本發(fā)明屬于藥物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種組蛋白去乙?；竓dac6，具體來說是一種組蛋白去乙?；竓dac6的抑制劑在制備防治急性腎損傷藥物中的用途。

背景技術(shù)：

急性腎損傷(acutekidneyinjury,aki)是一種常見的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為腎功能的快速下降及代謝廢物的蓄積，其診斷有賴于血清肌酐(serumcreatinine,scr)的升高和尿量的減少。aki概念的提出用于取代使用多年的急性腎衰竭(acuterenalfailure,arf)。aki的發(fā)病率高，且呈逐年上升趨勢，在住院患者尤其是重癥患者中十分常見，重癥aki患者病死率高。最近的流行病學(xué)資料表明：即使是輕微的、可逆的aki也會造成腎臟組織的持久損傷，嚴(yán)重的aki造成腎功能的不可逆下降，增加死亡的風(fēng)險(xiǎn)。目前尚無治療aki的特效藥物，嚴(yán)重時(shí)需進(jìn)行腎臟替代治療。aki患者發(fā)展成為慢性腎臟病的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，有部分患者會直接進(jìn)展到終末期腎病。如果及時(shí)識別、去除危險(xiǎn)因素或積極干預(yù)，許多aki的腎功能可完全或部分恢復(fù)，并脫離透析，因此，早期診斷、早期干預(yù)是改善aki預(yù)后的關(guān)鍵。

20世紀(jì)70年代以來，順鉑已被臨床廣泛用于治療多種惡性腫瘤，包括睪丸癌、卵巢癌、膀胱癌、宮頸癌、頭頸部惡性腫瘤以及小細(xì)胞或非小細(xì)胞肺癌等，是治療實(shí)體腫瘤最有效和常用的藥物之一，但在正常組織中的嚴(yán)重不良反應(yīng)常限制其臨床應(yīng)用，順鉑不良反應(yīng)有耳毒性、胃腸道毒性、骨髓抑制、變態(tài)反應(yīng)及腎毒性，其中腎毒性最常見，順鉑治療后，約1/3患者出現(xiàn)腎功能障礙導(dǎo)致急性腎衰竭，其劑量相關(guān)的腎毒性大大限制了臨床應(yīng)用。目前順鉑致腎損傷機(jī)制仍未完全明確，近年研究發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)、壞死、凋亡、氧化應(yīng)激、自噬等均可能為順鉑致急性腎損傷原因。

順鉑觸發(fā)的炎性反應(yīng)可引起腎組織損傷及功能障礙，出現(xiàn)急性腎損傷。近年研究表明，各種炎癥基因包括腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor，tnf-α)、toll樣受體4、白細(xì)胞介素18、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1β、細(xì)胞間黏附分子1(intercellularadhesionmolecule-1，icam-1)的表達(dá)在順鉑致急性腎損傷中均有增加。核因子κb為順鉑腎損傷中被tnf-α激活的轉(zhuǎn)錄因子，其活化導(dǎo)致許多細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞間黏附分子及腎臟疾病相關(guān)受體的表達(dá)，間接抑制核因子κb能夠減弱順鉑腎毒性。

順鉑腎毒性導(dǎo)致腎臟組織形態(tài)學(xué)改變主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞死亡，包括細(xì)胞壞死及凋亡兩種形式。最近有關(guān)于順鉑腎毒性機(jī)制的研究聚焦于腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，已經(jīng)證實(shí)在順鉑導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷中有一些凋亡途徑參與，包括通過死亡受體激活的外源性途徑，如腫瘤壞死因子受體或fas途徑，內(nèi)源性線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。1999年baliga等已經(jīng)證實(shí)氧化應(yīng)激是順鉑腎毒性的重要機(jī)制之一，活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ros)的產(chǎn)生有如下三種機(jī)制，包括膜脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑耗竭、線粒體功能障礙以及細(xì)胞色素p450系統(tǒng)。自噬是真核細(xì)胞特有的普遍生命現(xiàn)象，在維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存方面起重要作用，廣泛參與多種生理和病理過程。近期，takahashi及kaushal等的研究均表明，自噬可防范順鉑導(dǎo)致的急性腎損傷及近端小管凋亡，認(rèn)為自噬對急性腎損傷引起的腎臟損害具有保護(hù)作用。

