背景技術(shù)：

1、目前有一些方法可用于了解生命系統(tǒng)中分子事件的順序。例如，第一種方法是直接觀察，例如活細(xì)胞熒光顯微術(shù)以實(shí)時量化相互作用。第二種方法是時間序列實(shí)驗(yàn)，例如，在不同時間點(diǎn)對系統(tǒng)進(jìn)行破壞性采樣和轉(zhuǎn)錄分析。第三種方法是上位分析，例如，通過比較單突變體和雙突變體的表型來對基因的作用進(jìn)行排序。盡管這些方法和其他方法具有重要的優(yōu)點(diǎn)，但它們在關(guān)鍵方面也受到限制。具體來說，實(shí)時成像很大程度上局限于體外模型。對于時間序列實(shí)驗(yàn)，分辨率和準(zhǔn)確性受到采樣頻率和所研究的生物過程的再現(xiàn)性的限制。上位分析受到基因多效性的影響，特別是在多細(xì)胞生物中。

2、理論上很有前途，但相對于上述替代方案在方法上尚不成熟的另一種方法是dna存儲設(shè)備，它被定義為一種工程化系統(tǒng)，用于通過對細(xì)胞基因組的永久變化來記錄可在事后讀出的分子事件。迄今為止，已經(jīng)描述了幾種概念驗(yàn)證的dna存儲設(shè)備，它們利用不同的方法進(jìn)行“寫入”操作，包括位點(diǎn)特異性重組酶(ssr)、crispr/cas9基因組編輯、crispr整合酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、堿基-配對錯誤摻入、堿基編輯等。

3、這種dna存儲設(shè)備中的寫入操作的性質(zhì)決定了它們在編碼和解碼信號的通道容量、時間分辨率、可解釋性和可移植性方面的性能。例如，ssr高效記錄分子信號，但可以同時記錄的不同信號的數(shù)量受到可用的ssr的數(shù)量的限制。依賴crispr/cas9的dna存儲設(shè)備有可能克服這一限制，例如，如果每個感興趣的信號與不同引導(dǎo)rna(grna)的表達(dá)耦合，但在這種情況下，每個信號也需要自己的靶標(biāo)。此外，迄今為止描述的crispr/cas9分子記錄器依賴于雙鏈斷裂(dsb)和非同源末端連接(nhej)來“破壞(scar)”靶標(biāo)位點(diǎn)。除了有毒之外，頻繁的dsb還經(jīng)常切除或破壞連續(xù)定位的靶標(biāo)位點(diǎn)，這在分子上等效于意外數(shù)據(jù)刪除。

4、迄今為止所描述的幾乎所有dna存儲設(shè)備的另一個缺陷是，雖然記錄可能在無序的靶標(biāo)位點(diǎn)隨機(jī)累積，但它們發(fā)生的順序并未被明確捕獲。依靠將dna間隔區(qū)或轉(zhuǎn)錄衍生標(biāo)簽信號誘導(dǎo)地、單向地?fù)饺氲綌U(kuò)展的crispr陣列中的crispr整合酶系統(tǒng)克服了這一限制。然而，至少迄今為止，它們對輔助整合宿主因子的依賴將此類記錄器限制在原核系統(tǒng)中。另一種方法chyron通過將自靶向crispr?grna與末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)的表達(dá)相結(jié)合，能夠?qū)⑿畔⒍ㄏ驅(qū)懭雂na，tdt的存在將nhej最可能的結(jié)果從短缺失轉(zhuǎn)變?yōu)槎滩迦?。雖然這種方法以信號響應(yīng)方式單向插入核苷酸，但它仍然依賴于nhej介導(dǎo)的dsb修復(fù)。此外，由于每個grna/靶標(biāo)都會產(chǎn)生同質(zhì)信號(tdt介導(dǎo)的可變長度插入)，因此尚不清楚如何使用它來明確記錄多個不同信號的精確順序。最后，至少有兩個小組獨(dú)立開發(fā)了“邏輯回路架構(gòu)”，其使用順序堿基編輯來記錄細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞(domino和camera)中生物信號的順序和身份。然而，由于堿基編輯器目前僅限于將單堿基替換寫入預(yù)定義的靶標(biāo)，因此信號的順序只能通過預(yù)編程回路來記錄，這使得多重記錄具有挑戰(zhàn)性。

5、上文對于理解分子事件順序所描述的許多限制對于理解基因表達(dá)也同樣適用，因?yàn)樯锵到y(tǒng)是復(fù)雜且動態(tài)的。在發(fā)育過程中，利用適量的核心信號傳導(dǎo)途徑和基因調(diào)節(jié)模塊來對細(xì)胞分化、增殖、形態(tài)發(fā)生和組織模式的程序進(jìn)行精確的時空展開。在不同物種中，這些保守途徑和模塊使用方式的差異構(gòu)成了生物體形式和功能令人難以置信的多樣性。在物種內(nèi)，遺傳差異和環(huán)境影響被認(rèn)為會影響特定發(fā)育或穩(wěn)態(tài)背景下的這些核心模塊，從而引起自然表型變異和多種疾病狀態(tài)。

