本發(fā)明涉生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種抗腫瘤聯(lián)合用藥物及其在制備抗癌藥物中的用途。
背景技術(shù)：
綠原酸是植物在進(jìn)行有氧呼吸的過(guò)程，經(jīng)磷酸戊糖途徑中間產(chǎn)物合成的一種苯丙素類物質(zhì)。其提取、合成技術(shù)成熟，綠原酸已經(jīng)被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于食品，保健品，化妝品和藥品等多個(gè)領(lǐng)域。目前研究結(jié)果表明，綠原酸有保護(hù)心血管、抗氧化、抗紫外以及抗輻射、抗癌、抗菌、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等作用。
her-2基因(humanepidermalgrowthreceptor2gene)，又被稱作erbb2或her2/neu基因。her-2原癌基因或c-erbb2編碼一個(gè)單一的受體樣跨膜蛋白，分子量185kda，其結(jié)構(gòu)上與表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)。在原發(fā)性乳腺癌患者中觀察到有25％-30％的患者h(yuǎn)er-2過(guò)度表達(dá)。her-2基因擴(kuò)增的結(jié)果是這些腫瘤細(xì)胞表面her-2蛋白表達(dá)增加，導(dǎo)致her-2受體活化。her-2基因是1981年shih等首先發(fā)現(xiàn)的原癌基因，通常在人類胎兒期表達(dá)，僅在成人部分組織中低水平表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)her-2基因大量擴(kuò)增會(huì)引起其蛋白產(chǎn)物p185的過(guò)表達(dá)，使得her-2受體異源二聚體數(shù)量增加，通過(guò)這些信號(hào)傳遞途徑，作用于特定的信號(hào)蛋白，引起細(xì)胞增殖、分化和抗凋亡，從而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。
her-2過(guò)度表達(dá)，不僅存在于乳腺癌，也存在于胃癌。大約有16％的胃癌患者h(yuǎn)er-2檢測(cè)呈陽(yáng)性。胃癌很難被發(fā)現(xiàn)，一般早期胃癌多無(wú)癥狀或者僅僅是輕微癥狀，而當(dāng)臨床癥狀明顯時(shí)，病變已屬晚期。因此，進(jìn)展期的胃癌患者很難治療，預(yù)后很差。
目前以her-2為靶點(diǎn)的藥物分為兩大類，一類為單抗藥物，另一類為小分子抑制劑。
曲妥珠單抗是一種重組dna衍生的人源化單克隆抗體，選擇性地作用于人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(her2)的細(xì)胞外部位。此抗體屬iggl型，含人的框架區(qū)，適用于治療her-2過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。帕妥珠單抗是一種人源化單克隆抗體，該藥還能阻斷其他的her家族成員，包括egfr、her3和her4，臨床試驗(yàn)研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用帕妥珠單抗僅產(chǎn)生較弱的抗腫瘤作用。小分子抑制劑主要有拉帕替尼，拉帕替尼是小分子4-苯胺基喹唑啉類受體酪氨酸激酶抑制劑，抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(erbb1)和人表皮因子受體2(erbb2)。
近10年的隨機(jī)臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌及早期乳腺癌中，單用小分子抑制劑或者抗體都能提高生存率方面效果。但單藥的有效率有限，并且具有毒副作用的缺陷，而且大部分治療有效者常在1年內(nèi)產(chǎn)生耐藥性，影響臨床應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供一種抗腫瘤聯(lián)合用藥物及其在制備抗癌藥物中的用途，以及綠原酸在制備抗癌藥物毒副作用抑制劑中的用途，所述抗癌藥物為her-2抑制劑。本發(fā)明所述技術(shù)方案可提高h(yuǎn)er-2抑制劑在乳腺癌、胃癌中的靶向性，降低其毒副作用，并逆轉(zhuǎn)her-2抑制劑的耐藥性。
為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明技術(shù)方案為采用一種抗腫瘤聯(lián)合用藥物，包括綠原酸和藥學(xué)上可接收的載體形成的第一制劑，及her-2抑制劑和藥學(xué)上可接收的載體形成的第二制劑。
優(yōu)選的，所述第一制劑10-40份，所述第二制劑30-100份。
優(yōu)選的，所述her-2抑制劑包括her-2小分子抑制劑、抗her-2抗體中的一種或多種。
優(yōu)選的，所述抗her-2抗體包括曲妥珠單抗、帕妥珠單抗。
更為優(yōu)選的，根據(jù)上述聯(lián)合用藥物，所述制劑的劑型為注射劑或口服制劑。
本發(fā)明還提供一種上述聯(lián)合用藥物在制備抗癌藥物中的用途。
優(yōu)選的，所述癌癥包括乳腺癌、胃癌。
本發(fā)明還提供一種綠原酸在制備抗癌藥物毒副作用抑制劑中的用途。