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是不涉及dna序列改變的可遺傳的基因表達(dá)變化研究，在其諸多形式中，組蛋白的共價(jià)修飾占有重要地位，其與基因的表達(dá)調(diào)控密切關(guān)聯(lián)，包括磷酸化、乙酰化、甲基化修飾等。組蛋白乙?；叭ヒ阴；揎検亲钪匾姆绞?是基因表達(dá)調(diào)控最主要的驅(qū)動力，此可逆的動態(tài)修飾由組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(hat)和組蛋白去乙?；?histonedeacetylases,hdacs)共同催化,共同控制染色質(zhì)各區(qū)域核心組蛋白的乙?；潭?。組蛋白的乙?；潭扰c轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)：轉(zhuǎn)錄活動區(qū)域核心組蛋白的乙酰化密度高，而不活動區(qū)域乙酰化密度低。hat促使染色體的解聚，激活轉(zhuǎn)錄；而hdacs則封閉dna，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄過程。

在正常生理狀態(tài)下，hat與hdacs對組蛋白乙?；饔玫恼{(diào)控處于平衡狀態(tài)。而細(xì)胞在發(fā)生轉(zhuǎn)化的狀態(tài)下，hdacs的活性明顯增強(qiáng)，使得原有的基因表達(dá)平衡狀態(tài)被打破，導(dǎo)致一些影響細(xì)胞增殖和調(diào)控細(xì)胞周期的分子表達(dá)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞惡變。hdacs成為表觀遺傳學(xué)中治療多種臨床疾病的重要和潛力靶點(diǎn)。

hdac家族非常龐大，目前，已有18種被分離出來，根據(jù)它們與酵母hdac蛋白的同源性以及大小、在細(xì)胞中存在部位和包含的催化位點(diǎn)分為四大類：i型(hdac1，2，3和8)與酵母rpd3最為相似，有著共同的催化位點(diǎn)，全部位于細(xì)胞核中；iia型(hdac4，5，7和9)與hdac1有共同的催化位點(diǎn)，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有存在，而iib型(hdac6和10)具有兩個(gè)催化位點(diǎn)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中；iv型由hdac11單獨(dú)組成，它具有i型和ii型hdac的兩個(gè)催化位點(diǎn)。

hdac6基因定位于x染色體p11.22-23區(qū)帶，約21923bp，由位于41～677bp間的28個(gè)外顯子編碼。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來講，hdac6含有1216個(gè)氨基酸，是目前發(fā)現(xiàn)的人類最大的蛋白質(zhì)。hdac6在心、肝、腎、腦、胰腺等臟器中高表達(dá)，是一種胞內(nèi)酶，具有泛素結(jié)合功能和去乙?；富钚?，它與底物(α-微管蛋白、hsp90和cortactin)相互作用并使之去乙?；Ｍㄟ^這些相互作用，hdac6調(diào)節(jié)許多重要的生物過程，包括細(xì)胞遷移、微管穩(wěn)定性、胞內(nèi)運(yùn)輸、免疫突觸形成以及錯誤折疊蛋白的降解。目前研究認(rèn)為，hdac6與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病、腹膜纖維化以及急性腎損傷的發(fā)生均有一定關(guān)聯(lián)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種組蛋白去乙?；竓dac6的抑制劑在制備防治急性腎損傷藥物中的用途，所述的這種組蛋白去乙?；竓dac6的抑制劑在制備防治急性腎損傷藥物中的用途解決了現(xiàn)有技術(shù)中沒有合適的藥物用于治療由于急性腎損傷引起的腎臟結(jié)構(gòu)和功能損害的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種組蛋白去乙?；竓dac6的抑制劑在制備防治急性腎損傷藥物中的用途。

