本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種功能化的多孔鈦金屬骨植入材料及其制備方法。

背景技術(shù)：

創(chuàng)傷和疾病等造成的骨缺損給患者造成巨大痛苦。在骨損傷修復(fù)和功能重建中，由醫(yī)用金屬材料制備的骨骼內(nèi)植物，比如醫(yī)用金屬螺釘、人工關(guān)節(jié)、口腔種植體等在骨缺損修復(fù)和功能重建中發(fā)揮著不可替代的作用。骨植入物與宿主骨組織良好整合并維持長期穩(wěn)固對患者的臨床預(yù)后十分關(guān)鍵，而植入物的穩(wěn)定性取決于材料的骨整合效果。研究顯示，骨植入物金屬材料的多孔結(jié)構(gòu)由于具有能降低金屬的彈性模量，減小材料與骨界面的應(yīng)力屏障，從而促進材料的骨整合等優(yōu)點，被認為是未來骨植入物材料設(shè)計和制備的大趨勢。醫(yī)用材料的多孔結(jié)構(gòu)需要人工設(shè)計和精確的結(jié)構(gòu)制備，而這方面技術(shù)方案尚待改進。

患者的骨骼結(jié)構(gòu)存在個體差異，不同部位骨骼也存在形態(tài)差異，骨缺損常常形態(tài)不規(guī)則，因而骨植入物需要形成相匹配的外形和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。這使得根據(jù)患者的具體情況精確設(shè)計和制備個體化的骨骼植入物成為醫(yī)學(xué)發(fā)展的大趨勢，也是數(shù)字醫(yī)學(xué)、精準醫(yī)學(xué)和生物材料相關(guān)領(lǐng)域的研究重點。另一方面，有研究證明，多孔植入物內(nèi)部不同大小的梯度孔隙設(shè)計，能有效優(yōu)化其多方面的性能，而孔隙結(jié)構(gòu)的精確設(shè)計和制備則是技術(shù)前提。

3d打印技術(shù)是一種融合近凈成形和增材制造的新技術(shù)，近年來取得了快速發(fā)展，它可以完成復(fù)雜植入物的一次成形，因此可以完成一些傳統(tǒng)制造工藝無法完成的設(shè)計，精確制作出更復(fù)雜的材料結(jié)構(gòu)。其有望解決材料結(jié)構(gòu)精確設(shè)計和制備的難題，也為個性化醫(yī)療提供了契機。鈦及其合金是醫(yī)療中應(yīng)用最多最可靠的材料之一，尤其在骨骼植入物材料領(lǐng)域始終是最佳選擇。近年來隨著材料3d打印技術(shù)的不斷發(fā)展，通過3d打印制備結(jié)構(gòu)精確定制的多孔金屬植入物材料受到越來越多的重視。然而，3d打印鈦植入物還面臨兩方面問題：一、鈦金屬材料本身的材料惰性使得骨組織在材料表面的再生和骨質(zhì)沉積不佳，從而造成骨與材料的直接結(jié)合不夠牢固；二、材料設(shè)計成多孔結(jié)構(gòu)的主要目之一是為了促進骨組織通過孔隙向材料內(nèi)部長入，然而現(xiàn)有方案制備的多孔植入物材料在體內(nèi)的骨長入效果始終不夠好，是一個待解決難題。

目前尚無在3d打印多孔鈦金屬孔隙中制備材料表面顯微結(jié)構(gòu)的骨植入物材料優(yōu)化方案。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種功能化的多孔鈦金屬骨植入材料及其制備方法，該材料能夠有效提高多孔材料的骨長入和材料表面的骨質(zhì)沉積，從而提高骨植入物的骨整合效果和穩(wěn)固性。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種功能化多孔鈦金屬骨植入材料，所述的功能化的多孔鈦金屬骨植入材料由多孔鈦金屬基體和填充于多孔鈦金屬基體孔隙中的仿生礦化絲素蛋白材料組成。其中，多孔鈦金屬基體由鈦金屬顆粒通過3d打印技術(shù)制得，絲素蛋白材料采用鈣磷酸鹽礦化的絲素蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的多孔鈦金屬基體材料采用純鈦或醫(yī)用鈦合金粉末通過3d打印制備而成，基體材料化學(xué)成分為ti6al4v合金或純ti。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述多孔金屬材料孔隙率為60％～80％，彈性模量小于10gpa，孔隙直徑為100～1000μm；可根據(jù)所需制備的不同植入物種類進行選擇。比如制備骨骼骨折固定用金屬螺釘時可選200μm的較小孔隙。

