本發(fā)明屬于肽類大分子藥物領(lǐng)域，具體涉及一種手性樹狀肽類大分子作為自噬誘導(dǎo)肽類藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肽類藥物因其高的生物學(xué)活性、低的毒副作用而備受新藥創(chuàng)制與開發(fā)領(lǐng)域的關(guān)注，然而經(jīng)典線型和環(huán)狀肽類藥物存在諸多問題(如溶解性差、攝取率低等)限制了其醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化與臨床應(yīng)用；最新研究進展表明，開發(fā)新型樹枝狀結(jié)構(gòu)的肽類藥物有望解決現(xiàn)有肽類藥物的缺陷、創(chuàng)造出高生物活性分子；例如我們報道的首例樹狀大分子抗腫瘤藥物(zhang,x.；zhang,z.；xu,x.；li,y.；li,y.；jian,y.；gu,z.,bioinspiredtherapeuticdendrimersasefficientpeptidedrugsbasedonsupramolecularinteractionsfortumorinhibition.angew.chem.int.ed.2015,54,4289-4294.)；另一方面，現(xiàn)有肽類藥物的藥理作用和活性都有待拓展和提升；例如目前臨床應(yīng)用肽類自噬誘導(dǎo)劑往往來源于天然活性蛋白(如beclin-1)，缺乏人工設(shè)計與合成的肽類自噬誘導(dǎo)實體藥物；調(diào)控細胞自噬成為了多種疾病治療的重要策略(如神經(jīng)退行性疾病、代謝異常和惡性腫瘤等)；因而，研制易于合成制備、生物活性高的新型肽類自噬誘導(dǎo)劑具有重要意義。

細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或細胞器的受損與蓄積是驅(qū)動細胞自噬的重要誘因；基于這一生命現(xiàn)象的啟迪，以手性d-氨基酸為基元、以樹狀結(jié)構(gòu)為分子骨架，我們設(shè)計與開發(fā)了一類仿天然蛋白的肽類自噬誘導(dǎo)劑；該新型肽類自噬誘導(dǎo)劑分子結(jié)構(gòu)精確可控、溶解性/穩(wěn)定性優(yōu)越、易于細胞攝取和利用，是一種廣譜性的自噬誘導(dǎo)劑，具有廣闊的醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化與臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種利用純手性樹狀肽類大分子精確的分子結(jié)構(gòu)，立體化學(xué)結(jié)構(gòu)和三維納米結(jié)構(gòu)模擬天然蛋白結(jié)構(gòu)的具有自噬誘導(dǎo)效果的手性肽類大分子作為自噬誘導(dǎo)肽類藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種手性樹狀肽類大分子作為自噬誘導(dǎo)肽類藥物的應(yīng)用，所述手性樹狀肽類大分子結(jié)構(gòu)如下：

其中：a代表手性氨基酸樹枝單元即手性氨基酸支化單元，為d-氨基酸或l-氨基酸。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子具有誘導(dǎo)腫瘤自噬的作用

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子中的d型樹狀肽類大分子在胰蛋白混合酶溶液中具有生物穩(wěn)定性。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子可引起自噬流。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子中的d型樹狀肽類大分子可在自噬溶酶體內(nèi)富集。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子中的d型樹狀肽類大分子可促進化療藥物對腫瘤細胞的作用。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子中的d型樹狀肽類大分子可克服腫瘤多藥耐藥性。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子可誘導(dǎo)hepg2細胞，hela細胞，a549細胞，4t1細胞，b16細胞，mcf-7細胞，skov3細胞自噬。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子引起的自噬流機制為手性依賴性的。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子引起的自噬流機制為時間依賴性、濃度依賴性和代數(shù)依賴性的。本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明利用純手性樹狀肽類大分子精確的分子結(jié)構(gòu)，立體化學(xué)結(jié)構(gòu)和三維納米結(jié)構(gòu)來模擬天然蛋白結(jié)構(gòu)作為一種自噬誘導(dǎo)肽類藥物；

(2)本發(fā)明對不同的腫瘤細胞系，都能起到有效的誘導(dǎo)自噬；

(3)本發(fā)明為純手性樹狀肽類大分子藥物在治療相關(guān)疾病方面的應(yīng)用開辟了新的方向。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子的細胞攝取速率圖。

圖2是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子與胰蛋白酶溶液孵育不同時間的熒光強度變化圖。

圖3是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子與胰蛋白酶溶液孵育不同時間的熒光成像圖。

圖4是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子與胰蛋白酶溶液孵育不同時間的熒光成像圖的定量圖。

圖5是本發(fā)明實施例1中所述不同代數(shù)的純手性樹狀肽類大分子處理hepg2細胞的mdc染色圖。

圖6是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子處理hepg2細胞的mdc染色圖。

圖7是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子處理hepg2細胞的mdc熒光流式統(tǒng)計圖。