優(yōu)選的，所述抗癌藥物為her-2抑制劑。
目前，大量的實(shí)驗(yàn)均證明綠原酸具有抗誘變及抗癌的作用。綠原酸作為g6pt(葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)移酶)的抑制劑，可以啟動(dòng)中性粒細(xì)胞及前髓細(xì)胞hl-60的程序性細(xì)胞死亡,抑制人hep3b肝癌細(xì)胞的金屬硫蛋白(mmp)分泌，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移。。綠原酸對(duì)her-2抑制劑的增敏作用可能與上述機(jī)理有關(guān)。其次綠原酸分子中含有一定量的活性羥基,能形成具有抗氧化作用的氫自由基,可以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基的活性,保護(hù)組織免受氧化作用的損傷。此外，綠原酸對(duì)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(iel)上清液以及腸道固有層淋巴細(xì)胞(lpl)上清液中nf-γ和tnf-α水平影響均較大。體外研究顯示綠原酸能誘導(dǎo)人淋巴細(xì)胞及人外周血白細(xì)胞生成ifn-γ和ifn-α，這些作用也可能與綠原酸在本申請(qǐng)中能降低her-2抑制劑毒副作用有關(guān)。
曲妥珠單抗的耐藥分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥，曲妥珠單抗發(fā)揮抗her-2療效的根本機(jī)制是其能夠正確地與腫瘤細(xì)胞膜上的her-2受體結(jié)合。阻止抗體與受體有效結(jié)合的細(xì)胞產(chǎn)物或her-2跨膜蛋白結(jié)構(gòu)的改變均可導(dǎo)致曲妥珠單抗不能與her-2受體結(jié)合，從而不能發(fā)揮有效作用，產(chǎn)生原發(fā)性耐藥。此外her-2蛋白下游信號(hào)通路的改變，也可導(dǎo)致耐藥。包括her-2蛋白與her家族其他成員形成異源二聚體活化下游信號(hào)通路或者pi3k/akt信號(hào)通路的改變，pi3k/akt信號(hào)通路因與腫瘤的發(fā)展具有相關(guān)性而備受矚目，pi3k/akt信號(hào)通路基本作用機(jī)制為生長(zhǎng)因子受體形成二聚體后，激活酪氨酸激酶活性，進(jìn)而激活pi3k活性，pi3k能夠催化磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositolbisphosphate，pip2)磷酸化形成第二信使pip3，pip3活化下游akt信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和遷移等。pi3k突變會(huì)使其磷酸化活性增強(qiáng)，持續(xù)將pip2磷酸化成為具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的pip3，從而持續(xù)活化下游akt信號(hào)通路，繼而導(dǎo)致曲妥珠單抗耐藥性的產(chǎn)生。本發(fā)明中，綠原酸逆轉(zhuǎn)了her-2抑制劑包括her-2小分子抑制劑及單抗的耐藥性，其機(jī)理可能與上述機(jī)制相關(guān)，但her-2耐藥性的機(jī)理較為復(fù)雜，綠原酸具體的抗耐藥機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。
具體實(shí)施方式
為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,her2)屬于跨膜酪氨酸激酶受體家族的成員,在腫瘤細(xì)胞中存在過(guò)表達(dá)。自從her2在腫瘤形成過(guò)程中的作用機(jī)制被發(fā)現(xiàn),her2就成為了癌癥研究的熱點(diǎn)之一。研究顯示,在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、前列腺癌中均存在不同程度的her2過(guò)表達(dá)。her2這種在腫瘤中過(guò)表達(dá)以及具有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn),使之成為抗體藥物研發(fā)的一個(gè)理想靶點(diǎn)。
曲妥珠單抗是人工合成的重組單克隆抗體，與her2的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，選擇性地阻斷配體依賴的her2-her3結(jié)合，進(jìn)而抑制her2相關(guān)信號(hào)通路。通過(guò)上述曲妥珠單抗對(duì)her2的作用，阻斷pi3k信號(hào)通路并下調(diào)下游細(xì)胞周期蛋白，如cyclind1。除此之外，曲妥珠單抗還可通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞毒性作用來(lái)激活her2過(guò)表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。然而，該抗體雖然對(duì)her2過(guò)表達(dá)的乳腺癌患者產(chǎn)生選擇性抗腫瘤作用，對(duì)her2表達(dá)正常的腫瘤卻沒(méi)有作用。盡管曲妥珠單抗及其與其他化學(xué)療法的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)治療her2陽(yáng)性乳腺癌具有很好的治療效果，但曲妥珠單抗治療的抵抗卻成為治療中的缺陷。有數(shù)據(jù)顯示，曲妥珠單抗單一療法治療her2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床有效率只有48％。