作為可選方式，用于3d打印的金屬原材料粉末直徑為10～50μm?？筛鶕?jù)臨床需要制備的具體植入物種類進行優(yōu)化選擇，比如對脊柱螺釘可選直徑為10μm的小粉末，對于人工關(guān)節(jié)的制備可選50μm的較大粉末。

優(yōu)選地，3d打印技術(shù)為電子束熔融3d打印、激光3d打印等所有能制備多孔金屬材料的3d打印技術(shù)。

優(yōu)選地，本發(fā)明所用多孔鈦金屬基體表面呈復(fù)合微納米雙重顯微結(jié)構(gòu)(即凹凸不平的微米結(jié)構(gòu)及微米結(jié)構(gòu)表面的納米管)，復(fù)合微納米雙重顯微結(jié)構(gòu)由微米坑和管徑為15～100nm的納米管陣列構(gòu)成。其中，微米結(jié)構(gòu)為凹凸不平的微米坑；

優(yōu)選地，納米管采用二氧化鈦納米管，二氧化鈦納米管的直徑為15～50nm；更優(yōu)選地，二氧化鈦納米管的直徑為15nm。

本發(fā)明所用的鈣磷酸鹽礦化的絲素蛋白為絲素蛋白纖維上沉積了鈣磷酸鹽晶體，其本身為一種具有不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料。優(yōu)選地，鈣磷酸鹽與絲素蛋白的干重比例為1:3～8；更優(yōu)選地，此比例為1:5。

本發(fā)明還公開了上述功能化的多孔鈦金屬骨植入材料的制備方法，包括以下步驟：

1)根據(jù)需求制備個體化定制的3d打印多孔鈦金屬基體，且在多孔鈦金屬基體表面制備微納米結(jié)構(gòu)；

2)制備含鈣絲素蛋白；

3)將含鈣絲素蛋白填充于多孔鈦金屬基體的孔隙中，再進行磷酸鹽礦化處理，最后經(jīng)冷凍干燥，制得功能化的多孔鈦金屬骨植入材料。

具體地，步驟1)具體操作為：

首先，采集患者的ct圖像數(shù)據(jù)，在三維圖像軟件中設(shè)計出個體化定制的多孔植入物的外形和內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)；設(shè)計桿件寬度為100～800μm，孔隙直徑為100～1000μm，以正方體或正十二面體結(jié)構(gòu)單位填充和擴展圖像，得到目標植入物的三維圖像，將該目標植入物的三維圖像文件導(dǎo)入金屬材料3d打印機，以多孔鈦金屬材料為原料，制得多孔鈦金屬基體；優(yōu)選地，制得的多孔鈦金屬基體經(jīng)過酒精、丙酮和蒸餾水超聲清洗，每種洗滌液中清洗15～20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或者自然晾干后，備用。

其次，將制得的多孔鈦金屬基體浸入氫氟酸溶液中酸蝕處理，使其表面形成微米坑結(jié)構(gòu)；優(yōu)選地，所用氫氟酸溶液的濃度為50g/l，酸蝕處理時間為30～60min；陽極氧化電壓為1～20v，處理時間為1h。

最后，在含有磷酸和氫氟酸的電解液中陽極氧化處理1h，電壓設(shè)定為1～20v，在微米坑結(jié)構(gòu)表面形成管徑約為15～100nm的納米管陣列，即在多孔鈦金屬基體表面制得微米和納米級的復(fù)合微納米雙重顯微結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，多孔鈦金屬材料的直徑為20～50μm；3d打印多孔鈦金屬的桿件寬度為100～800μm，孔隙直徑為100～1000μm。

步驟2)具體操作為：

首先，按絲素蛋白的干重與材料內(nèi)部孔隙總體積(可以根據(jù)三維圖像數(shù)據(jù)估算需要填充的多孔金屬材料的孔隙總體積)的比例稱取對應(yīng)量的絲素蛋白，將絲素蛋白加入9.3mol/l的libr溶液中，在60℃下恒溫處理使其充分溶解，用去離子水透析72h去除溶液中的libr，制備得質(zhì)量體積比為3％～6％絲素蛋白溶液；稱取絲素蛋白的干重與多孔材料內(nèi)部孔隙總體積的比例為0.1～0.3g：1cm³；透析時間大于等于72h；

