本發(fā)明涉及一種茜草提取物的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
：茜草，是茜草科植物茜草rubiacordifolial.的干燥根及根莖，也是我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥之一。主要含有蒽醌及其苷類(lèi)、萘醌及其苷類(lèi)、多糖類(lèi)、環(huán)己肽類(lèi)、微量元素等成分?！吨袊?guó)藥典》記載其性寒，味苦，歸肝經(jīng)，可通經(jīng)、祛瘀、涼血、止血，臨床上主要用于衄血、吐血、崩漏、外傷出血、瘀阻經(jīng)閉、跌撲腫痛等，對(duì)心腦血管疾病有顯著療效?，F(xiàn)代研究表明，茜草具有抗氧化、升高白細(xì)胞及免疫抑制作用、護(hù)肝、解熱鎮(zhèn)痛以及止咳祛痰的作用，而且在抗菌消炎、抑制腫瘤等方面也取得了良好的效果。人體內(nèi)在利用氧為人的生命活動(dòng)提供能量的過(guò)程中，會(huì)因各種原因而產(chǎn)生活性氧和自由基。由于體內(nèi)有消除活性氧和自由基的防御體系，所以人體內(nèi)的氧化與抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡。但當(dāng)壓力增大、年齡增大、輻射等原因，會(huì)使體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于失衡狀態(tài)，這時(shí)就會(huì)誘發(fā)各種組織損傷和疾病。研究表明，如果通過(guò)補(bǔ)充抗氧化劑使得機(jī)體自由基的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài)，就能有效防止自由基對(duì)細(xì)胞和組織的損傷，從而預(yù)防各種疾病的發(fā)生抗氧化劑能調(diào)節(jié)機(jī)體自由基的產(chǎn)生與消除間的平衡，防止自由基對(duì)細(xì)胞和組織的損傷，是預(yù)防細(xì)胞活力下降、機(jī)體衰老、色素形成、細(xì)胞癌變、糖尿病等80余種疾病的有效措施之一。因此，物質(zhì)的抗氧化活性在某種程度上預(yù)示著其具有治療某種或幾種疾病的潛在能力。茜草中的抗氧化有效成分以大葉茜草素等蒽醌酚類(lèi)為主，還有少量的黃酮類(lèi)化合物，目前茜草抗氧化成分的提取方法主要為溶劑萃取法、微波提取、超聲波提取等，使用有機(jī)溶劑進(jìn)行，存在有機(jī)殘留的問(wèn)題；而且目前茜草抗氧化成分的提取方法中抗氧化有效組分的收率較低，其中溶劑萃取法收率為1.8％(提取物/原藥材)，微波提取法收率為0.6％(單一成分/原藥材)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法過(guò)程復(fù)雜，存在有機(jī)殘留，抗氧化有效組分的收率較低的問(wèn)題，提供一種茜草抗氧化有效成分的制備方法及用途。本發(fā)明茜草抗氧化有效組分的制備方法，包括以下步驟：一、取茜草藥材粉末，加入質(zhì)量百分濃度為94％～96％的乙醇，茜草藥材粉末與乙醇的質(zhì)量比為1:(9～11)，浸泡12～14h，然后超聲處理30～40min，過(guò)濾，分別收集固相物a和液相物a；將固相物a加入質(zhì)量百分濃度為94％～96％的乙醇中浸泡8～10h，固相物a與乙醇的質(zhì)量比為1:(9～11)，然后超聲處理30～40min，過(guò)濾，分別收集固相物b和液相物b；將固相物b加入質(zhì)量百分濃度為94％～96％的乙醇中浸泡4～6h，固相物b與乙醇的質(zhì)量比為1:(9～11)，然后超聲處理30～40min，過(guò)濾，分別收集固相物c和液相物c；然后將液相物a、液相物b和液相物c混合，得到浸提液，將浸提液減壓濃縮得浸膏；二、將步驟一得到的固體浸膏用少量蒸餾水溶解后上到大孔樹(shù)脂色譜柱上，先用蒸餾水洗滌4個(gè)柱體積，再用質(zhì)量濃度為94％～96％的乙醇洗脫4個(gè)柱體積，收集洗脫液，然后減壓濃縮洗脫液至干，得到干燥固體d；三、將步驟二得到的干燥固體d用質(zhì)量濃度為94％～96％的乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜梯度洗脫，分別收集16.0-20.0,20.0-24.0,24.0-28.0,28.0-32.0,34.0-38.0分鐘洗脫液，經(jīng)干燥后得到有效組分分別稱(chēng)為有效組分1，有效組分2，有效組分3，有效組分4，有效組分5。