圖8是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹枝狀肽類大分子處理hepg2細胞的ao染色圖。

圖9是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子處理hepg2細胞的ao流式統(tǒng)計圖。

圖10是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹枝狀肽類大分子處理hepg2細胞的tem圖。

圖11是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹枝狀肽類大分子處理hepg2細胞的蛋白電泳圖。

圖12是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹枝狀肽類大分子處理hepg2細胞的蛋白電泳定量圖。

圖13是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹枝狀肽類大分子與自噬抑制劑共處理hepg2細胞的蛋白電泳圖。

圖14是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子對hepg2腫瘤裸鼠處理的冰凍切片圖。

圖15是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子處理hepg2細胞的mrfp-gfp-lc3圖。

圖16是本發(fā)明實施例1中空白組hepg2細胞的mrfp-gfp-lc3圖。

圖17是本發(fā)明實施例1中空白組hepg2細胞的mrfp-gfp-lc3點數(shù)統(tǒng)計圖。

圖18是本發(fā)明實施例1中所述純手性(g4l-dps)樹狀肽類大分子處理hepg2細胞的mrfp-gfp-lc3圖。

圖19是本發(fā)明實施例1中所述純手性(g4l-dps)樹狀肽類大分子處理hepg2細胞的mrfp-gfp-lc3點數(shù)統(tǒng)計圖。

圖20是本發(fā)明實施例1中所述純手性(g4d-dps)樹狀肽類大分子處理hepg2細胞的mrfp-gfp-lc3圖。

圖21是本發(fā)明實施例1中所述純手性(g4d-dps)樹狀肽類大分子處理hepg2細胞的mrfp-gfp-lc3點數(shù)統(tǒng)計圖。

圖22是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子處理表達mrfp-lc3的hepg2細胞溶酶體共定位圖。

圖23是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子處理多種腫瘤細胞的mdc染色圖。

圖24是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子處理mcf-7細胞的mdc熒光強度定量圖。

圖25是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹狀肽類大分子處理mcf-7/r細胞的mdc熒光強度定量圖。

圖26是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹枝狀肽類大分子結(jié)合化療藥物治療mcf-7腫瘤細胞的細胞毒性圖。

圖27是本發(fā)明實施例1中所述純手性樹枝狀肽類大分子結(jié)合化療藥物治療mcf-7/r腫瘤細胞的細胞毒性圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

一種手性樹狀肽類大分子作為自噬誘導(dǎo)肽類藥物的應(yīng)用，所述手性樹狀肽類大分子結(jié)構(gòu)如下：

其中：a代表手性氨基酸樹枝單元即手性氨基酸支化單元，為d-氨基酸或l-氨基酸。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子具有誘導(dǎo)腫瘤自噬的作用

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子中的d型樹狀肽類大分子在胰蛋白混合酶溶液中具有生物穩(wěn)定性。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子可引起自噬流；所述手性樹狀肽類大分子藥物中的l型樹狀肽類大分子藥物在細胞內(nèi)因被降解，只能引起微弱的自噬流；而d型樹狀肽類大分子藥物在細胞內(nèi)具有優(yōu)良的生物穩(wěn)定性可引起持續(xù)強烈的自噬流。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子中的d型樹狀肽類大分子可在自噬溶酶體內(nèi)富集。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子中的d型樹狀肽類大分子可促進化療藥物對腫瘤細胞的作用。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子中的d型樹狀肽類大分子可克服腫瘤多藥耐藥性。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子可誘導(dǎo)hepg2細胞，hela細胞，a549細胞，4t1細胞，b16細胞，mcf-7細胞，skov3細胞自噬。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子引起的自噬流機制為手性依賴性的。

進一步的，所述手性樹狀肽類大分子引起的自噬流機制為時間依賴性、濃度依賴性和代數(shù)依賴性的。

上述手性樹狀肽類大分子藥物遵循以下是原則設(shè)計合成：

(1)手性樹狀肽類大分子藥物具有多官能度(至少為2)的核心分子和純手性氨基酸樹枝單元；

(2)純手性氨基酸樹枝單元為堿性氨基酸中的一種；

(3)手性樹狀肽類大分子代數(shù)不低于三代，手性氨基酸數(shù)量不低于16個。

本發(fā)明中的手性樹狀肽類大分子藥物，采用液相發(fā)散法合成；通過質(zhì)譜和核磁共振氫譜證實合成的手性樹狀肽類大分子的分子量，并證實合成產(chǎn)物是目的肽類大分子。

具體制備方法如下：

制備手性樹狀肽類大分子的原料必須為純手性氨基酸，且手性純度須達到99.9％以上；

1)一代純手性樹狀肽類大分子(g1l-dps)的合成

1a)、縮合反應(yīng)