其次，向絲素蛋白溶液中加入絲素蛋白干重質(zhì)量5％的cacl2，攪拌使其溶解，混合均勻，制得含鈣絲素蛋白溶液。

步驟3)具體操作為：

將含鈣絲素蛋白溶液從上方緩慢滴加在步驟1)制得的多孔鈦金屬基體表面，使溶液通過孔隙間的相互連通在材料內(nèi)充分擴散均勻，滴加的量以溶液剛好充滿孔隙為準，然后靜置處理12～24h，使含鈣絲素蛋白溶液在材料孔隙內(nèi)形成水凝膠；將水凝膠材料浸沒于na2hpo4的水溶液中，于37℃下恒溫靜置48h以上，使絲素蛋白水凝膠內(nèi)的鈣離子與溶液中的磷酸根離子形成磷酸鈣鹽，并結(jié)晶于絲素蛋白纖維上，得到復(fù)合材料，再將該復(fù)合材料真空冷凍干燥，制得功能化的多孔鈦金屬骨植入材料。

優(yōu)選地，na2hpo4水溶液的濃度為10～18mm，ph＝8.5；復(fù)合材料在na2hpo4水溶液中靜置的時間為72h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明公開的功能化的多孔鈦金屬骨植入材料，由多孔鈦金屬基體和填充于多孔鈦金屬基體孔隙中的絲素蛋白材料組成；其中，多孔鈦金屬基體由鈦金屬顆粒通過3d打印制得；絲素蛋白材料中為鈣磷酸鹽礦化的絲素蛋白(絲素蛋白和蛋白纖維表面結(jié)合上的鈣磷酸鹽是兩種物質(zhì)，“礦化”指的就是無機鹽在絲素蛋白纖維表面結(jié)晶)。絲素蛋白與鈣磷酸鹽晶體形成的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)本身具有“多孔人工仿生骨”的性質(zhì)：絲素蛋白的本質(zhì)是纖維蛋白，相當于骨質(zhì)中的有機成分——膠原纖維，而鈣磷酸鹽本身就是骨質(zhì)的主要無機成分，兩者的結(jié)合方式類似天然骨質(zhì)中羥基磷灰石晶體與一型膠原的結(jié)合方式。因此，本發(fā)明將鈣磷酸鹽礦化的絲素蛋白微孔材料復(fù)合于多孔金屬孔隙內(nèi)，可為骨組織細胞在孔隙內(nèi)的粘附提供良好的微環(huán)境，誘導(dǎo)骨組織向孔隙內(nèi)快速長入，從而解決多孔金屬材料骨長入不佳的問題，促進多孔鈦金屬植入物材料與骨的良好整合和長期穩(wěn)固。

進一步地，本發(fā)明的多孔鈦金屬基體表面呈復(fù)合微納米雙重顯微結(jié)構(gòu)，復(fù)合微納米雙重顯微結(jié)構(gòu)由微米結(jié)構(gòu)和微米結(jié)構(gòu)表面的納米管構(gòu)成。將微米級和納米級表面形貌的優(yōu)點和功效融合在一起，形成表面材料功能層，可有效降低鈦金屬材料的生物惰性，提高其組織兼容性；為成骨細胞等多種參與骨再生過程的細胞在金屬表面的粘附提供更好的微環(huán)境，適宜尺寸的鈦納米微管可通過細胞膜上的粘附分子等對細胞內(nèi)的代謝進程產(chǎn)生影響，改善材料-骨界面細胞的應(yīng)激狀態(tài)，促進細胞的功能發(fā)揮和材料表面骨質(zhì)沉積，從而最終促進金屬植入物材料與骨之間形成更牢固的直接結(jié)合。

本發(fā)明公開的功能化的多孔鈦金屬骨植入材料的制備方法，整個過程條件溫和，能有效保持絲素蛋白等組分的天然原有屬性，且不會產(chǎn)生有害的副產(chǎn)物，生物安全性高。

附圖說明

圖1為實施例1中利用3d打印制備的多孔鈦合金材料基體。

圖2為實施例1中最后制備得的功能化多孔鈦金屬骨植入物材料的照片。

圖3為實施例1中制備得的復(fù)合材料的掃描電鏡照片(微觀)，顯示了孔隙中填充的磷酸鈣鹽礦化絲素蛋白。

圖4為實施例4中不同材料對材料表面成骨細胞細胞增殖的影響。

圖5為實施例4中不同材料對材料表面成骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶酶活性(成骨分化程度)的影響。

圖6為實施例5中不同骨植入材料植入兔股骨髁部后6周材料的骨結(jié)合分數(shù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

附圖中數(shù)據(jù)都是平均數(shù)±標準差；*代表和普通鈦片組(普通醫(yī)用實心鈦金屬材料)相比，數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明公開了一種功能化多孔鈦金屬骨植入物材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：制備個體化定制的3d打印鈦金屬骨植入物材料基體。

