg/l，檸檬酸鐵氨0.1～0.5g/l，白細(xì)胞介素-20.5～5mg/l，成纖維生長因子0.1～0.3mg/l，類胰島素生長因子1～3mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸1.5～3mg/l。進(jìn)一步地，步驟s1所述無血清添加的細(xì)胞生長液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液85％v/v，鳥氨酸0.5mmol/l，山崳酸0.55g/l，肉豆蔻酸0.4g/l，鳥苷1.0mg/l，二氫丹參酮i5.5mg/l，賴氨酸4g/l，甘氨酸0.85g/l，苯異亮氨酸2.5g/l，精氨酸3g/l，蘇氨酸1.5g/l，纈氨酸2.5g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白7.5g/ml，艾葉多糖0.12g/l，鹽酸吡哆醇5mg/l，生物素0.5mg/l，硫酸鋅0.5mg/l，碳酸氫鈉1.5mg/l，檸檬酸鐵氨0.35g/l，白細(xì)胞介素-22.5mg/l，成纖維生長因子0.25mg/l，類胰島素生長因子2.5mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸1.5mg/l優(yōu)選地，步驟s1中l(wèi)mh細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)傳代培養(yǎng)。優(yōu)選地，步驟s1中l(wèi)mh細(xì)胞在微載體生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，微載體使用量2～10g/l。優(yōu)選地，分別將禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型毒種按終體積1:50～1:500進(jìn)行接種。優(yōu)選地，步驟s2中所述細(xì)胞維持液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液90～95％v/v，鳥氨酸0.3～0.6mmol/l，山崳酸0.15～0.75g/l，肉豆蔻酸0.3～0.5g/l，鳥苷0.5～1.5mg/l，鹿茸膠原0.5～1.5g/l，二氫丹參酮i3.5～7mg/l，賴氨酸1.5～5.5g/l，甘氨酸0.75～1.0g/l，苯異亮氨酸1～3.5g/l，精氨酸2.0～5.0g/l，蘇氨酸1～3g/l，纈氨酸2～3.5g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白5～10g/ml，艾葉多糖0.05～0.15g/l，鹽酸吡哆醇3～6mg/l，生物素0.1～1.5mg/l，硫酸鋅0.3～0.8mg/l，碳酸氫鈉1-3mg/l，檸檬酸鐵氨0.1～0.5g/l，白細(xì)胞介素-20.5～5mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸1.5～3mg/l。進(jìn)一步地，步驟s2中所述細(xì)胞維持液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液92％v/v，鳥氨酸0.5mmol/l，山崳酸0.55g/l，肉豆蔻酸0.4g/l，鳥苷1.2mg/l，鹿茸膠原1.2g/l，二氫丹參酮i5.4mg/l，賴氨酸3.5g/l，甘氨酸0.85g/l，苯異亮氨酸2.5g/l，精氨酸3.5g/l，蘇氨酸1.5g/l，纈氨酸2.75g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白7.5g/ml，艾葉多糖0.12g/l，鹽酸吡哆醇5mg/l，生物素0.65mg/l，硫酸鋅0.5mg/l，碳酸氫鈉1.5mg/l，檸檬酸鐵氨0.25g/l，白細(xì)胞介素-23.5mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸1.5mg/l。本發(fā)明利用遺傳背景清楚的lmh細(xì)胞生產(chǎn)禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)病毒滅活疫苗，并用無血清添加的細(xì)胞生長液和細(xì)胞維持液來培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：(1)本發(fā)明在疫苗生產(chǎn)過程中，利用傳代細(xì)胞系lmh細(xì)胞為宿主細(xì)胞，且培養(yǎng)過程中無血清的添加，確保無外源病毒的添加；并且lmh細(xì)胞可在轉(zhuǎn)瓶或生物反應(yīng)器培養(yǎng)，可以實(shí)現(xiàn)疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。(2)本發(fā)明生產(chǎn)得到的生產(chǎn)的禽流感h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)滅活疫苗免疫spf雞不僅能產(chǎn)生高水平的抗禽流感病毒h9亞型的hi抗體而且還能產(chǎn)生高水平的禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型中和抗體，對(duì)禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒具有完全的免疫保護(hù)作用。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。鹿茸膠原購于勝富邦創(chuàng)新科技公司；艾葉多糖購于西安瑞林生物科技有限公司。實(shí)施例1一種禽流感病毒、禽腺病毒和禽呼腸孤病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法所述禽流感病毒、禽腺病毒和禽呼腸孤病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：s1.