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      一種碘代氟硼二吡咯高負(fù)載率納米棒的制備及應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):11240302閱讀:782來(lái)源:國(guó)知局
      一種碘代氟硼二吡咯高負(fù)載率納米棒的制備及應(yīng)用的制造方法與工藝

      本發(fā)明屬于納米材料制備和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種碘代氟硼二吡咯高負(fù)載率納米棒的制備及應(yīng)用。



      背景技術(shù):

      α-乳白蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)α-la)是由123個(gè)氨基酸組成的,是一種結(jié)構(gòu)緊實(shí)的球蛋白,在其二級(jí)結(jié)構(gòu)中大約有26%為α-螺旋,14%為β-折疊,其它60%為無(wú)序結(jié)構(gòu)。通過(guò)酶解后的乳白蛋白,會(huì)存在顯著的兩親性肽鏈,由此可知酶解后的兩親性肽鏈可以作為兩親性單體聚集形成膠束。另一方面,α-乳白蛋白有四個(gè)二硫鍵,通過(guò)打破二硫鍵能夠得到游離的巰基,進(jìn)而在多肽分子間交錯(cuò)形成新的二硫鍵,可以提高膠束作為藥物載體的穩(wěn)定性。

      新型光敏劑碘代氟硼二吡咯因?yàn)榫哂懈呦庀禂?shù),高單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率、高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛關(guān)注,被視作一種理想的光動(dòng)力治療劑。但碘代氟硼二吡咯分子疏水性的特性阻礙了其在生物醫(yī)學(xué)上的進(jìn)一步應(yīng)用。因此,本發(fā)明試圖利用la肽鏈的兩親性和能形成膠束的特性,對(duì)疏水性的光敏劑bodipy-2i進(jìn)行組裝轉(zhuǎn)相,發(fā)展一種具有高負(fù)載率且光動(dòng)力治療效果顯著的bodipy-2i-la納米棒。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的在于提供一種碘代氟硼二吡咯高負(fù)載率納米棒的制備及應(yīng)用。本發(fā)明所制得bodipy-2i-la納米棒可以實(shí)現(xiàn)對(duì)疏水性光敏劑bodipy-2i的高負(fù)載,在光照作用下產(chǎn)生高的單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率,并在腫瘤部位受ph及gsh雙重響應(yīng)藥物釋放特性等優(yōu)點(diǎn),可作為一種優(yōu)良的光動(dòng)力治療劑。

      為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:

      一種碘代氟硼二吡咯高負(fù)載率納米棒的制備方法:首先由α-乳白蛋白(α-la)經(jīng)酶水解成兩親性的肽鏈,然后加入dtt將肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基,疏水性的光敏劑bodipy-2i通過(guò)疏水作用力和兩親性乳白蛋白肽鏈的疏水端自組裝,形成bodipy-2i-la納米棒,然后通入氧氣氧化,使巰基重新錯(cuò)位交聯(lián),使納米棒更加穩(wěn)定。

      更具體的,所述的制備方法包括如下步驟:

      (1)α-la兩親性肽鏈的合成:

      將一定量的乳白蛋白溶解在pbs溶液中,加入蛋白水解酶,在室溫條件下反應(yīng)并對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行離心、過(guò)濾后,獲得酶解后的乳白蛋白兩親性肽鏈材料;再經(jīng)二硫蘇糖醇處理將肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基,制得反應(yīng)液;

      (2)bodipy-2i-la納米棒的合成:

      將bodipy-2i分子分散在四氫呋喃溶液中,加入步驟(1)制得的反應(yīng)液中,攪拌,靜置一定時(shí)間后,產(chǎn)物經(jīng)離心、洗滌處理,獲得bodipy-2i-la納米棒;

      (3)將bodipy-2i-la納米棒重新分散于去離子水中,然后往溶液中通氧氣,使二硫鍵重新交聯(lián),得到更穩(wěn)定的交聯(lián)化的bodipy-2i-la納米棒。

      步驟(1)中α-乳白蛋白與酶的反應(yīng)質(zhì)量比是25:1。

      步驟(2)中bodipy-2i與α-la的質(zhì)量比是0.04:1~1:1,最優(yōu)選比例是0.2:1。

      步驟(2)中反應(yīng)液與thf的體積比為10:1~5:1,最優(yōu)選比例是10:1。

      步驟(2)中bodipy-2i與la攪拌時(shí)間是10min,攪拌速度是1000rpm,然后靜置反應(yīng)12h。

      步驟(3)中通氧氣氧化時(shí)間是30min。

      一種如上所述的制備方法制得的碘代氟硼二吡咯高負(fù)載率納米棒,其直徑為50±5nm,表面帶負(fù)電,極易分散于水溶液中;bodipy-2i在納米棒中的負(fù)載率隨bodipy-2i與la的反應(yīng)質(zhì)量比不同而變化,其中,bodipy-2i在納米棒中的最高負(fù)載率可達(dá)到97%;與自由的bodipy-2i分子相比,bodipy-2i-la納米棒的單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率更高。