采集患者的ct圖像數(shù)據(jù)，在三維圖像軟件cad中分析和設(shè)計出個體化的目標植入物材料外形和內(nèi)部孔隙大小。以正方體或正六面體結(jié)構(gòu)單位填充和擴展該圖像，得到目標植入物的三維圖像。將該三維圖像文件導(dǎo)入金屬材料3d打印機，以ti6al4v合金或純ti金屬微球狀粉末為原材料，3d打印制備得外形和孔隙結(jié)構(gòu)與設(shè)計圖形完全一致的多孔金屬植入物。多孔金屬植入物材料經(jīng)過酒精、丙酮和蒸餾水超聲清洗，每種洗滌液中20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或自然晾干備用。

步驟二：多孔鈦金屬表面微納米結(jié)構(gòu)的制備。

多孔鈦金屬材料基體浸入氫氟酸酸蝕處理，使其表面形成微米坑結(jié)構(gòu)；然后在含有磷酸和氫氟酸的電解液中陽極氧化，通過調(diào)節(jié)陽極氧化電壓，在微米坑形貌表面形成特定管徑的納米管陣列。從而在金屬基體材料表面形成微米和納米級的雙重顯微結(jié)構(gòu)。

步驟三：制備絲素蛋白溶液。

根據(jù)三維圖像數(shù)據(jù)估算需要填充的多孔金屬材料的孔隙總體積。稱取適量絲素蛋白，加入9.3m的libr溶液在60℃恒溫4h使絲素蛋白充分溶解，之后對去離子水透析以除去溶液中的libr，制備得質(zhì)量體積比為3～6％的絲素蛋白溶液，備用。

步驟四：在多孔金屬材料孔隙內(nèi)復(fù)合含鈣離子的絲素蛋白水凝膠。

向步驟三制備好的絲素蛋白溶液中加入適量cacl2，混合均勻。將該溶液從上方緩慢滴加在干燥的多孔鈦金屬基體上，使溶液通過孔隙間的相互連通在材料內(nèi)充分均勻擴散，滴加的量以溶液剛好充滿孔隙為準。將此復(fù)合材料放入50℃烘箱靜置12-24h，使含鈣絲素蛋白溶液在材料孔隙內(nèi)形成水凝膠。

步驟五：磷酸鈣鹽在絲素蛋白纖維上的礦化沉積。

將步驟四制備的材料浸沒在含na2hpo4水溶液中，37℃恒溫靜置超過48h，使絲素蛋白水凝膠內(nèi)的鈣離子與溶液中的磷酸根離子形成磷酸鈣鹽，并結(jié)晶于絲素蛋白纖維上。再將此復(fù)合材料在真空冷凍干燥機內(nèi)冷凍干燥48h，最終制備得表面具有微納米形貌并在孔隙中復(fù)合了磷酸鈣鹽礦化絲素蛋白的3d打印多孔鈦金屬骨植入物材料。

實施例1

1.制備個體化定制的3d打印鈦合金內(nèi)植物材料

(1)采集患者骨缺損部位的ct圖像數(shù)據(jù)，導(dǎo)入三維圖像軟件cad中，根據(jù)患者具體情況分析和設(shè)計出個體化的目標內(nèi)植物材料的外形和內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)。其中，桿件寬度為200μm，平均孔隙直徑為400μm，以正方體結(jié)構(gòu)單位填充和擴展該圖像，得到目標內(nèi)植物的三維圖像。

(2)將該三維圖像文件導(dǎo)入電子束熔融(ebm)金屬材料3d打印機，利用直徑為30μm的ti6al4v合金粉末，通過3d打印制備得個體化定制的多孔金屬內(nèi)植物，參見圖1。

(3)多孔金屬內(nèi)植物材料經(jīng)過酒精、丙酮和蒸餾水超聲清洗，每種洗滌液中20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或自然晾干備用。

2.多孔鈦合金材料表面制備微納米顯微結(jié)構(gòu)

(1)步驟1中制備的多孔鈦金屬材料浸入50g/l的氫氟酸酸蝕處理30min，使其表面形成微米坑結(jié)構(gòu)。

(2)然后在含有磷酸和氫氟酸的電解液中陽極氧化1h，電壓設(shè)定為7.5v，在微米坑結(jié)構(gòu)表面形成管徑約為20nm的納米管陣列。從而在金屬基體材料表面形成微米和納米級的復(fù)合雙重顯微結(jié)構(gòu)。