進(jìn)一步的，所述的組蛋白去乙?；竓dac6的抑制劑為tubastatina。

我們在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠模型上使用hdac6選擇性抑制劑tubastatina(ta)，來探討靶向抑制hdac6對急性腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠模型使用hdac6抑制劑ta進(jìn)行干預(yù)治療，可顯著減輕小鼠急性腎損傷腎臟病理損害，改善腎功能。hdac6抑制劑ta可通過調(diào)控akt信號通路、nf-κb炎癥通路、自噬水平以及e-cadherin的表達(dá)來下調(diào)炎癥因子的釋放，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減少腎小管細(xì)胞的凋亡和小管擴(kuò)張壞死，改善腎臟病理損傷和腎功能，起到保護(hù)急性腎損傷中腎臟結(jié)構(gòu)和功能的作用。因此，hdac6可成為臨床上防治急性腎損傷的重要靶點(diǎn)。

附圖說明

圖1顯示了hdac6抑制劑可改善順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷模型中的腎臟損傷和腎功能。

圖2顯示了在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，ta特異性抑制腎臟中hdac6的表達(dá)。

圖3顯示了ta顯著上調(diào)急性腎損傷模型中乙?；鞍議3和acetylα-tubulin水平。

圖4顯示了hdac6抑制劑下調(diào)急性腎損傷模型中ngal和kim-1表達(dá)水平。

圖5顯示了hdac6抑制劑ta改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷引起的腎小管細(xì)胞凋亡水平。

圖6顯示了hdac6抑制劑在順鉑處理的人腎小管上皮細(xì)胞中的保護(hù)作用及機(jī)制。

圖7顯示了抑制hdac6可上調(diào)akt磷酸化水平和e-cadherin表達(dá)量。

圖8顯示了在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，ta可上調(diào)腎臟自噬水平。

圖9顯示了ta下調(diào)急性腎損傷中氧化應(yīng)激水平。

圖10顯示了ta可阻斷順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中nf-κb通路并抑制炎癥因子il-6的表達(dá)。

圖11顯示了在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，hdac6抑制劑顯著下調(diào)腎臟炎癥因子tnf-α表達(dá)水平。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1材料和方法

1)材料和試劑

抑制劑tubastatina購于selleckchem公司。acetyl-histoneh3，hdac6，cleavedcaspase3，p-nf-κb(p65)，nf-κb(p65)，e-cadherin，totalhistoneh3，p-akt，akt，p-stat3，stat3，atg7抗體均購于cellsignalingtechnology公司。il-6和tnf-α抗體購于santacruz公司。ngal和kim-1抗體購于r&d公司。lc3b/map1lc3b購于novusbiological公司。熒光二抗購于invitrogen公司。mda和sod檢測試劑盒購于南京建成生物公司。順鉑，β-actin，westernblot所需二抗以及其他試劑均購于sigma公司

2)細(xì)胞培養(yǎng)和處理

人腎小管上皮細(xì)胞(hk2)用含5％胎牛血清，0.5％青霉素和鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5％二氧化碳和95％空氣。為研究ta對于順鉑引起的腎臟損傷的作用機(jī)制，我們將hk2細(xì)胞在含0.5％胎牛血清的f12培養(yǎng)基中饑餓24小時(shí)后，加入終濃度為20ug/ml的順鉑模擬急性腎損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，同時(shí)加入0μm、5μm、10μm三個(gè)濃度的ta進(jìn)行干預(yù)24h。最后收集細(xì)胞進(jìn)行westernblot檢測。

3)急性腎損傷模型和實(shí)驗(yàn)分組

小鼠隨機(jī)分為四組，每組6只。sham空白對照組腹腔注射dmso；sham+ta組腹腔注射70mg/kg的ta，溶于50uldmso中；模型組腹腔注射20mg/kg劑量的順鉑，溶于0.9％的生理鹽水中，建立小鼠急性腎損傷模型；模型加藥組在順鉑注射后再立即注射ta抑制劑(70mg/kg)。48小時(shí)后處死小鼠，收集腎臟標(biāo)本和血液標(biāo)本。所有動物實(shí)驗(yàn)均遵守中國實(shí)驗(yàn)動物管理和使用條例。

4)腎功能檢測

小鼠血液標(biāo)本經(jīng)離心后收集血清成分，在全自動生化儀(p800,modular,usa)上檢測血清肌酐和血清尿素氮指標(biāo)。

5)氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

在注射順鉑造模48h后，收集小鼠腎臟標(biāo)本，研磨為蛋白勻漿后，用mda和sod試劑盒檢測小鼠腎臟mda和sod指標(biāo)含量

6)小管損傷評分

在腎臟pas病理染色中觀察小管損傷程度，并根據(jù)半定量損傷評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小管損傷評估，正常腎小管組織為0分，腎小管損傷程度小于30％的為1分，腎小管損傷程度在30％-60％之間的為2分，大于60％的為3分。