      一種如上所述的光敏劑碘代氟硼二吡咯高負(fù)載率納米棒的應(yīng)用:在ph≤6、gsh濃度為10mm的雙重刺激下,bodipy-2i-la納米棒解離釋放出bodipy-2i,并在一定的光照作用下產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧,實(shí)現(xiàn)光動(dòng)力治療應(yīng)用。

      與其他光動(dòng)力診療劑體系相比,本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:

      (1)本發(fā)明的bodipy-2i-la納米棒制備方法簡(jiǎn)單,條件溫和可控;對(duì)光敏劑bodipy-2i的負(fù)載率可高達(dá)97%,可有效降低治療過(guò)程中藥物載體的使用劑量,達(dá)到減少副作用的目的;

      (2)本發(fā)明的bodipy-2i-la納米棒具有針對(duì)低ph和高gsh雙重刺激響應(yīng)特性;在光照下,與自由的bodipy-2i分子相比,可產(chǎn)生較高濃度的單線(xiàn)態(tài)氧,從而可以高效的抑制癌細(xì)胞;

      (3)本發(fā)明所述的bodipy-2i-la納米棒生物相容性好,易于在腫瘤環(huán)境內(nèi)解離,是可降解型藥物載體。

      附圖說(shuō)明

      圖1為bodipy-2i-la納米棒的tem表征圖;

      圖2為實(shí)施例1制備的bodipy-2i-la納米棒分別在pbs和培養(yǎng)基中的粒徑變化圖;橫坐標(biāo)為時(shí)間,縱坐標(biāo)為粒徑尺寸;

      圖3為按照bodipy-2i和la不同的質(zhì)量比合成的bodipy-2i-la納米棒在體外的單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率變化圖;橫坐標(biāo)為時(shí)間,縱坐標(biāo)為單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率(用i/i0來(lái)評(píng)估,i為初始單線(xiàn)態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值,i0為不同時(shí)間點(diǎn)單線(xiàn)態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值);

      圖4為bodipy-2i和la按照0.2:1的質(zhì)量比合成的bodipy-2i-la納米棒以及不同對(duì)照組的體外單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率變化圖;橫坐標(biāo)為時(shí)間,縱坐標(biāo)為單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率(用i/i0來(lái)評(píng)估,i為初始單線(xiàn)態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值,i0為不同時(shí)間點(diǎn)單線(xiàn)態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值);

      圖5為實(shí)施例1制備的bodipy-2i-la納米棒在不同條件下對(duì)bodipy-2i的釋放圖;橫坐標(biāo)為釋放時(shí)間,縱坐標(biāo)為釋放百分率;

      圖6為考察不同濃度的bodipy-2i-la納米棒的生物相親性;橫坐標(biāo)為bodipy-2i-la濃度,縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率;

      圖7為考察不同組納米棒在未經(jīng)光照及光照后的細(xì)胞抑制圖;橫坐標(biāo)為不同樣品組,縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率。

      具體實(shí)施方式

      下面以具體實(shí)施示例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明,但是不能以此限制本發(fā)明的范圍。

      實(shí)施例1

      一種制備具有高負(fù)載率新型光敏劑的納米棒的方法,具體步驟為:

      1)α-乳白蛋白兩親性多肽鏈的合成:

      取6mgα-乳白蛋白溶解于200μl,ph=7.5,75mmtris-hcl緩沖液中,再加入12μl,0.3u/ml蛋白水解酶,用1ml注射器吸取溶液,于0.22μm聚醚砜針頭式過(guò)濾器過(guò)濾溶液一次,于50℃水浴中加熱20min,離心后取上清液,冷凍干燥,所得產(chǎn)物重新分散在ph=7.5,75mmtris-hcl緩沖液中,從而得到兩親性的多肽鏈溶液;

      2)dtt處理:

      取52μl、1mg/ml二硫蘇糖醇(dtt),將其加入步驟1)所得α-乳白蛋白的兩親性多肽鏈溶液中,1000rpm攪拌10min,使肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基,從而獲得處理液;

      3)bodipy-2i-la納米棒的自組裝:

      將bodipy-2i分散于5mlthf中,加入步驟2)制得的0.5mg/mlα-乳白蛋白兩親性多肽鏈中,其中bodipy-2i與la的質(zhì)量比是0.2:1,室溫?cái)嚢?0min,靜置12h,離心處理后,將沉淀重新分散于去離子水中,通氧氣處理30min,得到bodipy-2i-la納米棒溶液。

      實(shí)施例2

      一種制備具有高負(fù)載率新型光敏劑的納米棒的方法,具體步驟為:

      1)α-乳白蛋白兩親性多肽鏈的合成:

      取6mgα-乳白蛋白溶解于200μl,ph=7.5,75mmtris-hcl緩沖液中,再加入12μl,0.3u/ml蛋白水解酶,用1ml注射器吸取溶液,于0.22μm聚醚砜針頭式過(guò)濾器過(guò)濾溶液一次,于50℃水浴中加熱20min,離心后取上清液,冷凍干燥,所得產(chǎn)物重新分散在ph=7.5,75mmtris-hcl緩沖液中,從而得到兩親性的多肽鏈溶液;

      2)dtt處理:

      取52μl、1mg/ml二硫蘇糖醇(dtt),將其加入步驟1)所得α-乳白蛋白的兩親性多肽鏈溶液中,1000rpm攪拌10min,使肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基,從而獲得處理液;

      3)bodipy-2i-la納米棒的自組裝:

      將bodipy-2i分散于5mlthf中,加入步驟2)制得的0.5mg/mlα-乳白蛋白兩親性多肽鏈中,其中bodipy-2i與la的質(zhì)量比從0.04:1、0.1:1、0.6:1和1:1混合,室溫?cái)嚢?0min,靜置12h,離心處理后,將沉淀重新分散于去離子水中,通氧氣處理30min,得到bodipy-2i-la納米棒溶液。

      實(shí)施例3

      bodipy-2i-la-rgd納米棒的合成:

      將實(shí)施例1制備的bodipy-2i-la納米棒溶液加入rgd分子,bodipy-2i-la納米棒和rgd的質(zhì)量比為2:1,反應(yīng)12h后,離心得到bodipy-2i-la-rgd納米棒。

      性能檢測(cè):

      1、將實(shí)施例1的溶液滴在銅網(wǎng)上,晾干后進(jìn)行tem表征,結(jié)果如圖1所示。從圖1可看出,bodipy-2i-la復(fù)合顆粒的形貌為單分散的納米棒狀,直徑為50±5nm,納米棒長(zhǎng)短不一。

      2、分別取bodipy-2i-la納米棒加入至pbs(ph=7.4)緩沖溶液和培養(yǎng)液中,配制濃度為1mg/ml,混勻,分別于不同時(shí)間取樣測(cè)粒徑變化,結(jié)果如圖2所示。zeta粒度分析儀數(shù)據(jù)表明:在pbs緩沖液和細(xì)胞培養(yǎng)液中,在9天內(nèi),bodipy-2i-la納米棒的粒徑都在80nm左右,由此可知bodipy-2i-la納米棒在一定時(shí)間內(nèi),不會(huì)溶脹及解離,熱穩(wěn)定性良好;另一方面,由于la肽鏈還起到分散劑作用,因此由zeta粒度分析儀得到的光動(dòng)力學(xué)粒徑尺寸會(huì)比tem數(shù)據(jù)偏大。

      3、將bodipy-2i和la按不同的質(zhì)量比從0.04:1、0.1:1、0.2:1、0.6:1、1:1合成bodipy-2i-la納米棒,通過(guò)熒光數(shù)據(jù)分析得bodipy-2i在納米棒中的負(fù)載率分別為64%、77%、83%、96%、97%??疾熵?fù)載率不同時(shí),納米棒在光照下單線(xiàn)態(tài)氧變化情況。取不同質(zhì)量比合成的納米棒(所含bodipy-2i的濃度均為5μm)與100μmdpbf均勻混合,加水至總體積為1ml,用波長(zhǎng)為518nm,功率為80mw/cm2的燈照射,在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)單線(xiàn)態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值。測(cè)試結(jié)果如圖3所示,當(dāng)納米棒中bodipy-2i濃度相同時(shí)(均為5μm),不同負(fù)載率的bodipy-2i-la納米棒單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率幾乎相同,沒(méi)有太大差別,這進(jìn)一步說(shuō)明bodipy-2i在la形成的膠束棒中是以自由分散的單分子形式存在,而不是聚集狀態(tài),因而高負(fù)載率不影響單線(xiàn)態(tài)氧的產(chǎn)生。同時(shí)也說(shuō)明可以通過(guò)提高bodipy-2i的負(fù)載率,減少bodipy-2i-la納米棒載體的使用劑量,達(dá)到降低副作用的目的。

      4、取0.014mg/ml納米棒(所含bodipy-2i濃度為5μm)與100μmdpbf均勻混合,加水至總體積為1ml。用波長(zhǎng)為518nm,功率為80mw/cm2的燈照射,在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)單線(xiàn)態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值;對(duì)照組為dpbf及單獨(dú)bodipy-2i+dpbf,用同樣實(shí)驗(yàn)條件照射,測(cè)試結(jié)果如圖4所示。i/i0的值越小,表明單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率越高。由圖可知bodipy-2i-la納米棒比自由的bodipy-2i分子單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生率顯著提高,這主要是因?yàn)閎odipy-2i分子是疏水性,在水溶液中易因?yàn)棣?π堆積作用聚集成二聚體或低聚體,從而影響單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生;而bodipy-2i分子在納米棒中是單分散而不是聚集狀態(tài)存在,且bodipy-2i-la納米棒在水中分散性很好,在光照作用下緩慢的釋放bodipy-2i,從而有比較高的單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生。