3.制備絲素蛋白溶液

根據(jù)三維圖像數(shù)據(jù)估算需要填充的多孔金屬材料的孔隙總體積。按絲素蛋白干重與材料內(nèi)部孔隙總體積的比例為0.2g：1cm³的比例稱取絲素蛋白。用去離子水配置9.3m的libr溶液用于溶解絲素蛋白。在適宜大小的離心管中加入絲素蛋白質(zhì)量5倍體積的的libr溶液，絲素蛋白完全沒入其中，60℃恒溫4h，使絲素蛋白完全溶解于溶液中。再用截留分子量為3500d的適宜大小的透析袋將該溶液對去離子水進行透析，共72h，以除去溶液中的libr。透析完成后12000rmp/min轉(zhuǎn)速離心20min，取上清，得到質(zhì)量體積比為3～6％的絲素蛋白溶液，備用。

4.在多孔金屬材料孔隙內(nèi)復(fù)合含鈣離子的絲素蛋白水凝膠。

向絲素蛋白溶液中按5wt％的比例加入cacl2，攪拌使其溶解，混合均勻。將該溶液從上方緩慢滴加在干燥的多孔鈦金屬基體上，使溶液通過孔隙間的相互連通在材料內(nèi)充分均勻擴散，滴加的量以溶液剛好充滿孔隙為準。將此復(fù)合材料放入50℃烘箱靜置12h，使含鈣絲素蛋白溶液在材料孔隙內(nèi)形成水凝膠。

5.磷酸鈣鹽在絲素蛋白纖維上的礦化沉積。

將步驟4制備的材料浸沒在18mmna2hpo4水溶液(ph＝8.5)中，37℃恒溫靜置72h，使絲素蛋白水凝膠內(nèi)的鈣離子與溶液中的磷酸根離子形成磷酸鈣鹽，并結(jié)晶于絲素蛋白纖維上。再將此復(fù)合材料在真空冷凍干燥機內(nèi)，真空室中壓力值低于1pa，溫度為-20℃，冷凍干燥48h，最終制備得表面具有微納米形貌并在孔隙中復(fù)合了磷酸鈣鹽礦化絲素蛋白的3d打印多孔鈦合金骨植入物材料，參見圖2和圖3。由圖3可見，多孔材料孔隙內(nèi)填充的磷酸鹽礦化絲素蛋白呈現(xiàn)大小不同層級的疏松多孔結(jié)構(gòu)，不僅利于成骨細胞等參與骨再生細胞的粘附和增殖，還可有效吸附體液中的活性蛋白成分，為局部組織再生提供良好的微環(huán)境，利于新生骨組織向孔隙內(nèi)長入，促進材料的骨整合。

實施例2

1.制備個體化定制的3d打印純鈦金屬骨植入物材料

(1)采集患者骨缺損部位的ct圖像數(shù)據(jù)，導(dǎo)入三維圖像軟件cad中，根據(jù)患者具體情況分析和設(shè)計出個體化的目標內(nèi)植物材料的外形和內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)。其中，桿件寬度為200μm，平均孔隙直徑為400μm，以正十二面體結(jié)構(gòu)單位填充和擴展該圖像，得到目標內(nèi)植物的三維圖像。

(2)將該三維圖像文件導(dǎo)入電子束熔融(ebm)金屬材料3d打印機，利用直徑約為30μm的純鈦金屬粉末，通過3d打印制備得個體化定制的多孔純鈦金屬材料。

(3)多孔純鈦金屬材料經(jīng)過酒精、丙酮和蒸餾水超聲清洗，每種洗滌液中20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或自然晾干備用。

2.多孔鈦合金材料表面制備微納米顯微結(jié)構(gòu)

(1)步驟1中制備的多孔純鈦金屬材料浸入50g/l的氫氟酸酸蝕處理30min，使其表面形成微米坑結(jié)構(gòu)。

(2)然后在含有磷酸和氫氟酸的電解液中陽極氧化1h，電壓設(shè)定為7.5v，在微米坑結(jié)構(gòu)表面形成管徑約為20nm的納米管陣列。從而在金屬基體材料表面形成微米和納米級的復(fù)合雙重顯微結(jié)構(gòu)。