精密稱取10.0g原料boc-lys(boc)-oh,11.2g縮合劑0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)和4.9g催化劑1-羥基苯并三唑(hobt)加入到100ml支管瓶中，抽真空，通氮氣；用注射器加入約40ml的dmf溶劑，冰浴攪拌下加入19.8ml有機堿n,n-二異丙基乙胺(dipea),然后用注射器緩慢加入1ml的三(2-氨基乙基)胺，在冰浴、攪拌、避光的條件下進行脫水縮合反應(yīng)48h；減壓除去溶劑后，加入氯仿溶解，依次用飽和食鹽水，碳酸氫鈉飽和溶液，稀鹽酸在低溫、避光條件下分別洗滌三次，收集有機相至錐形瓶中；向其中加入適量無水硫酸鈉干燥過夜后抽濾，將濾液中的溶劑旋干后在低溫、避光條件下過柱，分離得到純產(chǎn)物為g1l-dps(boc)6；

1b)脫保護步驟

準確稱取4.0gg1l-dps(boc)6，抽真空，通氮氣，注入適量重蒸二氯甲烷溶解后，緩慢逐滴加入17.32ml三氟乙酸(tfa)，在冰浴、避光、攪拌、氮氣保護的條件下反應(yīng)12h，脫除保護，減壓濃縮，加入乙醚攪拌過夜，靜置，傾去上清液后將剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固體即為g1l-dps，無需提純，直接用于下步反應(yīng)；

2)二代純手性樹狀肽類大分子(g2l-dps)的合成

精密稱取8.4g原料boc-lys(boc)-oh,12.1g縮合劑0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu),4.0gg1l-dps和4.3g催化劑1-羥基苯并三唑(hobt)加入到100ml支管瓶中，抽真空，通氮氣；用注射器加入約40ml的dmf溶劑，冰浴攪拌下加入17.5ml有機堿n,n-二異丙基乙胺(dipea)；在冰浴、攪拌、避光的條件下進行脫水縮合反應(yīng)48h；減壓除去溶劑后，加入氯仿溶解，依次用飽和食鹽水，碳酸氫鈉飽和溶液，稀鹽酸在低溫、避光條件下分別洗滌三次，收集有機相至錐形瓶中；向其中加入適量無水硫酸鈉干燥過夜后抽濾，將濾液中的溶劑旋干后在低溫、避光條件下過柱，分離得到純產(chǎn)物為g2l-dps(boc)12；

1b)、脫保護步驟

準確稱取3.3gg2l-dps(boc)12，抽真空，通氮氣，注入適量重蒸二氯甲烷溶解后，緩慢逐滴加入12.9ml三氟乙酸(tfa)，在冰浴、避光、攪拌、氮氣保護的條件下反應(yīng)12h，脫除保護，減壓濃縮，加入乙醚攪拌過夜，靜置，傾去上清液后將剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固體即為g2l-dps，無需提純，直接用于下步反應(yīng)；

3)、三代純手性樹狀肽類大分子(g3l-dps)的合成

精密稱取7.0g原料boc-lys(boc)-oh,8.2g縮合劑0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu),3.3gg2l-dps和2.9g催化劑1-羥基苯并三唑(hobt)加入到100ml支管瓶中，抽真空，通氮氣；用注射器加入約40ml的dmf溶劑，冰浴攪拌下加入11.8ml有機堿n,n-二異丙基乙胺(dipea)；在冰浴、攪拌、避光的條件下進行脫水縮合反應(yīng)72h；減壓除去溶劑后，加入氯仿溶解，依次用飽和食鹽水，碳酸氫鈉飽和溶液，稀鹽酸在低溫、避光條件下分別洗滌三次，收集有機相至錐形瓶中；向其中加入適量無水硫酸鈉干燥過夜后抽濾，將濾液中的溶劑旋干后在低溫、避光條件下過柱，分離得到純產(chǎn)物為g3l-dps(boc)24；

1b)、脫保護步驟

準確稱取0.7gg3l-dps(boc)24，抽真空，通氮氣，注入適量重蒸二氯甲烷溶解后，緩慢逐滴加入2.5ml三氟乙酸(tfa)，在冰浴、避光、攪拌、氮氣保護的條件下反應(yīng)14h，脫除保護，減壓濃縮，加入乙醚攪拌過夜，靜置，傾去上清液后將剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固體即為g3l-dps，無需提純，直接用于下步反應(yīng)；

4)四代純手性樹狀肽類大分子(g4l-dps)的合成

精密稱取2.1g原料boc-lys(boc)-oh,2.4g縮合劑0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)，0.7gg3l-dps和0.7g催化劑1-羥基苯并三唑(hobt)加入到50ml支管瓶中，抽真空，通氮氣；用注射器加入約20ml的dmf溶劑，冰浴攪拌下加入2.6ml有機堿n,n-二異丙基乙胺(dipea)；在冰浴、攪拌、避光的條件下進行脫水縮合反應(yīng)72h；減壓除去溶劑后，加入氯仿溶解，依次用飽和食鹽水，碳酸氫鈉飽和溶液，稀鹽酸在低溫、避光條件下分別洗滌三次，收集有機相至錐形瓶中；向其中加入適量無水硫酸鈉干燥過夜后抽濾，將濾液中的溶劑旋干后在低溫、避光條件下過柱，分離得到純產(chǎn)物為g4l-dps(boc)48；