這五個(gè)組分均具有抗氧化活性。進(jìn)一步的，所述步驟三中的制備液相色譜的流動(dòng)相為甲醇-0.2％磷酸水溶液；進(jìn)一步的，所述步驟三中的梯度洗脫程序?yàn)?min→10min→20min→30min→45min→50min，流動(dòng)相中甲醇的體積比30％→60％→70％→75％→100％→100％。進(jìn)一步的，所述步驟三中的液相色譜條件為：色譜柱ymc-packods-a，規(guī)格為250×20mm；柱溫為35℃；流速10ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。本發(fā)明的茜草抗氧化有效成分作為抗氧化劑在制備抗衰老的食品、藥品、化妝品及保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明的茜草抗氧化有效成分可與藥物載體混合制備成各種藥物制劑，包括口服劑型、注射劑等。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明使用大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化，能有效地去除多糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等大極性的雜質(zhì)，提高有效成分的含量，快速準(zhǔn)確地富集有效組分。大孔樹(shù)脂洗脫物中的抗氧化有效組分的收率較高，可達(dá)到6.7％，再經(jīng)高效液相分離，成功獲得具有顯著抗氧化作用的5個(gè)有效組分。本方法的分離步驟僅兩步，方法簡(jiǎn)單、快速，成本較低，而且不涉及到有機(jī)溶劑，可同時(shí)得到5個(gè)有效組分，可實(shí)用性強(qiáng)。本發(fā)明所提取的茜草抗氧化有效組分具有較強(qiáng)的清除dpph自由基的能力，且frap試驗(yàn)測(cè)定其具有較強(qiáng)的總抗氧化能力，具有潛在的抗腫瘤、抗病毒、降血糖等與抗氧化活性相關(guān)的藥理作用，可開(kāi)發(fā)成相應(yīng)的制劑用于臨床。本發(fā)明所涉及的茜草抗氧化有效組分的制備方法較少的使用了有機(jī)溶劑，避免了有機(jī)殘留的問(wèn)題，且步驟簡(jiǎn)單，成本較低，可實(shí)用性強(qiáng)。本發(fā)明所涉及的藥物組合可接受各種載體的賦型劑制成各種制劑，應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明提供的茜草抗氧化有效組分既可以作為從天然植物中獲得的抗氧化劑在食品等領(lǐng)域應(yīng)用，也可以作為藥物組合物將來(lái)開(kāi)發(fā)成藥理活性與抗氧化相關(guān)的新藥應(yīng)用于臨床。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1制備的茜草有效成分的hplc分析圖；其中1至5分別為有效組分1至5；s為干燥固體d的樣品液。具體實(shí)施方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式茜草抗氧化有效組分的制備方法，包括以下步驟：一、取茜草藥材粉末，加入質(zhì)量百分濃度為94％～96％的乙醇，茜草藥材粉末與乙醇的質(zhì)量比為1:(9～11)，浸泡12～14h，然后超聲處理30～40min，過(guò)濾，分別收集固相物a和液相物a；將固相物a加入質(zhì)量百分濃度為94％～96％的乙醇中浸泡8～10h，固相物a與乙醇的質(zhì)量比為1:(9～11)，然后超聲處理30～40min，過(guò)濾，分別收集固相物b和液相物b；將固相物b加入質(zhì)量百分濃度為94％～96％的乙醇中浸泡4～6h，固相物b與乙醇的質(zhì)量比為1:(9～11)，然后超聲處理30～40min，過(guò)濾，分別收集固相物c和液相物c；然后將液相物a、液相物b和液相物c混合，得到浸提液，將浸提液減壓濃縮得浸膏；二、將步驟一得到的固體浸膏用少量蒸餾水溶解后上到大孔樹(shù)脂色譜柱上，先用蒸餾水洗滌4個(gè)柱體積，再用質(zhì)量濃度為94％～96％的乙醇洗脫4個(gè)柱體積，收集洗脫液，然后減壓濃縮洗脫液至干，得到干燥固體d；三、將步驟二得到的干燥固體d用質(zhì)量濃度為94％～96％的乙醇乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜梯度洗脫，分別收集16.0-20.0,20.0-24.0,24.0-28.0,28.0-32.0,34.0-38.0分鐘洗脫液，經(jīng)干燥后得到5種有效組分，分別為有效組分1、有效組分2、有效組分3、有效組分4和有效組分5。