在治療乳腺癌中，曲妥珠單抗臨床上最常見(jiàn)的不良反應(yīng)包括發(fā)熱、惡心、嘔吐、輸注反應(yīng)、腹瀉、感染、咳嗽加重、頭痛、乏力、呼吸困難、皮疹、中性粒細(xì)胞減少癥、貧血和肌痛。在用于胃癌治療中，最常見(jiàn)的不良反應(yīng)是中性粒細(xì)胞減少癥、腹瀉、乏力、貧血、口腔炎、體重減輕、發(fā)熱、血小板減少等。其中感染、腹瀉和發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少癥可導(dǎo)致治療停止。接受帕妥珠單抗聯(lián)合曲妥珠單抗和多烯紫杉醇治療者最常見(jiàn)的副作用是腹瀉、脫發(fā)、對(duì)抗感染的白細(xì)胞減少、惡心、乏力、皮疹和神經(jīng)損傷(周圍感覺(jué)神經(jīng)病變)。拉帕替尼常見(jiàn)副作用主要有腹瀉、惡心、嘔吐、皮疹、疲勞和手一足綜合征等。
介于上述抗her-2抗體藥物出現(xiàn)的抵抗與耐藥性，以及此類藥物包括her-2小分子抑制劑的毒副作用，結(jié)合綠原酸在人體多個(gè)系統(tǒng)表現(xiàn)出的有益效果，本申請(qǐng)創(chuàng)造性的將二者結(jié)合起來(lái)，產(chǎn)生了意料不到的技術(shù)效果。
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗腫瘤聯(lián)合用藥物及其在制備抗癌藥物中的用途，所述聯(lián)合用藥物包括第一制劑和第二制劑，所述抗腫瘤聯(lián)合用藥物按重量份數(shù)計(jì)為第一制劑10-40份，優(yōu)選10-30份，更為優(yōu)選10-20份，第二制劑30-100份，優(yōu)選40-80份，更為優(yōu)選50-60份。本發(fā)明還公開(kāi)了綠原酸在制備抗癌藥物毒副作用抑制劑中的用途，所述抗癌藥物為her-2抑制劑。
在本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中，mtt實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在人正常乳腺細(xì)胞mcf10a、人正常胃上皮細(xì)胞ges-1抑制試驗(yàn)中，綠原酸分別與曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼聯(lián)合用藥可降低曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼對(duì)人正常乳腺細(xì)胞及胃上皮細(xì)胞的毒性，一定程度上提高該兩種藥物的靶向性。對(duì)乳腺癌細(xì)胞株bt474及胃癌細(xì)胞株nci-n87抑制作用實(shí)驗(yàn)中，綠原酸分別與曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼聯(lián)合用藥達(dá)到了協(xié)同增效的作用。
此外，本發(fā)明體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明無(wú)細(xì)胞增殖抑制的綠原酸劑量能夠逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細(xì)胞株bt474及胃癌細(xì)胞株nkn45的耐藥性，體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果。
最后，在體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，綠原酸與曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼聯(lián)合用藥對(duì)bt474移植瘤及nci-n87移植瘤小鼠達(dá)到了增敏的效果，同時(shí)還減輕了上述藥物的毒副作用。
綜上所述，本發(fā)明所述技術(shù)方案可提高h(yuǎn)er-2抑制劑在乳腺癌、胃癌中的靶向性，降低其毒副作用，并逆轉(zhuǎn)her-2抑制劑的耐藥性。
以上是對(duì)發(fā)明內(nèi)容的詳細(xì)分析，下面為該發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例1mtt測(cè)定聯(lián)合用藥的增殖抑制
1.1材料
受試藥品：綠原酸、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼
細(xì)胞株：乳腺癌細(xì)胞株bt474細(xì)胞、胃癌細(xì)胞株nci-n87、人正常乳腺細(xì)胞mcf10a、人正常胃上皮細(xì)胞ges-1。
1.2方法