1b)、脫保護步驟

準確稱取0.4gg4l-dps(boc)48，抽真空，通氮氣，注入適量重蒸二氯甲烷溶解后，緩慢逐滴加入1.5ml三氟乙酸(tfa)，在冰浴、避光、攪拌、氮氣保護的條件下反應(yīng)18h，脫除保護，減壓濃縮，加入乙醚攪拌過夜，靜置，傾去上清液后將剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固體即為g4l-dps，無需提純，直接用于下步反應(yīng)；

將脫保護得到的一代、二代、三代、四代純手性樹狀肽類大分子(l)溶于去離子水中，在低溫、避光條件下透析三天，冷凍干燥備用；

11)一代純手性樹狀肽類大分子(g1d-dps)的合成

11a)、縮合反應(yīng)

精密稱取11.2g原料boc-d-lys(boc)-oh,12.3g縮合劑0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)和4.9g催化劑1-羥基苯并三唑(hobt)加入到100ml支管瓶中，抽真空，通氮氣；用注射器加入約40ml的dmf溶劑，冰浴攪拌下加入22.2ml有機堿n,n-二異丙基乙胺(dipea),然后用注射器緩慢加入1.1ml的三(2-氨基乙基)胺，在冰浴、攪拌、避光的條件下進行脫水縮合反應(yīng)48h；減壓除去溶劑后，加入氯仿溶解，依次用飽和食鹽水，碳酸氫鈉飽和溶液，稀鹽酸在低溫、避光條件下分別洗滌三次，收集有機相至錐形瓶中；向其中加入適量無水硫酸鈉干燥過夜后抽濾，將濾液中的溶劑旋干后在低溫、避光條件下過柱，分離得到純產(chǎn)物為g1d-dps(boc)6；

11b)、脫保護步驟

準確稱取5.4gg1d-dps(boc)6，抽真空，通氮氣，注入適量重蒸二氯甲烷溶解后，緩慢逐滴加入23.38ml三氟乙酸(tfa)，在冰浴、避光、攪拌、氮氣保護的條件下反應(yīng)12h，脫除保護，減壓濃縮，加入乙醚攪拌過夜，靜置，傾去上清液后將剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固體即為g1d-dps，無需提純，直接用于下步反應(yīng)；

22)二代純手性樹狀肽類大分子(g2d-dps)的合成

精密稱取11.3g原料boc-d-lys(boc)-oh,16.3g縮合劑0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)，5.4gg1d-dps和5.8g催化劑1-羥基苯并三唑(hobt)加入到100ml支管瓶中，抽真空，通氮氣；用注射器加入約40ml的dmf溶劑，冰浴攪拌下加入23.6ml有機堿n,n-二異丙基乙胺(dipea)；在冰浴、攪拌、避光的條件下進行脫水縮合反應(yīng)48h；減壓除去溶劑后，加入氯仿溶解，依次用飽和食鹽水，碳酸氫鈉飽和溶液，稀鹽酸在低溫、避光條件下分別洗滌三次，收集有機相至錐形瓶中；向其中加入適量無水硫酸鈉干燥過夜后抽濾，將濾液中的溶劑旋干后在低溫、避光條件下過柱，分離得到純產(chǎn)物為g2d-dps(boc)12；

1b)、脫保護步驟

準確稱取4.3gg2d-dps(boc)12，抽真空，通氮氣，注入適量重蒸二氯甲烷溶解后，緩慢逐滴加入17.1ml三氟乙酸(tfa)，在冰浴、避光、攪拌、氮氣保護的條件下反應(yīng)12h，脫除保護，減壓濃縮，加入乙醚攪拌過夜，靜置，傾去上清液后將剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固體即為g2d-dps，無需提純，直接用于下步反應(yīng)；

33)三代純手性樹狀肽類大分子(g3d-dps)的合成

精密稱取8.4g原料boc-d-lys(boc)-oh,15.8g縮合劑0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)，4.3gg2d-dps和5.6g催化劑1-羥基苯并三唑(hobt)加入到100ml支管瓶中，抽真空，通氮氣；用注射器加入約40ml的dmf溶劑，冰浴攪拌下加入17.3ml有機堿n,n-二異丙基乙胺(dipea)；在冰浴、攪拌、避光的條件下進行脫水縮合反應(yīng)72h；減壓除去溶劑后，加入氯仿溶解，依次用飽和食鹽水，碳酸氫鈉飽和溶液，稀鹽酸在低溫、避光條件下分別洗滌三次，收集有機相至錐形瓶中；向其中加入適量無水硫酸鈉干燥過夜后抽濾，將濾液中的溶劑旋干后在低溫、避光條件下過柱，分離得到純產(chǎn)物為g3d-dps(boc)24；