      5、將實(shí)施例1制得的bodipy-2i-la納米棒分散到不同條件下(ph=7.4,ph=7.4+10mmgsh,ph=5.0,ph=5.0+10mmgsh)的溶液中,置于37℃下避光保存,于不同的時(shí)間點(diǎn)取樣離心。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)528nm處紫外吸收值,并根據(jù)bodipy-2i標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算分析不同條件下的釋放情況。如圖5所示,在ph=7.4緩沖液中,bodipy-2i的釋放百分比僅為18%,說(shuō)明經(jīng)過(guò)通氧交聯(lián)后的bodipy-2i-la納米棒很穩(wěn)定;而在ph=7.4+10mmgsh條件下,bodipy-2i的釋放量達(dá)到71.5%,說(shuō)明高gsh可以有效解離bodipy-2i-la納米棒結(jié)構(gòu),從而釋放出bodipy-2i。另一方面,在ph=5.0緩沖液中,bodipy-2i的釋放百分比為60%,說(shuō)明酸性也可以誘導(dǎo)bodipy-2i-la納米棒結(jié)構(gòu)發(fā)生解離;而在ph=5.0+10mmgsh條件下,bodipy-2i的釋放百分比增加到88%,說(shuō)明經(jīng)低ph及高gsh的雙重刺激,bodipy-2i-la納米棒結(jié)構(gòu)迅速發(fā)生解離,從而釋放出更多的bodipy-2i。

      6、用hela細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞考察bodipy-2i-la納米棒的生物相親性實(shí)驗(yàn):取已消化成單分散的hela細(xì)胞懸濁液用培養(yǎng)液稀釋?zhuān)?00μl/孔的密度接種到96孔板,每孔的細(xì)胞個(gè)數(shù)控制約為105個(gè)。將96孔板置于37℃,5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,移去培養(yǎng)液,加入含有不同濃度bodipy-2i-la納米棒培養(yǎng)液,每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)4h后,移去培養(yǎng)液,用pbs緩沖液(ph=7.4)清洗兩次,加入100μl培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h后,每孔分別加入10μl濃度為5mg/ml的mtt,繼續(xù)孵育4h,小心移去培養(yǎng)液,加入150μldmso,37oc培養(yǎng)15min,震蕩均勻后,在酶標(biāo)儀上測(cè)490nm處的吸收值,計(jì)算細(xì)胞存活率。圖6顯示當(dāng)bodipy-2i-la納米棒的濃度在12μg/ml以?xún)?nèi),其生物相親性較好,達(dá)到80%以上,因此可以選擇bodipy-2i-la納米棒的濃度為1-12μg/ml,作光動(dòng)力治療劑應(yīng)用。

      7、用hela細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞考察bodipy-2i-la納米棒的光動(dòng)力抑制效果。取已消化成單分散的hela細(xì)胞懸濁液用培養(yǎng)液稀釋?zhuān)?00μl/孔的密度接種到96孔板,每孔的細(xì)胞個(gè)數(shù)控制約為105個(gè),每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔作為重復(fù)組。將96孔板置于37℃,5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,移去孔中培養(yǎng)液,分別加入1、control2、freebodipy-2i3、bodipy-2i-la4、bodipy-2i-la-rgd組,其中bodipy-2i的濃度均為1.0μg/ml,bodipy-2i-la納米棒的濃度均為6.0μg/ml,另外設(shè)如上四組加波長(zhǎng)為528nm,80mw/cm2照射10min。培養(yǎng)4h后,移去培養(yǎng)液,用pbs緩沖液清洗兩次,加入100μl培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h后,每孔分別加入10μl濃度為5mg/ml的mtt,繼續(xù)孵育4h,移去培養(yǎng)液,加入150μldmso,37℃培養(yǎng)15min,振蕩均勻后,在酶標(biāo)儀上測(cè)490nm處的吸收值,計(jì)算細(xì)胞存活率。從圖7可以看出光照組比無(wú)光照組的細(xì)胞死亡率要高,bodipy-2i-la組經(jīng)光照后對(duì)hela細(xì)胞的抑制率為70%,有靶分子修飾的bodipy-2i-la-rgd組對(duì)細(xì)胞的抑制率可達(dá)到85%,說(shuō)明該體系可以有效的用于腫瘤細(xì)胞的光動(dòng)力治療。

      以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例,凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾,皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

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