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞一瓶，pbs洗滌2次，0.25％胰蛋白酶消化，用含10％小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)。無(wú)菌條件下接種于96孔培養(yǎng)板，接種細(xì)胞數(shù)均為5×l03/孔。細(xì)胞于37℃、5％co2孵箱中分別孵育24h后更換培養(yǎng)基。細(xì)胞分為，陰性對(duì)照組、her-2抑制劑藥物單獨(dú)用藥組、綠原酸組以及聯(lián)合用藥組，空白對(duì)照組不接種細(xì)胞。每個(gè)孔培養(yǎng)液和藥物總量為200μl,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并以等體積培養(yǎng)液代替藥物作為空白對(duì)照。繼續(xù)置5％co2飽和濕度37℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48h后，每孔加入濃度為5mg/mlmtt20μl繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄孔內(nèi)液體，加150μl二甲基亞楓溶解沉淀，充分振蕩10min，溶解結(jié)晶物。選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，計(jì)算抑制率及聯(lián)合指數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
1.3數(shù)據(jù)處理
(1)抑制率＝(1-od570(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/od570(對(duì)照組-空白組))*100％。
(2)聯(lián)合用藥以公式q＝e(a+b)/(ea+eb-ea×eb)計(jì)算有無(wú)協(xié)同作用。其中e(a+b)為兩藥合用的抑制率，即實(shí)測(cè)合并效應(yīng)，ea和eb為兩藥單用時(shí)的抑制率，分母(ea+eb-ea×eb)為期望合并效應(yīng)，q為兩者比值。q值在0.85～1.15時(shí)，兩藥合并效應(yīng)為相加(+)，q值在1.15～20時(shí)為協(xié)同(++)，q值＞20為明顯協(xié)同(+++)，q值在0.05～0.85時(shí)為拮抗，q值＜0.05為明顯拮抗
1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.4.1單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對(duì)不同正常細(xì)胞株的影響
表1單獨(dú)用藥對(duì)不同正常細(xì)胞株的影響
表2聯(lián)合用藥對(duì)不同正常細(xì)胞株的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在人正常乳腺細(xì)胞mcf10a、人正常胃上皮細(xì)胞ges-1抑制試驗(yàn)中，綠原酸(20μg/ml)單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，ic50值分別為1365.6ug/ml、1118.4ug/ml，說(shuō)明綠原酸本身對(duì)正常細(xì)胞株無(wú)毒性。在人正常乳腺細(xì)胞mcf10a抑制試驗(yàn)中，綠原酸(20μg/ml)分別與曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼聯(lián)合用藥ic50值均高于單獨(dú)使用時(shí)的ic50值，說(shuō)明綠原酸可降低曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼對(duì)人正常乳腺細(xì)胞mcf10ab的毒性，一定程度上提高此類藥物的靶向性。在人正常胃上皮細(xì)胞ges-1抑制試驗(yàn)中，綠原酸(20μg/ml)分別與曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼聯(lián)合用藥ic50值均高于單獨(dú)使用時(shí)的ic50值，說(shuō)明綠原酸可降低曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼對(duì)人正常乳腺細(xì)胞mcf10ab的毒性，一定程度上提高該兩種藥物的靶向性。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明綠原酸可降低her-2抑制劑的毒副作用，一定程度上提高其靶向性。
1.4.2單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的影響
表3單獨(dú)用藥對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的影響
表4her-2抑制劑藥物與綠原酸聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞株bt474細(xì)胞抑制作用
結(jié)果顯示，在her-2抑制劑與綠原酸聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞株bt474抑制作用實(shí)驗(yàn)中，50ug/ml曲妥珠單抗與10-50μg/ml綠原酸聯(lián)合用藥的q值在1.15～20，兩藥合并效應(yīng)為協(xié)同(++)；100ug/ml帕妥珠單抗與10-50μg/ml綠原酸聯(lián)合用藥的q值在1.15～20，兩藥合并效應(yīng)為協(xié)同(++)；6ug/ml拉帕替尼與10-50μg/ml綠原酸聯(lián)合用藥的q值在1.15～20，兩藥合并效應(yīng)為協(xié)同(++)。