細(xì)胞的制備：用無血清添加的細(xì)胞生長液培養(yǎng)制苗用lmh細(xì)胞，待lmh細(xì)胞密度達(dá)1.2×106個(gè)/ml，在微載體生物反應(yīng)器中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其中微載體使用量8.5g/l；所述無血清添加的細(xì)胞生長液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液85％v/v，鳥氨酸0.5mmol/l，山崳酸0.55g/l，肉豆蔻酸0.4g/l，鳥苷1.0mg/l，二氫丹參酮i5.5mg/l，賴氨酸4g/l，甘氨酸0.85g/l，苯異亮氨酸2.5g/l，精氨酸3g/l，蘇氨酸1.5g/l，纈氨酸2.5g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白7.5g/ml，艾葉多糖0.12g/l，鹽酸吡哆醇5mg/l，生物素0.5mg/l，硫酸鋅0.5mg/l，碳酸氫鈉1.5mg/l，檸檬酸鐵氨0.35g/l，白細(xì)胞介素-22.5mg/l，成纖維生長因子0.25mg/l，類胰島素生長因子2.5mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸1.5mg/l；s2.病毒的接種和培養(yǎng)：待所述步驟s1制苗用細(xì)胞培養(yǎng)5天，密度達(dá)到1.4×106個(gè)/ml分別按終體積比1:150接種禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型毒種；并加入無血清添加的細(xì)胞維持液進(jìn)行繁殖培養(yǎng)；所述細(xì)胞維持液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液92％v/v，鳥氨酸0.5mmol/l，山崳酸0.55g/l，肉豆蔻酸0.4g/l，鳥苷1.2mg/l，鹿茸膠原1.2g/l，二氫丹參酮i5.4mg/l，賴氨酸3.5g/l，甘氨酸0.85g/l，苯異亮氨酸2.5g/l，精氨酸3.5g/l，蘇氨酸1.5g/l，纈氨酸2.75g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白7.5g/ml，艾葉多糖0.12g/l，鹽酸吡哆醇5mg/l，生物素0.65mg/l，硫酸鋅0.5mg/l，碳酸氫鈉1.5mg/l，檸檬酸鐵氨0.25g/l，白細(xì)胞介素-23.5mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸1.5mg/l。s3.病毒收集、濃縮和純化：將上述步驟s2得到的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行凍融3次，于4℃、5000rpm條件離心12min后，分別收集禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型上清液，tcid50和eid50檢測，合格后，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒毒液；s4.疫苗成品的配制：向步驟s3制苗病毒液中加入終濃度為0.1～0.3％v/v的福爾馬林進(jìn)行滅活，即為疫苗抗原；然后將疫苗抗原乳化制成乳劑型滅活疫苗。其中疫苗配制方法為：油相制備：取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司班-804份，先將白油緩慢加溫，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備：取滅活后的禽流感病毒h9亞型抗原、禽腺病毒4型抗原和禽呼腸孤病毒2型抗原按照體積比1:1:1各32份加入滅菌后的吐溫-804份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相。利用ika乳化機(jī)進(jìn)行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即可。實(shí)施例2一種禽流感病毒、禽腺病毒和禽呼腸孤病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法所述禽流感病毒、禽腺病毒和禽呼腸孤病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：s1.細(xì)胞的制備：用無血清添加的細(xì)胞生長液培養(yǎng)制苗用lmh細(xì)胞，待lmh細(xì)胞密度達(dá)1.5×106個(gè)/ml，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；所述無血清添加的細(xì)胞生長液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液90％v/v，鳥氨酸0.6mmol/l，山崳酸0.75g/l，肉豆蔻酸0.5g/l，鳥苷1.5mg/l，二氫丹參酮i7mg/l，賴氨酸5.5g/l，甘氨酸1.0g/l，苯異亮氨酸3.5g/l，精氨酸5.0g/l，蘇氨酸3g/l，纈氨酸3.5g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白10g/ml，艾葉多糖0.15g/l，鹽酸吡哆醇6mg/l，生物素1.5mg/l，硫酸鋅0.8mg/l，碳酸氫鈉3mg/l，檸檬酸鐵氨0.5g/l，白細(xì)胞介素-25mg/l，成纖維生長因子0.3mg/l，類胰島素生長因子3mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸3mg/l；s2.