7)組織學(xué)和免疫熒光染色

腎臟組織經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋、組織切片后進(jìn)行組織學(xué)和免疫熒光染色。hdac6，acetyl-histoneh3，ngal，kim-1等一抗?jié)舛染鶠?：100，熒光二抗?jié)舛葹?：200。dapi染色根據(jù)操作說明進(jìn)行。

8)蛋白質(zhì)免疫印跡

腹膜組織提取蛋白，按照文獻(xiàn)方法操作。蛋白質(zhì)免疫印跡(westernblot)結(jié)果用imagej軟件進(jìn)行灰度分析。

9)統(tǒng)計(jì)分析

使用均值±sem表示數(shù)據(jù)。多組間比較用單因素方差分析(anova)，兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)。以p<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)施例2hdac6抑制劑改善順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷模型中的腎臟損傷和腎功能

為了檢測hdac6在急性腎損傷中的作用機(jī)制，我們在順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型中注射了70mg/kg的hdac6特異性抑制劑ta。順鉑造模48小時(shí)后，血清肌酐和尿素氮指標(biāo)明顯升高，而小管擴(kuò)張壞死等腎臟病理損傷表現(xiàn)也較為嚴(yán)重，而ta治療后，其相應(yīng)腎臟損傷和腎功能指標(biāo)都顯著下降(圖1a-c)。此外，腎小管損傷評分也提示ta治療可改善順鉑引起的腎臟病理損傷(圖1d)。因此，hdac6的抑制劑ta不僅可以改善腎功能，還能減輕腎臟病理損傷。這些結(jié)果表明hdac6抑制劑ta可以保護(hù)急性腎損傷引起的腎臟損害。

實(shí)施例3在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，ta特異性抑制腎臟中hdac6的表達(dá)。

為證明ta對于hdac6的特異性抑制效果，我們檢測了急性腎損傷模型加抑制劑ta各分組中hdac6的表達(dá)情況和表達(dá)部位。免疫熒光和免疫印跡結(jié)果顯示，在正常小鼠腎臟中，hdac6表達(dá)很低或者不表達(dá)，在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，hdac6的表達(dá)顯著升高，而使用ta治療后，其高表達(dá)水平被抑制(圖2a-d)。圖2c柱形圖數(shù)據(jù)表明在急性腎損傷模型中，ta可抑制近70％的hdac6表達(dá)。此外，我們還在免疫熒光中觀察到hdac6主要表達(dá)在擴(kuò)張的腎小管上(圖2a)。這些結(jié)果提示，在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，ta特異性抑制腎臟中hdac6的表達(dá)。

實(shí)施例4ta顯著上調(diào)急性腎損傷模型中乙?；鞍議3和acetylα-tubulin水平。

為了探討hdac6抑制劑ta對于組蛋白乙?；降挠绊懽饔?，我們檢測了不同實(shí)驗(yàn)分組中乙酰化蛋白h3和acetylα-tubulin水平。如圖3a-c所示，acetyl-h3和acetylα-tubulin水平在正常腎臟中表達(dá)都較低，使用hdac6抑制劑ta后，acetyl-h3和acetylα-tubulin水平都有顯著升高。不同的是順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型組中acetyl-h3水平高于正常對照組，而急性腎損傷中acetylα-tubulin水平低于正常腎臟表達(dá)水平。免疫熒光結(jié)果提示，在正常腎臟組織中acetyl-h3幾乎不表達(dá)，在急性腎損傷的腎臟組織中表達(dá)升高，而使用ta治療后，其表達(dá)水平顯著上調(diào)，且acetyl-h3陽性細(xì)胞主要表達(dá)在腎小管細(xì)胞上(圖3d)。這些結(jié)果提示，ta顯著上調(diào)急性腎損傷模型中乙?；鞍議3和acetylα-tubulin水平。