表5以her-2抑制劑藥物與綠原酸聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞株nci-n87抑制作用
結(jié)果顯示，在her-2抑制劑藥物與綠原酸聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞株nci-n87抑制作用實(shí)驗(yàn)中，50ug/ml曲妥珠單抗與10-50μg/ml綠原酸聯(lián)合用藥的q值在1.15～20，兩藥合并效應(yīng)為協(xié)同(++)；100ug/ml帕妥珠單抗與10-50μg/ml綠原酸聯(lián)合用藥的q值在1.15～20，兩藥合并效應(yīng)為協(xié)同(++)；6ug/ml拉帕替尼與10-50μg/ml綠原酸聯(lián)合用藥的q值在1.15～20，兩藥合并效應(yīng)為協(xié)同(++)。
實(shí)施例2綠原酸體外逆轉(zhuǎn)人乳腺癌及胃癌細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗和拉帕替尼的耐藥性
2.1材料
受試藥品：綠原酸、曲妥珠單抗、拉帕替尼。
細(xì)胞株：乳腺癌細(xì)胞株bt474細(xì)胞及胃癌細(xì)胞株nci-n87為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)細(xì)株，臨用前傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞備用。
2.2試驗(yàn)方法
2.2.1耐藥細(xì)胞株的培育
乳腺癌細(xì)胞株bt474與胃癌細(xì)胞株nci-n87分別暴露于曲妥珠單抗50ug/ml長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，離心，培養(yǎng)出曲妥珠單抗耐藥的bt474/ny細(xì)胞與nci-n87/ny細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞，3天左右1傳3傳代，保證細(xì)胞活力。
2.2.2檢測(cè)曲妥珠單抗對(duì)細(xì)胞株與耐藥株的ic50，計(jì)算耐藥倍數(shù)
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述的細(xì)胞株及耐藥細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×103個(gè)/孔接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)分別分成3組：空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M只加入培養(yǎng)基，無(wú)需接種細(xì)胞；對(duì)照組加培養(yǎng)基并接種細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組在上述基礎(chǔ)上再加入不同濃度的曲妥珠單抗工作液，置于培養(yǎng)箱孵育48h后每孔加入5mg/mlmtt20μl，繼續(xù)孵育4h，吸去上液，每孔加入dmso150μl，靜置30min，待結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處各孔吸光值od值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率＝(1-od570(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/od570(對(duì)照組-空白組))×100％。計(jì)算ic50。耐藥倍數(shù)＝耐藥細(xì)胞ic50值/敏感細(xì)胞ic50值。
2.2.3mtt法測(cè)定無(wú)細(xì)胞毒的綠原酸濃度
細(xì)胞及耐藥細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法同上。實(shí)驗(yàn)分別分成3組：空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M只加入培養(yǎng)基，無(wú)需接種細(xì)胞；對(duì)照組加培養(yǎng)基并接種細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組在上述基礎(chǔ)上再加入不同濃度的綠原酸工作液，使其最終濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、128μg/ml，置于培養(yǎng)箱孵育48h后每孔加入5mg/mlmtt20μl，繼續(xù)孵育4h，吸去上液，每孔加入dmso150μl，靜置30min，待結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處各孔吸光值od值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率＝(1-od570(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/od570(對(duì)照組-空白組))×100％，取抑制率10％以下濃度的綠原酸濃度作為無(wú)毒劑量的逆轉(zhuǎn)濃度。