3.制備絲素蛋白溶液

根據(jù)三維圖像數(shù)據(jù)估算需要填充的多孔金屬材料的孔隙總體積。按絲素蛋白干重與材料內(nèi)部孔隙總體積的比例為0.2g：1cm³的比例稱取絲素蛋白。用去離子水配置9.3m的libr溶液用于溶解絲素蛋白。在適宜大小的離心管中加入絲素蛋白質(zhì)量5倍體積的的libr溶液，絲素蛋白完全沒入其中，60℃恒溫4h，使絲素蛋白完全溶解于溶液中。再用截留分子量為3500d的適宜大小的透析袋將該溶液對去離子水進行透析，共72h，以除去溶液中的libr。透析完成后12000rmp/min轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取上清，得到質(zhì)量體積比為3～6％的絲素蛋白溶液，備用。

4.在多孔純鈦金屬材料孔隙內(nèi)復(fù)合含鈣離子的絲素蛋白水凝膠。

向絲素蛋白溶液中按5wt％的比例加入cacl2，攪拌使其溶解，混合均勻。將該溶液從上方緩慢滴加在干燥的多孔鈦金屬基體上，使溶液通過孔隙間的相互連通在材料內(nèi)充分均勻擴散，滴加的量以溶液剛好充滿孔隙為準。將此復(fù)合材料放入50℃烘箱靜置12h，使含鈣絲素蛋白溶液在材料孔隙內(nèi)形成水凝膠。

5.磷酸鈣鹽在絲素蛋白纖維上的礦化沉積。

將步驟4制備的材料浸沒在含18mmna2hpo4的水溶液(ph＝8.5)中，37℃恒溫靜置72h，使絲素蛋白水凝膠內(nèi)的鈣離子與溶液中的磷酸根離子形成磷酸鈣鹽，并結(jié)晶于絲素蛋白纖維上。再將此復(fù)合材料在真空冷凍干燥機內(nèi)，真空室中壓力值低于1pa，溫度為-20℃，冷凍干燥48h，最終制備得表面具有微納米形貌并在孔隙中復(fù)合了磷酸鈣鹽礦化絲素蛋白的3d打印多孔純鈦金屬骨植入物材料。

實施例3

1.制備個體化定制的3d打印鈦合金骨植入物材料

(1)采集患者骨缺損部位的ct圖像數(shù)據(jù)，導(dǎo)入三維圖像軟件cad中，根據(jù)患者具體情況分析和設(shè)計出個體化的目標內(nèi)植物材料的外形和內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)。其中，桿件寬度為400μm，平均孔隙直徑為800μm，以正十二面體結(jié)構(gòu)單位填充和擴展該圖像，得到目標內(nèi)植物的三維圖像。

(2)將該三維圖像文件導(dǎo)入激光金屬材料3d打印機，利用直徑約為40μm的純鈦金屬粉末，通過3d打印制備得個體化定制的多孔純鈦金屬材料。

(3)多孔鈦合金材料經(jīng)過酒精、丙酮和蒸餾水超聲清洗，每種洗滌液中20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或自然晾干備用。

2.多孔鈦合金材料表面制備微納米顯微結(jié)構(gòu)

(1)步驟1中制備的多孔鈦合金材料浸入50g/l的氫氟酸酸蝕處理30min，使其表面形成微米坑結(jié)構(gòu)。

(2)然后在含有磷酸和氫氟酸的電解液中陽極氧化1h，電壓設(shè)定為10v，在微米坑結(jié)構(gòu)表面形成管徑約為30nm的納米管陣列。從而在金屬基體材料表面形成微米和納米級的復(fù)合雙重顯微結(jié)構(gòu)。

3.制備絲素蛋白溶液

根據(jù)三維圖像數(shù)據(jù)估算需要填充的多孔金屬材料的孔隙總體積。按絲素蛋白干重與材料內(nèi)部孔隙總體積的比例為0.2g：1cm³的比例稱取絲素蛋白。用去離子水配置9.3m的libr溶液用于溶解絲素蛋白。在適宜大小的離心管中加入絲素蛋白質(zhì)量5倍體積的的libr溶液，絲素蛋白完全沒入其中，60℃恒溫4h，使絲素蛋白完全溶解于溶液中。再用截留分子量為3500d的適宜大小的透析袋將該溶液對去離子水進行透析，共72h，以除去溶液中的libr。透析完成后12000rmp/min轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取上清，得到質(zhì)量體積比為3～6％的絲素蛋白溶液，備用。

4.在多孔金屬材料孔隙內(nèi)復(fù)合含鈣離子的絲素蛋白水凝膠。

向絲素蛋白溶液中按5wt％的比例加入cacl2，攪拌使其溶解，混合均勻。將該溶液從上方緩慢滴加在干燥的多孔鈦金屬基體上，使溶液通過孔隙間的相互連通在材料內(nèi)充分均勻擴散，滴加的量以溶液剛好充滿孔隙為準。將此復(fù)合材料放入50℃烘箱靜置18h，使含鈣絲素蛋白溶液在材料孔隙內(nèi)形成水凝膠。