6、基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的測量通常采用需要生物樣品的破壞或?qū)崟r成像的方法來進(jìn)行。這些包括rna測序(rna-seq)，其測量系統(tǒng)的全局轉(zhuǎn)錄狀態(tài)；大規(guī)模并行報告測定(mpra)，其利用測序來測量dna片段文庫成員在受控環(huán)境中作為轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)子的相對能力；以及熒光探針和報告因子，其追蹤生命系統(tǒng)中特定信號傳導(dǎo)途徑的動態(tài)。

7、這些方法非常有用，但在關(guān)鍵方面受到限制。例如，對于rna-seq，個體樣品僅提供細(xì)胞狀態(tài)的靜態(tài)快照，因此必須通過推理將基因表達(dá)的時間動態(tài)拼湊在一起，其分辨率受采樣密度的限制?；跍y序的報告因子測定也是破壞性的和靜態(tài)的。盡管時間序列mpra可以成功定義增強(qiáng)子活動的時間動態(tài)，但此類研究同樣受到推理和采樣密度的限制。熒光探針和報告因子可以更好地捕獲時間動態(tài)，但要求生物系統(tǒng)在物理上是透明的，至少對于實(shí)時成像而言如此，并且在多重性方面受到限制?？傮w而言，仍然需要一種捕獲信號傳導(dǎo)和基因調(diào)節(jié)活性的方法，該方法同時是定量的、可重復(fù)的、非破壞性的、可復(fù)用的、適用于物理不透明的生物系統(tǒng)并且能夠整合大量信號。

8、盡管是開創(chuàng)性的，上述用于dna記錄的系統(tǒng)在多重性(即可以一次記錄的獨(dú)立信號的數(shù)量)方面也從根本上受到限制。在迄今為止已被證明的例子中，增強(qiáng)子被用來選擇性地驅(qū)動介導(dǎo)dna序列改變的酶，或者有限的轉(zhuǎn)錄抑制元件被用來響應(yīng)信號來驅(qū)動grna表達(dá)。在這個框架中，每個信號都需要自己的酶或抑制元件，并且很難想象如何在同一細(xì)胞或細(xì)胞群中同時記錄多個獨(dú)立信號，更不用說如何廣泛、同時記錄在多細(xì)胞生物體的整個發(fā)育過程中可以獲得大量的生物信號。

9、當(dāng)前記錄系統(tǒng)面臨的另一個挑戰(zhàn)是讀出。在當(dāng)前基于cas9/base編輯器的記錄系統(tǒng)中，單引導(dǎo)rna(sgrna)對編輯位置進(jìn)行編程，但不對編輯本身進(jìn)行編程。因此，每個sgrna都需要自己的靶標(biāo)，使得很難一次性讀出所有靶標(biāo)。這一挑戰(zhàn)已通過配對sgrna-靶標(biāo)或歸巢grna(hgrna)或自靶向grna(stgrna)得到部分解決，但與最近發(fā)展的rna-seq的兼容性仍然有限。(參見表1中的總結(jié))。理想的記錄器應(yīng)該能夠同時記錄多個信號并通過dna擴(kuò)增子或rna測序?qū)⑵渥x出。

10、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的限制，仍然需要能夠以迭代和單向方式記錄生物信號(包括dna的轉(zhuǎn)錄活性)的高度復(fù)用的基于dna的存儲裝置。本公開內(nèi)容解決了這些和相關(guān)的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、提供此概述是為了以簡化的形式介紹概念的選擇，這些概念將在下面的詳細(xì)描述中進(jìn)一步描述。此概述無意于識別所要求保護(hù)的主題的關(guān)鍵特征，也無意于用作確定所要求保護(hù)的主題的范圍的幫助。

2、根據(jù)前述內(nèi)容，在本發(fā)明的一個方面，本公開內(nèi)容提供了用于記錄迭代核酸編輯事件的核酸構(gòu)建體。該構(gòu)建體可以包含第一活性靶結(jié)構(gòu)域和一個或多個無活性的截短的靶結(jié)構(gòu)域，所述第一活性靶結(jié)構(gòu)域包含被配置為與第一先導(dǎo)編輯引導(dǎo)rna(pegrna)雜交的可編輯記錄序列，所述一個或多個無活性的截短的靶結(jié)構(gòu)域包含被配置為不與pegrna雜交的不可編輯序列，其中第一pegrna編輯第一活性靶結(jié)構(gòu)域，其中該pegrna編輯將重編碼序列的位置從可編輯序列轉(zhuǎn)移至不可編輯序列，從而將可編輯序列改變?yōu)椴豢删庉嬓蛄幸约皩o活性的截短的靶結(jié)構(gòu)域改變?yōu)榈诙钚园薪Y(jié)構(gòu)域，所述第二活性靶結(jié)構(gòu)域包含被配置為與第二pegrna雜交的第二重編碼序列。