2.2.4綠原酸逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株的作用
細(xì)胞培養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)方法同上。實(shí)驗(yàn)分組如下：耐藥細(xì)胞陰性組、耐藥細(xì)胞+綠原酸10ug/ml組、耐藥細(xì)胞+綠原酸20ug/ml組，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的曲妥珠單抗，每個(gè)濃度3復(fù)孔，測(cè)定各孔的od值，觀察無(wú)細(xì)胞毒性綠原酸(10μg/ml、20μg/ml)聯(lián)合曲妥珠單抗作用于耐藥細(xì)胞與曲妥珠單抗單用于對(duì)耐藥細(xì)胞的效果做比較,計(jì)算曲妥珠單抗對(duì)耐藥細(xì)胞株的ic50以及用10ug/ml，20ug/ml逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株后的ic50。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝逆轉(zhuǎn)前ic50值/逆轉(zhuǎn)后ic50值。
2.3試驗(yàn)結(jié)果
2.3.1耐藥倍數(shù)
2.3.1.1曲妥珠對(duì)乳腺癌細(xì)胞株bt474及bt474/ny的ic50分別為51.5ug/ml和162ug/mll。按公式計(jì)算出耐藥倍數(shù)為3.17。
2.3.1.2曲妥珠對(duì)胃癌細(xì)胞株nci-n87及nci-n87/ny的ic50分別為78.3ug/ml和491ug/ml。按公式計(jì)算出耐藥倍數(shù)為6.27。
2.3.2mtt法測(cè)定對(duì)耐藥細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒的綠原酸濃度結(jié)果
2.3.2.1綠原酸對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞bt474/ny均有抑制增殖作用，ic50為3577ug/ml。當(dāng)綠原酸濃度低于357.7μg/ml時(shí)，對(duì)bt474/ny耐藥細(xì)胞的抑制率均<10％,無(wú)顯著細(xì)胞毒性。
2.3.2.2綠原酸對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞nci-n87/ny均有抑制增殖作用，ic50為3210ug/ml。當(dāng)綠原酸濃度低于321μg/ml時(shí)，對(duì)nci-n87/ny耐藥細(xì)胞的抑制率均<10％,無(wú)顯著細(xì)胞毒性。
2.3.3綠原酸對(duì)乳腺癌及胃癌耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用
綠原酸無(wú)細(xì)胞毒濃度(10μg/ml、20μg/ml)作用于乳腺癌耐藥細(xì)胞bt474/ny之后，曲妥珠單抗對(duì)耐藥細(xì)胞株bt474/ny的ic50降低。10μg/ml綠原酸作為逆轉(zhuǎn)劑時(shí)，曲妥珠單抗對(duì)bt474/ny的ic50為71.4ug/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.67，以20μg/ml綠原酸作為逆轉(zhuǎn)劑時(shí)，曲妥珠單抗對(duì)bt474/ny的ic50為60.4ug/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.68。如表6所示
綠原酸無(wú)細(xì)胞毒濃度(10μg/ml、20μg/ml)作用于胃癌耐藥細(xì)胞nci-n87/ny之后，曲妥珠單抗對(duì)耐藥細(xì)胞株nci-n87/ny的ic50降低。10μg/ml綠原酸作為逆轉(zhuǎn)劑時(shí)，曲妥珠單抗對(duì)nci-n87/ny的ic50為71.4ug/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.67，以20μg/ml綠原酸作為逆轉(zhuǎn)劑時(shí)，曲妥珠單抗對(duì)nci-n87/ny的ic50為80.7ug/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為6.08。如表7所示
表6綠原酸對(duì)bt474/ny耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用
表7綠原酸對(duì)nci-n87/ny耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用
2.4小結(jié)
無(wú)細(xì)胞增殖抑制的綠原酸劑量能夠逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細(xì)胞株bt474及胃癌細(xì)胞株nkn45的耐藥性，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)與劑量有一定相關(guān)性。