實(shí)施例5hdac6抑制劑下調(diào)急性腎損傷模型中ngal和kim-1表達(dá)水平。

為了證明hdac6抑制劑ta對于順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷具有保護(hù)作用，我們檢測了兩個(gè)腎臟損傷的早期特異性生物指標(biāo)，ngal和kim-1。如圖4a和4c的免疫印跡結(jié)果提示，早期腎臟損傷指標(biāo)ngal和kim-1在正常腎臟中不表達(dá)，在急性腎損傷小鼠的腎臟中高表達(dá)，而使用了抑制劑ta后，其表達(dá)水平又顯著下降，說明hdac6抑制劑ta在急性腎損傷模型中對于腎臟組織有一定的保護(hù)作用。相類似的結(jié)果在ngal指標(biāo)的免疫熒光檢測中也有體現(xiàn)，ta顯著下調(diào)ngal的表達(dá)水平(圖4b和4d)。綜合兩個(gè)腎臟損傷的早期特異性生物指標(biāo)情況，我們認(rèn)為hdac6抑制劑ta在急性腎損傷模型中對于腎臟組織有一定的保護(hù)作用。

實(shí)施例6hdac6抑制劑ta改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷引起的腎小管細(xì)胞凋亡水平。

細(xì)胞凋亡是急性腎損傷發(fā)生過程中必不可少的步驟之一，因此我們通過凋亡tunel熒光染色和免疫印跡cleavedcaspase3水平來檢測在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型以及hdac6抑制劑治療中凋亡水平的變化情況。tunel熒光染色結(jié)果提示，凋亡陽性細(xì)胞在正常腎組織中不表達(dá)，在急性腎損傷腎臟中高表達(dá)，而ta治療后，其陽性細(xì)胞數(shù)又顯著下降(圖5a和5c)。在cleavedcaspase3的免疫印跡結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)在腎損傷組中，ta治療可下調(diào)cleavedcaspase3表達(dá)水平(圖5b和5d)。綜上，我們認(rèn)為hdac6抑制劑ta可改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷引起的腎小管細(xì)胞凋亡水平。

實(shí)施例7hdac6抑制劑在順鉑處理的人腎小管上皮細(xì)胞中的保護(hù)作用及機(jī)制。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證hdac6抑制劑對于順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，我們用順鉑處理人腎小管上皮細(xì)胞(hk2)來模擬急性腎損傷中的細(xì)胞損傷環(huán)境。饑餓處理后的hk2細(xì)胞加入20ug/ml的順鉑來模擬細(xì)胞損傷環(huán)境，同時(shí)我們使用了三個(gè)濃度梯度(0,5,10μm)的ta來觀察其作用效果，加藥處理24小時(shí)后收集細(xì)胞做免疫印跡檢測。如圖6(a-h)所示，在順鉑處理的hk2細(xì)胞中，ta可抑制hdac6表達(dá)，上調(diào)acetyl-h3和acetylα-tubulin水平。在機(jī)制方面，我們觀察到hdac6抑制劑ta可通過上調(diào)e-cadherin水平起到腎臟保護(hù)作用。同樣的在細(xì)胞凋亡方面，我們檢測了cleavedcaspase3水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ta治療可下調(diào)順鉑導(dǎo)致的hk2細(xì)胞的凋亡水平，且呈劑量依賴性。這部分的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，hdac6抑制劑對于順鉑處理的人腎小管上皮細(xì)胞有一定保護(hù)作用，并可能通過上調(diào)e-cadherin水平來發(fā)揮其腎臟保護(hù)機(jī)制。

實(shí)施例8抑制hdac6可上調(diào)akt磷酸化水平和e-cadherin表達(dá)量。

有研究發(fā)現(xiàn)akt是介導(dǎo)腎小管細(xì)胞增殖分化過程中一條重要的信號通路，因此在研究中，我們檢測了在急性腎損傷模型中抑制劑ta對于akt通路的影響情況。免疫印跡結(jié)果提示當(dāng)急性腎損傷發(fā)生時(shí)，磷酸化akt水平高于正常組，模型組中加入ta后其磷酸化水平顯著升高，而總蛋白akt水平?jīng)]有變化(圖7a-7c)。另一方面，e-cadherin是一種鈣依賴性的跨膜蛋白，主要參與細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附，分布于人和動物的各類上皮細(xì)胞，在維持細(xì)胞的極性和完整性等方面起重要作用。在正常小鼠腎臟中，e-cadherin高表達(dá)。當(dāng)注射順鉑引起急性腎損傷發(fā)生時(shí)，小管擴(kuò)張，細(xì)胞壞死脫落，使e-cadherin表達(dá)量明顯下調(diào)。若同時(shí)注射具有保護(hù)作用的ta后，e-cadherin表達(dá)水平升高(圖7d和7e)，這一結(jié)果提示，ta抑制hdac6可通過akt信號通路和e-cadherin機(jī)制對腎臟起保護(hù)作用。