病毒的接種和培養(yǎng)：待所述步驟s1制苗用細(xì)胞培養(yǎng)4～5天，密度達(dá)到1.5×106個(gè)/ml分別按終體積比1:50接種禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型毒種；并加入無血清添加的細(xì)胞維持液進(jìn)行繁殖培養(yǎng)；所述細(xì)胞維持液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液95％v/v，鳥氨酸0.3mmol/l，山崳酸0.15g/l，肉豆蔻酸0.3g/l，鳥苷0.5mg/l，鹿茸膠原0.5g/l，二氫丹參酮i3.5mg/l，賴氨酸1.5g/l，甘氨酸0.75g/l，苯異亮氨酸1g/l，精氨酸2.0g/l，蘇氨酸1g/l，纈氨酸2g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白5g/ml，艾葉多糖0.05g/l，鹽酸吡哆醇3mg/l，生物素0.1mg/l，硫酸鋅0.3mg/l，碳酸氫鈉1mg/l，檸檬酸鐵氨0.1g/l，白細(xì)胞介素-20.5mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸1.5mg/l；s3.病毒收集、濃縮和純化：將上述步驟s2得到的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行凍融3次，于4℃、5000rpm條件離心12min后，分別收集禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型上清液，tcid50和eid50檢測，合格后，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒毒液；s4.疫苗成品的配制：向步驟s3制苗病毒液中加入終濃度為0.1％v/v的福爾馬林進(jìn)行滅活，即為疫苗抗原；然后將疫苗抗原乳化制成乳劑型滅活疫苗。其中疫苗配制方法：油相制備：取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司班-804份，先將白油緩慢加溫，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備：取滅活后的禽流感病毒h9亞型抗原、禽腺病毒4型抗原和禽呼腸孤病毒2型抗原按照體積比1:1:1各32份加入滅菌后的吐溫-804份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相。利用ika乳化機(jī)進(jìn)行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即可。實(shí)施例3一種禽流感病毒、禽腺病毒和禽呼腸孤病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法所述禽流感病毒、禽腺病毒和禽呼腸孤病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：s1.細(xì)胞的制備：用無血清添加的細(xì)胞生長液培養(yǎng)制苗用lmh細(xì)胞，待lmh細(xì)胞密度達(dá)1.0×106個(gè)/ml，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；所述無血清添加的細(xì)胞生長液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液90％v/v，鳥氨酸0.3mmol/l，山崳酸0.15g/l，肉豆蔻酸0.3g/l，鳥苷0.5mg/l，二氫丹參酮i3.5mg/l，賴氨酸1.5g/l，甘氨酸0.75g/l，苯異亮氨酸1g/l，精氨酸2.0g/l，蘇氨酸1g/l，纈氨酸2g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白5g/ml，艾葉多糖0.05g/l，鹽酸吡哆醇3mg/l，生物素0.1mg/l，硫酸鋅0.3mg/l，碳酸氫鈉1mg/l，檸檬酸鐵氨0.1g/l，白細(xì)胞介素-20.5mg/l，成纖維生長因子0.1mg/l，類胰島素生長因子1mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸1.5mg/l；s2.病毒的接種和培養(yǎng)：待所述步驟s1制苗用細(xì)胞培養(yǎng)4～5天，密度達(dá)到1.2×106個(gè)/ml分別按終體積1:500接種禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型毒種；并加入無血清添加的細(xì)胞維持液進(jìn)行繁殖培養(yǎng)；所述細(xì)胞維持液由以下成分及其含量組成：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液90％v/v，鳥氨酸0.6mmol/l，山崳酸0.75g/l，肉豆蔻酸0.5g/l，鳥苷1.5mg/l，鹿茸膠原1.5g/l，二氫丹參酮i7mg/l，賴氨酸5.5g/l，甘氨酸1.0g/l，苯異亮氨酸3.5g/l，精氨酸5.0g/l，蘇氨酸3g/l，纈氨酸3.5g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白10g/ml，艾葉多糖0.15g/l，鹽酸吡哆醇6mg/l，生物素1.5mg/l，硫酸鋅0.8mg/l，碳酸氫鈉3mg/l，檸檬酸鐵氨0.5g/l，白細(xì)胞介素-25mg/l，鏈霉素10mg/l和羥乙基哌嗪乙磺酸3mg/l；s3.病毒收集、濃縮和純化：將上述步驟s2得到的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行凍融3次，于4℃、5000rpm條件離心12min后，分別收集禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型上清液，tcid50和eid50檢測，合格后，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒毒液；s4.疫苗成品的配制：向步驟s3制苗病毒液中加入終濃度為0.3％v/v的福爾馬林進(jìn)行滅活，即為疫苗抗原；然后將疫苗抗原乳化制成乳劑型滅活疫苗。