具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟三中的制備液相色譜的流動(dòng)相為甲醇-0.2％磷酸水溶液。其它與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是：步驟三中的梯度洗脫程序?yàn)?min→10min→20min→30min→45min→50min，甲醇的體積比30％→60％→70％→75％→100％→100％。其它與具體實(shí)施方式一或二相同。具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：步驟三中的液相色譜條件為：色譜柱ymc-packods-a，規(guī)格為250×20mm；柱溫為35℃；流速10ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。其它與具體實(shí)施方式一至三之一相同。具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式茜草抗氧化有效成分作為抗氧化劑在制備抗衰老的食品、藥品、化妝品及保健品中的應(yīng)用。具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式五不同的是：茜草抗氧化有效成分與藥物載體混合制備成藥物制劑。其它與具體實(shí)施方式五相同。下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方案和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1：本實(shí)施例茜草抗氧化有效組分的制備方法，包括以下步驟：一、取茜草藥材粉末，加入質(zhì)量百分濃度為95％的乙醇，茜草藥材粉末與乙醇的質(zhì)量比為1:10，浸泡12h，然后超聲處理30min，過(guò)濾，分別收集固相物a和液相物a；將固相物a加入質(zhì)量百分濃度為95％的乙醇中浸泡8h，固相物a與乙醇的質(zhì)量比為1:10，然后超聲處理30min，過(guò)濾，分別收集固相物b和液相物b；將固相物b加入質(zhì)量百分濃度為95％的乙醇中浸泡5h，固相物b與乙醇的質(zhì)量比為1:10，然后超聲處理30min，過(guò)濾，分別收集固相物c和液相物c；然后將液相物a、液相物b和液相物c混合，得到浸提液，將浸提液減壓濃縮得浸膏；二、將步驟一得到的固體浸膏用少量蒸餾水溶解后上到大孔樹(shù)脂色譜柱上，先用蒸餾水洗滌4個(gè)柱體積，再用質(zhì)量濃度為95％的乙醇洗脫4個(gè)柱體積，收集洗脫液，然后減壓濃縮洗脫液至干，得到干燥固體d；三、將步驟二得到的干燥固體d用質(zhì)量濃度為95％的乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜梯度洗脫，分別收集16.0-20.0,20.0-24.0,24.0-28.0,28.0-32.0,34.0-38.0分鐘洗脫液，經(jīng)干燥后得到有效組分分別稱(chēng)為有效組分1，有效組分2，有效組分3，有效組分4，有效組分5。所述步驟三中的制備液相色譜的流動(dòng)相為甲醇-0.2％磷酸水溶液；所述步驟三中的梯度洗脫程序?yàn)?min→10min→20min→30min→45min→50min，流動(dòng)相中甲醇的體積比30％→60％→70％→75％→100％→100％。所述步驟三中的液相色譜條件為：色譜柱ymc-packods-a，規(guī)格為250×20mm；柱溫為35℃；流速10ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。本實(shí)施例中抗氧化有效組分的收率為6.7％。對(duì)本實(shí)施例提取到的5個(gè)有效組分進(jìn)行以下試驗(yàn)：試驗(yàn)1、dpph自由基清除法測(cè)定上述茜草有效組分的抗氧化活性：用質(zhì)量百分含量為95％的乙醇溶液分別將5個(gè)有效組分溶解成濃度為2mg/ml的溶液，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，將所得的續(xù)濾液用于dpph自由基清除法測(cè)定抗氧化活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，根據(jù)抑制率(％)＝[1-(a1-a2)/a0]×100％計(jì)算；其中a0為不含有效組分的對(duì)照吸光度；a1為含有效組分的吸光度；a2是不含dpph的吸光度。