5.磷酸鈣鹽在絲素蛋白纖維上的礦化沉積。

將步驟4制備的材料浸沒在含12mmna2hpo4的水溶液(ph＝8.5)中，37℃恒溫靜置72h，使絲素蛋白水凝膠內(nèi)的鈣離子與溶液中的磷酸根離子形成磷酸鈣鹽，并結(jié)晶于絲素蛋白纖維上。再將此復(fù)合材料在真空冷凍干燥機內(nèi)，真空室中壓力值低于1pa，溫度為-20℃，冷凍干燥48h，最終制備得表面具有微納米形貌并在孔隙中復(fù)合了磷酸鈣鹽礦化絲素蛋白的3d打印多孔鈦合金骨植入物材料。

實施例4評估功能化多孔鈦合金骨植入物材料對成骨細胞細胞功能的影響

本實施例將實施例1中所制備的功能化多孔鈦合金骨植入材料對骨組織再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細胞——成骨細胞——細胞功能的影響，即給出該材料對成骨細胞的細胞增殖和成骨分化的提升作用。

實驗方法：以普通的實心醫(yī)用鈦合金金屬片為對照組材料，以實施例1中所制備的功能化多孔鈦合金骨植入物材料為實驗組材料，將各組材料在同等條件下在酒精、去離子水兩種液體中分別超聲清洗10分鐘，室溫自然晾干，之后利用c60射線照射1小時滅菌。利用分離培養(yǎng)的sd大鼠乳鼠顱骨的成骨細胞，將其按1×10⁴個/毫升的細胞密度在每個材料上接種5×10⁴個細胞，利用含10％fbs的dmem細胞培養(yǎng)基，于12孔細胞培養(yǎng)板中進行材料與細胞的共培養(yǎng)。

分為2組：

1)普通鈦片組

2)功能化多孔鈦合金骨植入物材料組

培養(yǎng)的第3和第7天，用mtt法檢測不同環(huán)境中成骨細胞細胞增殖活力的差異；培養(yǎng)的第7天，用堿性磷酸酶(alp)酶活力檢測試劑盒檢測材料成骨細胞成骨分化程度(alp活性反應(yīng)成骨分化程度)，評價不同環(huán)境對成骨細胞成骨分化狀態(tài)的影響。

結(jié)果參見圖4和圖5：與普通鈦片上的細胞相比，功能化多孔鈦合金骨植入材料上的細胞細胞增殖在第3和第7天分別提高了63％和69％(圖4)，而alp酶活性則是前者的1.51倍(圖5)，兩組間數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

結(jié)果分析：上述結(jié)果表明，按本發(fā)明所述技術(shù)方案制備的功能化多孔鈦合金骨植入材料對成骨細胞的細胞增殖和成骨分化功能有明顯促進作用，因而能有效促進材料周圍的骨再生和材料的骨整合。

實施例5功能化多孔鈦合金骨植入材料對體內(nèi)骨再生和材料骨整合效果的提升作用

將實施例1中所制備的功能化多孔鈦合金骨植入材料對糖尿病動物體內(nèi)的材料周圍骨再生和材料骨整合效果的促進作用。

實驗方法：將四氧嘧啶(stz)50mg/kg尾靜脈注射于體重約3.5kg的雄性新西蘭白兔，每天1次，連續(xù)3天。最后一次注射后7天，測空腹血糖，空腹血糖>300mg/dl為糖尿病動物，用于后續(xù)試驗。取形態(tài)大小完全相同(直徑10mm、厚3mm的圓餅狀)的普通實心醫(yī)用鈦合金材料和實施例一中所制備的功能化多孔鈦合金骨植入材料，在外科手術(shù)條件下，植入兔雙側(cè)股骨髁部植入。動物隨機分為2組，每組12只：

1)普通鈦片組；

2)功能化多孔鈦合金骨植入材料組。

材料植入后6周取材，取植入了材料的股骨標本，標本經(jīng)4％甲醛固定3天后用顯微ct掃描(ge公司)檢測。利用顯微ct掃描數(shù)據(jù)計算骨植入物的骨結(jié)合分數(shù)，評價各組鈦合金材料周圍骨再生情況和材料骨整合效果。