1b)、脫保護步驟

準確稱取1.0gg3d-dps(boc)24，抽真空，通氮氣，注入適量重蒸二氯甲烷溶解后，緩慢逐滴加入3.7ml三氟乙酸(tfa)，在冰浴、避光、攪拌、氮氣保護的條件下反應(yīng)14h，脫除保護，減壓濃縮，加入乙醚攪拌過夜，靜置，傾去上清液后將剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固體即為g3d-dps，無需提純，直接用于下步反應(yīng)；

44)四代純手性樹狀肽類大分子(g4d-dps)的合成

精密稱取4.8g原料boc-d-lys(boc)-oh,5.2g縮合劑0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)，1.0gg3d-dps和1.9g催化劑1-羥基苯并三唑(hobt)加入到100ml支管瓶中，抽真空，通氮氣；用注射器加入約40ml的dmf溶劑，冰浴攪拌下加入3.8ml有機堿n,n-二異丙基乙胺(dipea)；在冰浴、攪拌、避光的條件下進行脫水縮合反應(yīng)72h；減壓除去溶劑后，加入氯仿溶解，依次用飽和食鹽水，碳酸氫鈉飽和溶液，稀鹽酸在低溫、避光條件下分別洗滌三次，收集有機相至錐形瓶中；向其中加入適量無水硫酸鈉干燥過夜后抽濾，將濾液中的溶劑旋干后在低溫、避光條件下過柱，分離得到純產(chǎn)物為g4d-dps(boc)48；

1b)脫保護步驟

準確稱取0.7gg4d-dps(boc)48，抽真空，通氮氣，注入適量重蒸二氯甲烷溶解后，緩慢逐滴加入2.4ml三氟乙酸(tfa)，在冰浴、避光、攪拌、氮氣保護的條件下反應(yīng)18h，脫除保護，減壓濃縮，加入乙醚攪拌過夜，靜置，傾去上清液后將剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固體即為g4d-dps，無需提純，直接用于下步反應(yīng)；

將脫保護得到的一代、二代、三代、四代純手性樹狀肽類大分子(d)溶于去離子水中，在低溫、避光條件下透析三天，冷凍干燥備用；

所述催化劑hbtu、縮合劑hobt、有機堿dipea、溶劑dmf、三(2-氨基乙基)胺以及三氟乙酸t(yī)fa均為色譜純。

手性樹狀肽類大分子藥物利用高效液相色譜法(hplc)純化，純度分別都大于99.9％；手性樹狀肽類大分子藥物利用圓二色譜技術(shù)進行肽類藥物結(jié)構(gòu)分析證實合成的手性肽類藥物為一對對映異構(gòu)體。

采用本發(fā)明制備的手性樹狀肽類大分子藥物分別處理不同的腫瘤細胞系，hepg2細胞，hela細胞，a549細胞，4t1細胞，b16細胞，mcf-7細胞，skov3細胞，結(jié)果表明d型樹狀肽類大分子藥物在各種腫瘤細胞中比起l型樹狀肽類大分子藥物都能有效的誘導(dǎo)自噬；其中hepg2細胞為人肝癌細胞，hela細胞為人宮頸癌細胞，a549細胞為人肺癌細胞，4t1細胞為小鼠乳腺癌細胞，b16細胞為小鼠黑色素瘤細胞，mcf-7細胞為人乳腺癌細胞，skov3細胞為卵巢癌細胞。

手性樹狀肽類大分子藥物分別處理hepg2細胞，結(jié)果表明，孵育時間越長，劑量越大，代數(shù)越高，d型樹狀肽類大分子藥物比起l型樹狀肽類大分子藥物能誘導(dǎo)更強烈的自噬；用手性樹狀肽類大分子藥物和自噬抑制劑一起處理hepg2細胞，結(jié)果表明，手性樹狀肽類大分子藥物引起自噬流過程；用d型樹狀肽類大分子藥物和l型樹狀肽類大分子藥物分別處理hepg2細胞，結(jié)構(gòu)表明，隨著孵育時間的延長，d型樹狀肽類大分子藥物在體內(nèi)外具有生物穩(wěn)定性可引起持續(xù)強烈的自噬流，而l型樹狀肽類大分子藥物因被降解循環(huán)利用，只能引起微弱的自噬流；本發(fā)明中純手性樹狀肽類大分子工作原理如下：g4l-dps或g4d-dps有效的進入細胞之后，在細胞質(zhì)內(nèi)聚集，形成蛋白聚集體，然后激起細胞產(chǎn)生吞噬泡，將g4l-dps或g4d-dps和一些其他蛋白聚集體包裹在吞噬泡內(nèi)，形成自噬小體，后者與溶酶體融合形成自噬溶酶體，自噬溶酶體會將g4l-dps和一些其他蛋白聚集體降解成氨基酸等循環(huán)利用，而g4d-dps在自噬溶酶體內(nèi)不能被降解而富集，最后從自噬溶酶體內(nèi)逃逸出再一次激起自噬，形成持續(xù)的自噬誘導(dǎo)。