實(shí)施例9在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，ta可上調(diào)腎臟自噬水平。

目前普遍認(rèn)為自噬是一種防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞可以通過自噬和溶酶體，清除、降解和消化受損、變性、衰老和失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子。為細(xì)胞的重建、再生和修復(fù)提供必須原料，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的再循環(huán)和再利用。既往研究證實(shí)自噬對急性腎損傷中的小管細(xì)胞凋亡有一定保護(hù)作用。因此，我們選取了兩個(gè)自噬特異性標(biāo)志蛋白atg7和lc3來檢測在順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型以及hdac6抑制劑ta對于自噬水平的影響情況。圖8(a-c)結(jié)果提示，當(dāng)腎損傷發(fā)生時(shí)，小鼠腎臟自噬水平升高，而使用ta干預(yù)治療后，其自噬水平又顯著上升，說明ta對腎臟小管細(xì)胞的保護(hù)作用與自噬的激活有關(guān)。

實(shí)施例10ta下調(diào)急性腎損傷中氧化應(yīng)激水平。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(ros)和活性氮自由基(rns)產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增多，從而介導(dǎo)組織損傷。超氧化物歧化酶(sod)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是清除氧自由基的首要物質(zhì)。脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛(mda)是氧化應(yīng)激反應(yīng)重要的氧化產(chǎn)物之一，可在一定程度上反應(yīng)機(jī)體的氧化應(yīng)激水平。我們分別使用sod和mda生物試劑盒來檢測不同分組中小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。如圖9(a-b)所示，與對照組相比，損傷組中腎臟sod水平下降，mda含量升高。而使用ta進(jìn)行干預(yù)治療后，sod和mda指標(biāo)均有改善。這一結(jié)果提示，氧化應(yīng)激參與了急性腎損傷的病變過程，而hdac6抑制劑可通過下調(diào)機(jī)體氧化應(yīng)激水平來保護(hù)腎臟功能。

實(shí)施例11ta可阻斷順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中nf-κb通路并抑制炎癥因子il-6的表達(dá)。

炎癥反應(yīng)是急性腎損傷重要的發(fā)生機(jī)制之一，其中nf-κb是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄因子。通過免疫印跡結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，磷酸化nf-κb水平升高，ta治療后炎癥水平顯著下調(diào)(圖10a和10b)。在炎癥因子白細(xì)胞介素6(il-6)的免疫組化分析中，我們發(fā)現(xiàn)模型組腎臟高表達(dá)il-6，而模型加藥組其陽性表達(dá)區(qū)域顯著減少(圖10c和10d)。因此，nf-κb通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和炎癥因子浸潤可加重順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷程度，而ta可抑制nf-κb磷酸化及炎癥因子表達(dá)，起到保護(hù)腎臟的作用。

實(shí)施例12在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，hdac6抑制劑顯著下調(diào)腎臟炎癥因子tnf-α表達(dá)水平。

腫瘤壞死因子α(tnf-α)是由巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫、腫瘤免疫等多種生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其信號傳導(dǎo)通路主要包括caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、銜接蛋白traf介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子nf-κb和jnk蛋白激酶的活化。在圖11(a-b)的tnf-α免疫組化結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)正常小鼠腎臟幾乎不表達(dá)tnf-α，而在急性腎損傷小鼠的腎臟中，tnf-α高表達(dá)，加入ta干預(yù)治療后，其陽性表達(dá)區(qū)域又有明顯下降，說明在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，hdac6抑制劑顯著下調(diào)腎臟炎癥因子tnf-α表達(dá)水平，ta可通過抑制炎癥通路來保護(hù)腎臟功能。