結(jié)果如圖6所示：在骨結(jié)合分數(shù)上，與普通的醫(yī)用實心鈦合金的55.4％相比，多孔鈦合金骨植入材料的提高到了71.3％，組間數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。

結(jié)果分析：上述結(jié)果說明，本發(fā)明制備的功能化多孔鈦合金骨植入材料能有效促進體內(nèi)骨植入物周圍和材料空隙內(nèi)的骨再生，提升材料的骨整合效果，從而增強金屬骨植入物的穩(wěn)定性。

綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)勢明顯：

1、本發(fā)明為了提高多孔材料孔隙內(nèi)的骨長入效果，在多孔材料孔隙內(nèi)形成良好的化學(xué)和結(jié)構(gòu)微環(huán)境，從而誘導(dǎo)和促進骨組織的新生和向孔隙內(nèi)長入，需要在孔隙內(nèi)復(fù)合數(shù)量、結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分都適宜的功能性活性材料。本發(fā)明選擇的絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然纖維蛋白，含有18種氨基酸，其中的11種為人體必需氨基酸。絲素蛋白本身具有良好的機械性能和理化性質(zhì)，如良好的柔韌性和抗拉伸強度、透氣透濕性、緩釋性等，而且經(jīng)過不同處理可以得到不同的形態(tài)，如纖維、溶液、粉、膜以及凝膠等。絲素蛋白來源豐富、易于加工和修飾，安全無毒，可在體內(nèi)降解，適于開發(fā)成功能性材料。

2、通過仿生礦化法使鈣磷酸鹽在溶液環(huán)境中均勻沉積在絲素蛋白形成的不規(guī)則多孔網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)表面，克服了以下問題：一、鈣磷酸鹽作為天然骨質(zhì)的主要無機物組成成分，具有良好的骨誘導(dǎo)性，但其在金屬材料表面不能牢固附著，很容易脫落，而其在絲素蛋白構(gòu)成的網(wǎng)狀纖維上形成均勻結(jié)晶后可牢固復(fù)合于材料孔隙內(nèi)；二、絲素蛋白的骨誘導(dǎo)性有限，與鈣磷酸鹽的合理復(fù)合可有效提高其骨誘導(dǎo)性，能更好地促進材料-骨界面的骨再生。

3、絲素蛋白與鈣磷酸鹽晶體形成的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)本身具有“多孔人工仿生骨”的性質(zhì)：絲素蛋白的本質(zhì)是纖維蛋白，相當于骨質(zhì)中的有機成分——膠原纖維；而鈣磷酸鹽本身就是骨質(zhì)的無機成分；兩者的結(jié)合方式類似天然骨質(zhì)中羥基磷灰石晶體與一型膠原的結(jié)合方式。這種鈣磷酸鹽礦化的絲素蛋白微孔材料復(fù)合于多孔金屬孔隙內(nèi)，可為骨組織細胞在孔隙內(nèi)的粘附提供良好的微環(huán)境，誘導(dǎo)骨組織向孔隙內(nèi)快速長入，從而解決多孔金屬材料骨長入不佳的問題，促進多孔鈦金屬植入物材料與骨的良好整合和長期穩(wěn)固。

4、通過溶液中酸蝕和陽極氧化法，可在3d打印多孔鈦金屬表面(包括孔隙內(nèi))均勻地制備微納米顯微結(jié)構(gòu)，將微米級和納米級表面形貌的優(yōu)點和功效融合在一起，形成表面材料功能層。其可有效降低鈦金屬材料的生物惰性，提高其組織兼容性；為成骨細胞等多種參與骨再生過程的細胞在金屬表面的粘附提供更好的微環(huán)境，適宜尺寸的鈦納米微管可通過細胞膜上的粘附分子等對細胞內(nèi)的代謝進程產(chǎn)生影響，改善材料-骨界面細胞的應(yīng)激狀態(tài)，促進細胞的功能發(fā)揮和材料表面骨質(zhì)沉積，從而最終促進金屬植入物材料與骨之間形成更牢固的直接結(jié)合。

5、材料與骨的直接結(jié)合效果取決于骨修復(fù)過程中材料表面的骨質(zhì)沉積效果。材料表面的拓撲形貌對周圍組織細胞的行為產(chǎn)生顯著影響，材料表面的顯微結(jié)構(gòu)優(yōu)化可促進材料表面的骨再生和骨質(zhì)沉積。不同尺度的材料表面形貌對細胞行為產(chǎn)生不同影響，微米級和納米級的表面結(jié)構(gòu)會通過不同機制促進金屬表面的細胞活力、蛋白吸附、骨質(zhì)再生和沉積。