實(shí)施例3綠原酸與以her-2靶向抑制劑的藥物聯(lián)合體內(nèi)抑瘤的增效減毒作用
3.1材料與儀器
受試藥品：綠原酸、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼。
細(xì)胞株：乳腺癌細(xì)胞株bt474細(xì)胞、胃癌細(xì)胞株nci-n87為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)細(xì)株，臨用前傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞備用。
受試動(dòng)物：babl/c-nu小鼠，18-22g，雌
3.2試驗(yàn)方法
3.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤模型的建立
收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1000rpm離心5min，細(xì)胞沉用pbs洗滌2次，計(jì)數(shù)后用無(wú)血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/m1，無(wú)菌條件下送到動(dòng)物室。在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)條件下，小鼠右側(cè)腋窩皮下注射1×107/m1的細(xì)胞，每只0.1ml，注射局部出現(xiàn)明顯皮丘，1周后裸鼠左側(cè)腋窩處出現(xiàn)米粒大結(jié)節(jié)，說(shuō)明移植模型成功建立，此時(shí)按照隨機(jī)分組法分成12組。
待腫瘤平均直徑達(dá)100mm3后開(kāi)始治療，每天腹腔注射一次，生理鹽水對(duì)照組給0.2ml無(wú)菌生理鹽水。
3.2.3抗腫瘤作用評(píng)價(jià)
觀察給藥后每天測(cè)動(dòng)物體重；待陰性組瘤體積約為0.5cm3時(shí)停止實(shí)驗(yàn)，眼球摘除取血測(cè)定wbc、hbc及hgb含量，脫頸椎處死小鼠并稱重，剝?nèi)∧[瘤并稱重。
抑瘤率＝(對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100％。
兩藥合并q＝e(a+b)/(ea+eb-ea×eb)，其中e(a+b)為兩藥合用的抑制率，即實(shí)測(cè)合并效應(yīng)，ea和eb為兩藥單用時(shí)的抑制率，分母(ea+eb-ea×eb)為期望合并效應(yīng)，q為兩者比值。q值在0.85～1.15時(shí)，兩藥合并效應(yīng)為相加(+)，q值在1.15～20時(shí)為協(xié)同(++)，q值＞20為明顯協(xié)同(+++)，q值在0.05～0.85時(shí)為拮抗，q值＜0.05為明顯拮抗。
3.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示。組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05認(rèn)為有差異，p<0.01認(rèn)為有顯著性差異。
3.3試驗(yàn)結(jié)果
3.3.1聯(lián)合用藥對(duì)抑瘤率的影響
表8綠原酸對(duì)乳腺癌bt474移植瘤的抑瘤率
與陰性組比較*p＜0.05，**p＜0.01；與陽(yáng)性組比較△p＜0.05，△△p＜0.01
表9綠原酸對(duì)胃癌nci-n87移植瘤的抑瘤率
與模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01；與陽(yáng)性組比較△p＜0.05，△△p＜0.01
如表8、表9所示，綠原酸，曲妥珠單抗，帕妥珠單抗，拉帕替尼使用較低劑量，對(duì)乳腺癌、胃癌移植瘤有較弱的抑制作用，與模型空白組比較無(wú)顯著性差異。但綠原酸與抑制劑聯(lián)合使用有較好的抑瘤作用，與單用相比有顯著性差異。聯(lián)合用藥q值計(jì)算結(jié)果表明，綠原酸與曲妥珠單抗、帕妥珠單抗以及拉帕替尼聯(lián)用有協(xié)同效應(yīng)。
3.3.2聯(lián)合用藥對(duì)小鼠體重的影響
表10綠原酸對(duì)bt474移植瘤小鼠體重的影響
與陰性組比較*p＜0.05，**p＜0.01；與陽(yáng)性組比較△p＜0.05，△△p＜0.01
表11綠原酸對(duì)nci-n87移植瘤小鼠體重的影響
與陰性組比較*p＜0.05，**p＜0.01；與陽(yáng)性組比較△p＜0.05，△△p＜0.01
結(jié)果顯示，第15天綠原酸聯(lián)合用藥組的體重大于her-2抑制劑單獨(dú)用藥組，結(jié)果有差異，表明綠原酸聯(lián)合用藥組可提高小鼠體重，改善小鼠機(jī)能狀態(tài)。
3.3.3聯(lián)合用藥的對(duì)小鼠血常規(guī)的影響
表12聯(lián)合用藥對(duì)bt474移植瘤小鼠血常規(guī)的影響
與陰性組比較*p＜0.05，**p＜0.01；與陽(yáng)性組比較△p＜0.05，△△p＜0.01
表13聯(lián)合用藥對(duì)nci-n87移植瘤小鼠血常規(guī)的影響
與陰性組比較*p＜0.05，**p＜0.01；與陽(yáng)性組比較△p＜0.05，△△p＜0.01。