其中疫苗配制方法：油相制備：取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司班-804份，先將白油緩慢加溫，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備：取滅活后的禽流感病毒h9亞型抗原、禽腺病毒4型抗原和禽呼腸孤病毒2型抗原按照體積比1:1:1各32份加入滅菌后的吐溫-804份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相。利用ika乳化機(jī)進(jìn)行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即可。試驗(yàn)例1禽流感病毒h9亞型、滅活后禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)滅活疫苗的病毒含量測定1、試驗(yàn)材料：實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3的步驟s3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型上清液。2、試驗(yàn)方法：分別檢測實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3的步驟s3制備的禽流感病毒h9亞型上清液的tcid50、eid50和ha(血凝價(jià))，禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型上清液的tcid50。2.1、tcid50的檢測方法：分別將收集的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型細(xì)胞病毒液于-20℃反復(fù)凍融兩次后，于4℃、5000rpm離心10min，取離心后上清液分別用于超濾濃縮；將上述離心后的上清液分別用50k中空纖維柱將其濃縮后，取濃縮后的病毒液用dmem細(xì)胞培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-85個(gè)稀釋度接種48孔鋪滿單層lmh細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度重復(fù)5孔，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照細(xì)胞，每孔0.1ml，37℃吸附30min后，補(bǔ)加含1～2％新生牛血清、適量雙抗和2mm谷氨酰胺的dmem培養(yǎng)液0.3ml于37℃、5％co2培養(yǎng)120小時(shí)，觀察細(xì)胞病變(cpe)，計(jì)算tcid50；2.2、eid50的檢測方法將收集的禽流感h9亞型細(xì)胞病毒液于-20℃反復(fù)凍融兩次后，于4℃、5000rpm離心10min，取離心后上清液保存?zhèn)溆?。將上述離心濃縮后的禽流感病毒h9亞型上清液用pbs按照10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種spf雞胚，0.1ml/胚，每個(gè)稀釋度接種5枚雞胚，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察7天，每天記錄雞胚死亡情況，如果有死亡雞胚放入4℃冰箱保存，觀察時(shí)間結(jié)束后利用reed-muench方法計(jì)算離心收獲的上清液的eid50；2.3、ha的檢測方法：按微量法在v型血凝試驗(yàn)微量板上進(jìn)行，雞紅細(xì)胞濃度為1％(v/v)，反應(yīng)總量均為0.050ml。3、試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗的病毒含量檢測表實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3禽流感病毒h9亞型(tcid50)109.1108.8108.9禽流感病毒h9亞型(eid50)108.7108.4108.5禽流感病毒h9亞型(ha)210.229210禽腺病毒4型(tcid50)108.9108.7108.8禽呼腸孤病毒2型(tcid50)108.8108.6108.7由表1可知，本發(fā)明制備得到的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)滅活疫苗病毒含量高，禽流感病毒h9亞型≥108.8tcid50，禽流感病毒h9亞型≥108.4eid50，禽流感病毒h9亞型ha≥29，禽腺病毒4型≥108.7tcid50，禽呼腸孤病毒2型≥108.6tcid50，可以有效的提高禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)滅活疫苗的疫苗效果。說明本發(fā)明無血清添加細(xì)胞生長液和細(xì)胞維持液可以有效提高病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量，提高疫苗的疫苗效果。試驗(yàn)例2禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗產(chǎn)品檢驗(yàn)1、試驗(yàn)材料：實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗。2、試驗(yàn)方法：對(duì)實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行外觀，穩(wěn)定性，粘度，無菌檢驗(yàn)，滅活檢驗(yàn)，安全檢驗(yàn)和甲醛含量測定。2.1、外觀觀察：直接觀察實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗的外觀情況。