具體實驗過程如下：

熒光分子標記實驗：

稱取10.0mgg4l-dps溶解于10ml的飽和碳酸氫鈉溶液中，2.0mg的fitc(異硫氰酸熒光素)溶解于1ml的二甲基亞砜溶液中。將1％fitc(fitc的用量按照g4l-dps分子外圍氨基數(shù)目計算得到)加入到g4l-dps溶液中，室溫避光攪拌反應(yīng)12h；將反應(yīng)混合液在透析袋中透析兩天，凍干可得到g4l-fitc-dps，按照同樣的方法可以得到g4d-fitc-dps。

稱取10.0mgg4l-dps溶解于10ml的飽和碳酸氫鈉溶液中，將1％cy5.5(cy5.5的用量按照g4l-dps分子外圍氨基數(shù)目計算得到)加入到g4l-dps溶液中，室溫避光攪拌反應(yīng)12h。將反應(yīng)混合液在透析袋中透析兩天，凍干可得到g4l-cy5.5-dps，按照同樣的方法可以得到g4d-cy5.5-dps。

構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗?zāi)Ｐ停?/p>

稱取1.0mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc)，0.6mgn-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhs)和2.5mgg4l-fitc-dps于25ml支管瓶中，抽真空，充氮氣，加入15ml二甲基亞砜使其充分溶解，最后加入2％bhq-1(bhq-1的用量按照g4l-dps分子外圍氨基數(shù)目計算得到)，室溫避光攪拌反應(yīng)48h。將反應(yīng)混合液在透析袋中透析兩天，凍干可得到g4l-fitc-dps-bhq-1，按照同樣的方法可以得到g4d-fitc-dps-bhq-1；純手性樹狀肽類大分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移設(shè)計原理：g4l-dps或g4d-dps先標記上fitc熒光分子之后，會在激發(fā)波長為488nm下，有熒光信號出現(xiàn)，但是繼續(xù)標記上bhq-1熒光淬滅劑后，會將fitc的熒光有效的淬滅，即在激發(fā)波長為488nm下，無熒光信號出現(xiàn)，但是當g4l-dps或g4d-dps的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞之后，bhq-1和fitc分離開，則bhq-1不能有效的淬滅fitc熒光，此時fitc又能在波長為488nm激發(fā)下，有熒光信號出現(xiàn)。

細胞攝取實驗：

將hepg2細胞以8×10³個/每孔的密度均勻接種于黑色96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；用dmem高糖培養(yǎng)基稀釋g4l-fitc-dps或g4d-fitc-dps(10μg/ml)，然后分別加入100μl的g4l-fitc-dps或g4d-fitc-dps(10μg/ml)；分別孵育0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h；上清液被收集在另外一塊黑色96孔板，細胞用pbs洗三遍之后加入裂解液裂解一小時；然后用酶標儀檢測上清液和細胞裂解液的熒光值，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為520nm；結(jié)果如圖1所示，表明手性樹狀肽類大分子藥物能夠快速有效的入胞。

胰蛋白混合酶降解實驗：

稱取適量的胰蛋白酶，用pbs緩沖液配制最后得到1μg/ml的水溶液，配制標記好的g4l-fitc-dps-bhq-1和g4d-fitc-dps-bhq-1的濃度為100μg/ml；先取50μl胰酶溶液在37℃下孵育30min，再加入50μl的材料溶液，在37℃下緩慢振搖，分別孵育30min，1h，3h，6h，12h，24h，48h，用f-7000熒光分光光度計以激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為500nm到650nm檢測溶液熒光強度；結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明隨著孵育時間的增長，g4l-fitc-dps-bhq-1在胰蛋白混合酶溶液中被不斷降解，導(dǎo)致fitc的熒光強度越來越大，而g4d-fitc-dps-bhq-1在胰蛋白混合酶溶液中有良好的生物穩(wěn)定性，使fitc一直處于淬滅狀態(tài)；同樣，如圖3和圖4所示，熒光成像結(jié)果和其定量結(jié)果也表明在胰蛋白混合酶溶液中，g4l-fitc-dps-bhq-1的fitc熒光越來越強，而g4d-fitc-dps-bhq-1的fitc一直處于淬滅狀態(tài)。