為比較茜草有效組分的抗氧化活性與維生素c(vc)的抗氧化能力大小，對(duì)上述5個(gè)有效組分與vc的ec50值進(jìn)行了測(cè)定。ec50值即清除50％原始dpph濃度所需抗氧化劑的用量，ec50值越小，樣品清除自由基能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。具體操作如下：分別移取2.0mg/ml的有效組分溶液0.80ml、0.40ml、0.20ml、0.10ml、0.05ml與2mldpph溶液混合，再用乙醇溶液補(bǔ)至4ml，充分混合后在暗處反應(yīng)30min，于517nm處測(cè)定吸光度值(a1)，同時(shí)將上述5個(gè)濃度的樣品溶液分別用乙醇溶液補(bǔ)至4ml，測(cè)混合液吸光值(a2)，以及2mldpph與2ml乙醇混合液的吸光值(a0)，按公式計(jì)算抑制率。然后運(yùn)用graphpadprism軟件進(jìn)行曲線(xiàn)擬合得出5個(gè)茜草有效組分的ec50值。同法測(cè)定vc的ec50值做陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果如表1所示。茜草抗氧化有效組分的ec50在0.010-0.030mg/ml之間，與vc的抗氧化能力相當(dāng)，顯示了較強(qiáng)的抗氧化活性。本試驗(yàn)的dpph溶液的制備方法：稱(chēng)取8mg的dpph粉末，用質(zhì)量百分含量為95％乙醇定容至100ml，得初始濃度為2×10-4mol/l的dpph溶液，放置于4℃下冷藏備用。表15個(gè)茜草抗氧化有效組分的ec50值組分編號(hào)ec50(mg/ml)有效組分10.010有效組分20.012有效組分30.029有效組分40.030有效組分50.011vc0.009試驗(yàn)2、frap法測(cè)定上述茜草有效組分的總抗氧化能力：一、feso4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制在反應(yīng)管中準(zhǔn)確移取0.1mmol/l，0.2mmol/l，0.4mmol/l，0.8mmol/l，1.6mmol/l的feso4的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml，再準(zhǔn)確加入6mlfrap工作液(由0.3mol/l醋酸鹽緩沖液，10mmol/ltptz溶液，20mmol/lfecl3溶液以10：1：1的比例組成，現(xiàn)配現(xiàn)用)，0.6ml蒸餾水，混勻，37℃條件下反應(yīng)10min，于593nm處測(cè)定吸光度值。以feso4濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，應(yīng)用excel擬合得到feso4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。feso4濃度在0.1～1.6mmol/l范圍內(nèi)與吸光度有良好的線(xiàn)性關(guān)系?；貧w方程為y＝0.7734x-0.0044,r2＝0.9998二、frap法測(cè)定上述茜草有效組分的總抗氧化能力在反應(yīng)管中準(zhǔn)確移取0.2ml0.5mg/ml樣品溶液，再準(zhǔn)確加入6mlfrap工作液，0.6ml蒸餾水，混勻，37℃條件下反應(yīng)10min，于593nm處測(cè)定吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。將測(cè)得的上述茜草有效組分樣品的吸光度值代入feso4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，經(jīng)計(jì)算得frap值，同法測(cè)定vc的frap值做陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果列于表2。從表中可以看出，茜草的抗氧化有效組分的frap值范圍為1.16～1.90mmol/g，與vc的抗氧化能力相當(dāng)，顯示了較強(qiáng)的總抗氧化能力。表2茜草有效組分的frap值當(dāng)前第1頁(yè)12