2.2、穩(wěn)定性測定：各吸取實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)10毫升加入離心管中，以3000rpm離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)≤0.5ml。2.3、粘度測定：用出口內(nèi)徑為1.2mm的1.0ml吸管，在25℃左右吸取實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時(shí)間，應(yīng)不超過8秒。2.4、無菌檢驗(yàn)：取實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基小管和酪胨瓊脂各兩支，每支0.2ml，一支置37℃培養(yǎng)，一支置25℃培養(yǎng)，觀察3～5日，應(yīng)純粹，無菌生長。2.5、滅活檢驗(yàn)：取實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗，用dmem營養(yǎng)液以10-1、10-2、10-3三個(gè)比例稀釋待檢樣品，同時(shí)設(shè)立同樣稀釋比例的滅活前病毒樣品用于陽性對(duì)照，分別接種于48孔lmh細(xì)胞單層細(xì)胞，每組重復(fù)接種5孔，每孔0.4ml37℃、5％co2培養(yǎng)96小時(shí)。滅活樣品各組稀釋度孔中均沒有出現(xiàn)細(xì)胞病變，陽性對(duì)照組各稀釋度孔中細(xì)胞病變均明顯，達(dá)80％以上，判定為滅活檢驗(yàn)合格。2.6、安全檢驗(yàn)：用7日齡spf雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗1ml，觀察14日，結(jié)果試驗(yàn)雞均健活，無任何局部和全身不良反應(yīng)。2.7、甲醛含量測定：ⅰ、對(duì)照品溶液的制備：取已標(biāo)定的甲醛溶液適量，配成每1.0ml含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0ml置50ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得；ⅱ、被測樣本的制備：用5.0ml刻度吸管量取實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗5.0ml，置50ml量瓶中，用20％吐溫-80乙醇溶液10ml，分次洗滌吸管，洗液并入50ml量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強(qiáng)烈振搖，靜止分層，下層液如果不澄清，濾過，棄去初濾液，取澄清續(xù)濾液，即得；ⅲ、測定法：精密吸取對(duì)照品溶液和被檢品溶液各0.5ml，分別加醋酸-醋酸銨緩沖液10ml，乙酰丙酮試液10ml，置60℃恒溫水浴15分鐘，冷水冷卻5分鐘，放置20分鐘后，按紫外-可見分光光度計(jì)法，在410nm的波長處測定吸收度，計(jì)算即得。甲醛含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)，即檢驗(yàn)合格。3、試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量檢測由表2可知，本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒三聯(lián)滅活疫苗外觀為乳白色乳劑，將10ml疫苗加入離心管中，以3000rpm離心15min，管底析出的水相應(yīng)≤0.4ml，具有較高的穩(wěn)定性高；吸取1.0ml疫苗，令其垂直自然流出0.4ml，時(shí)間低于3.8s，具有較好的粘度，滅活、甲醛含量和安全性符合國家標(biāo)準(zhǔn)，有利于該禽流感病毒、禽腺病毒二聯(lián)滅活疫苗的推廣和應(yīng)用。試驗(yàn)例3疫苗效力試驗(yàn)取21日齡spf雞40只，分為四組，每組10只spf雞，將實(shí)施例1～3以及對(duì)照組(與本發(fā)明實(shí)施例1的區(qū)別在于，所用細(xì)胞生長液和細(xì)胞維持液均為常規(guī)含胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，其他均與實(shí)施例1類似)制備得到的禽流感h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)滅活疫苗到的分別以0.3ml/只胸肌注射。免疫后7、14、21、28、35、42、49天，測定其禽流感病毒h9亞型hi抗體效價(jià)，結(jié)果如表3所示。表3免疫后不同時(shí)間(天)禽流感病毒h9亞型抗體水平由表3可知，實(shí)施例1～3制備得到的禽流感h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)滅活疫苗與對(duì)照組相當(dāng)，說明本發(fā)明制備得到的三聯(lián)滅活疫苗對(duì)禽流感h9亞型病毒具有較好的免疫效果。免疫后35天測定禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型血清中和抗體效價(jià)，結(jié)果如表4所示。表4禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型血清中和抗體效價(jià)由表4可知，實(shí)施例1～3制備得到的禽流感h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型三聯(lián)滅活疫苗免疫spf雞不僅能產(chǎn)生高水平的抗禽流感病毒h9亞型的hi抗體而且還能產(chǎn)生高水平的禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型中和抗體，對(duì)禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型病毒具有完全的免疫保護(hù)作用。當(dāng)前第1頁12