mdc染色：

將hepg2細胞，hela細胞，a549細胞，4t1細胞，b16細胞，mcf-7細胞，skov3細胞接種于玻底皿，大約為5×10³個，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；將g4l-dps和g4d-dps用培養(yǎng)基稀釋使其濃度為100μg/ml，加入到玻底皿中；使用雷帕霉素(rapa，50nm)為陽性對照組，同時加入到波底皿中，培養(yǎng)24h后用mdc(50μm)染色15min，用pbs洗三遍以激發(fā)波長405nm，發(fā)射波長530nm在激光共聚焦下觀察熒光情況；結(jié)果如圖5所示，手性樹狀肽類大分子藥物誘導(dǎo)自噬為代數(shù)依賴性的過程，即代數(shù)越高，自噬誘導(dǎo)能力越強；如圖6所示，手性樹狀肽類大分子藥物誘導(dǎo)自噬為時間依賴性，濃度依賴性和手性依賴性過程，即時間越長，濃度越高，自噬誘導(dǎo)能力越強，并且g4d-dps比g4l-dps能有效的誘導(dǎo)自噬，表現(xiàn)為自噬陽性點數(shù)更多；如圖23所示，表明g4d-dps在多種腫瘤細胞內(nèi)(hepg2細胞，hela細胞，a549細胞，4t1細胞，b16細胞，mcf-7細胞，skov3細胞)都能有效的誘導(dǎo)自噬；如圖24所示，通過對mcf-7細胞mdc染色熒光強度定量分析表明，g4d-dps對mcf-7細胞能有效的誘導(dǎo)自噬；如圖25所示，通過對mcf-7/r細胞mdc染色熒光強度定量分析表明，g4d-dps能有效的誘導(dǎo)mcf-7/r細胞自噬。

mdc流式：

將hepg2細胞接種于六孔板，大約為5×10⁵個，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，將g4l-dps和g4d-dps用培養(yǎng)基稀釋使其濃度為100μg/ml，加入到六孔板中，培養(yǎng)24h后用mdc(50μm)染色15min，用胰酶將細胞收集于ep管中以1000rpm離心5min，用pbs洗三遍之后用流式細胞儀檢測；結(jié)果如圖7所示，表明g4d-dps比g4l-dps能有效的誘導(dǎo)自噬，表現(xiàn)為熒光強度更高。

ao染色：

將hepg2細胞接種于玻底皿，大約為5×10³個，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，將g4l-dps和g4d-dps用培養(yǎng)基稀釋使其濃度為100μg/ml，加入到玻底皿中；使用雷帕霉素(50nm)為陽性對照組，同時加入波底皿中；培養(yǎng)24h后用吖啶橙(1μm)染色15min，用pbs洗三遍以激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm和640nm在激光共聚焦下觀察熒光情況；結(jié)果如圖8所示，表明g4d-dps比g4l-dps能有效的誘導(dǎo)自噬，表現(xiàn)為紅色點更多，熒光強度更強。

ao流式：

將hepg2細胞接種于六孔板，大約為5×10⁵個，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，將g4l-dps和g4d-dps用培養(yǎng)基稀釋使其濃度為100μg/ml，加入到六孔板中，培養(yǎng)24h后用ao(1μm)染色15min，用胰酶將細胞收集于ep管中以1000rpm離心5min，用pbs洗三遍之后用流式細胞儀檢測；結(jié)果如圖9所示，表明g4d-dps比g4l-dps能有效的誘導(dǎo)自噬，表現(xiàn)為紅色熒光強度與綠色熒光強度的比例更高。

細胞透射電子顯微鏡(tem)：

將hepg2細胞接種于六孔板，大約為5×10⁵個，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，將g4l-dps和g4d-dps用培養(yǎng)基稀釋使其濃度為100μg/ml，加入到六孔板中，培養(yǎng)24h后用胰酶將細胞收集于ep管中以1500rpm離心15min，棄去上清液，緩慢加入0.5％戊二醛固定液，在四度靜置15min。然后10000rpm離心15min，棄去上清液，緩慢加入3％的戊二醛固定液；結(jié)果如圖10所示，表明g4d-dps比g4l-dps能有效的誘導(dǎo)自噬，表現(xiàn)為自噬小體和自噬溶酶體個數(shù)更多。

蛋白電泳(westernblot)：

westernblot檢測步驟如下：細胞培養(yǎng)24h后，收集細胞用細胞裂解液(購自碧云天公司)裂解細胞，金屬浴99度加熱10min后，15％sds-page電泳后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上；以lc3bantibody(購自novus公司)(lc3b抗體)為一抗，β-actinantibody(購自abcam公司)(β-actin抗體)為內(nèi)參，anti-rabbit(購自santacruzbiotechnology公司)為二抗進行蛋白電泳；結(jié)果如圖11和12所示，結(jié)果表明g4d-dps比g4l-dps能有效的誘導(dǎo)自噬，表現(xiàn)為lc3-ii/β-actin比例更高；同時如圖13所示，手性樹狀肽類大分子藥物與自噬抑制劑聯(lián)用，表明手性樹狀肽類大分子藥物誘導(dǎo)了一個自噬流。

冰凍切片分析：

小鼠的腫瘤組織被剝離，在冷凍機里(-20度)凍成硬塊，制成5μm厚的切片；切片用帶熒光的lc3一抗孵育之后用來評價體內(nèi)的自噬水平；染色后的組織切片用倒置熒光顯微鏡成像；結(jié)果如圖14所示，結(jié)果表明g4d-dps比g4l-dps能更有效的誘導(dǎo)自噬，表現(xiàn)為自噬體標記物lc3個數(shù)更多，熒光強度更強。

mrfp-gfp-lc3腺病毒轉(zhuǎn)染：

將hepg2細胞接種于六孔板，大約為5×10⁵個，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，嚴格按照說明書的要求操作mrfp-gfp-lc3腺病毒轉(zhuǎn)染細胞實驗；36h后可得到穩(wěn)定表達的mrfp-gfp-lc3的細胞，然后將hepg2細胞接種于玻底皿，大約為5×10³個；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入樣品處理后用pbs洗三遍以激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm在激光共聚焦下觀察gfp，激發(fā)波長584nm，發(fā)射波長640nm觀察mrfp；結(jié)果如圖15-21所示，實驗結(jié)果表明g4d-dps比g4l-dps能引起更多的自噬，并且g4d-dps能引起持續(xù)強烈的自噬流，而g4l-dps伴隨著時間的延長，在自噬流過程中被降解循環(huán)利用，導(dǎo)致自噬誘導(dǎo)能力降低；mrfp-gfp-lc3為雙熒光自噬指示體系。

溶酶體共定位：

將穩(wěn)定表達mrfp-gfp-lc3的hepg2細胞接種于玻底皿，大約為5×10³個，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；將g4l-cy5.5-dps和g4d-cy5.5-dps用培養(yǎng)基稀釋使其濃度為100μg/ml，加入到波底皿中，分別培養(yǎng)1h和24h；用pbs洗三遍以激發(fā)波長405nm，發(fā)射波長422nm在激光共聚焦下觀察lyso-trackerblue，激發(fā)波長584nm，發(fā)射波長640nm觀察mrfp，激發(fā)波長633nm，發(fā)射波長692nm觀察g4l-cy5.5-dps和g4d-cy5.5-dps；結(jié)果如圖22所示，結(jié)果表明隨著孵育時間的延長，g4d-dps和g4l-dps能逐漸聚集到自噬溶酶體內(nèi)，而g4l-dps會逐漸被自噬溶酶體降解彌散到細胞質(zhì)內(nèi)，g4d-dps不能被降解會在自噬溶酶體內(nèi)富集。

細胞毒性實驗：

mcf-7細胞，mcf-7耐藥細胞培養(yǎng)在10％血清和1％雙抗的dmem高糖培養(yǎng)基中，并在37度條件下含5％的co2的培養(yǎng)箱中貼壁生長；收集對數(shù)期生長的細胞用培養(yǎng)基稀釋成8×10⁴cell/ml，每孔100μl接種到96孔板中并孵育24h；吸走培養(yǎng)基，分別加入100μg/ml的g4l-dps和g4d-dps，孵育24h，然后在mcf-7細胞加入0.1μg/mldox.hcl；mcf-7耐藥細胞加入5μg/mldox.hcl繼續(xù)孵育24h；每孔用pbs洗滌三次，緊接著每孔加入含10μl的cck-8試劑的無血清、雙抗的100μl培養(yǎng)基，避光條件下在培養(yǎng)箱中孵育2h；每孔的吸光度在450nm處進行測定；相對細胞存活率根據(jù)一下公式來計算：細胞存活率＝(od實驗組-od背景)/(od對照組-od背景)×100；結(jié)果如圖26所示，，結(jié)果表明d型樹狀肽類大分子藥物通過誘導(dǎo)自噬促進化療藥物對腫瘤細胞的治療，并且如圖27所示，表明d型樹狀肽類大分子藥物通過誘導(dǎo)自噬還可逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性。

本發(fā)明提供一種化學(xué)合成的純手性樹狀肽類大分子藥物，可作為一種自噬誘導(dǎo)肽的應(yīng)用；作為第一例報道相關(guān)自噬誘導(dǎo)純手性樹狀肽類大分子藥物，這項工作不僅證實了純手性樹狀肽類大分子可作為生物啟發(fā)性的自噬誘導(dǎo)肽類藥物的設(shè)想，也深入細致的研究了純手性樹狀肽類大分子誘導(dǎo)自噬的過程和機制，而且為純手性樹狀肽類大分子藥物在治療相關(guān)疾病方面開辟了一個全新的方向。