3、另一方面，本公開內(nèi)容提供了一種載體，其包含與啟動子偶聯(lián)的編碼如上所述的核酸構(gòu)建體的核酸序列，和/或rna分子的轉(zhuǎn)錄形式。

4、另一方面，本公開內(nèi)容提供了一種用于記錄迭代核酸編輯事件的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：上述核酸構(gòu)建體，或編碼該核酸構(gòu)建體的核酸；一個或多個pegrna或編碼所述一個或多個pegrna的一個或多個核酸，其被配置為與第一活性靶結(jié)構(gòu)域雜交；先導(dǎo)編輯酶，或編碼先導(dǎo)編輯酶的核酸；其中pegrna被配置為與第一活性靶結(jié)構(gòu)域雜交，并且用先導(dǎo)編輯酶將序列插入到無活性的截短的靶結(jié)構(gòu)域的5'處，其中插入的序列從5’至3’包含條形碼標(biāo)簽序列和靶激活序列，并且其中靶激活序列使第一活性靶結(jié)構(gòu)域失活并延伸和激活截短的靶結(jié)構(gòu)域，從而將活性靶結(jié)構(gòu)域的位置在3'方向上移動一個單元。

5、另一方面，本公開內(nèi)容提供了一種迭代記錄編輯事件的方法，該方法包括：將如上所述的核酸構(gòu)建體與一個或多個pegrna和先導(dǎo)編輯酶接觸；其中pegrna被配置為與第一活性靶結(jié)構(gòu)域雜交，并且用先導(dǎo)編輯酶將序列插入到無活性的截短的靶結(jié)構(gòu)域的5'處，其中插入的序列從5’至3’包含條形碼標(biāo)簽序列和靶激活序列，并且其中靶激活序列使第一活性靶結(jié)構(gòu)域失活并延伸和激活截短的靶結(jié)構(gòu)域，從而將活性靶結(jié)構(gòu)域的位置在3'方向上移動一個單元。

6、另一方面，本公開內(nèi)容提供了一種用于多重轉(zhuǎn)錄記錄的方法，該方法包括：使上述核酸與先導(dǎo)編輯引導(dǎo)rna(pegrna)表達(dá)盒、先導(dǎo)編輯酶和核酸內(nèi)切酶接觸，其中所述表達(dá)盒包含啟動子、核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)(其包含位于pegrna?5'的第一核酸內(nèi)切酶靶標(biāo)和位于pegrna3'的第二核酸內(nèi)切酶靶標(biāo))、編碼功能性gfp和/或核酸內(nèi)切酶的任選核酸構(gòu)建體，其中所述核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄區(qū)包含一個或多個pegrna，并且一個或多個pegrna的表達(dá)由啟動子激活驅(qū)動，通過核酸內(nèi)切酶切割核酸內(nèi)切酶靶標(biāo)來釋放一個或多個pegrna；將一個或多個pegrna與靶結(jié)構(gòu)域雜交；和通過插入條形碼標(biāo)簽序列來編輯靶結(jié)構(gòu)域。

7、另一方面，本公開內(nèi)容提供了表達(dá)盒，其包含順式調(diào)節(jié)元件(cre)偶聯(lián)的啟動子序列和從5'至3'編碼第一核酸內(nèi)切酶靶標(biāo)、一個或多個先導(dǎo)編輯引導(dǎo)rna(pegrna)和第二核酸內(nèi)切酶靶標(biāo)的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地連接至cre偶聯(lián)的啟動子序列，并且其中第一核酸內(nèi)切酶靶標(biāo)和第二核酸內(nèi)切酶靶標(biāo)的切割釋放所述一個或多個pegrna，導(dǎo)致所述一個或多個pegrna與核酸靶標(biāo)雜交并通過插入條形碼標(biāo)簽序列來編輯核酸靶標(biāo)。

8、另一方面，本公開內(nèi)容提供了用于多重轉(zhuǎn)錄記錄的方法，該方法包括：將順式調(diào)節(jié)元件(cre)偶聯(lián)的啟動子序列與從5'至3'編碼第一核酸內(nèi)切酶靶標(biāo)、一個或多個先導(dǎo)編輯引導(dǎo)rna(pegrna)和第二核酸內(nèi)切酶靶標(biāo)的核酸序列偶聯(lián)，通過添加核酸內(nèi)切酶從轉(zhuǎn)錄物中釋放一個或多個pegrna；以及通過插入條形碼標(biāo)簽序列來編輯靶核酸序列。

9、另一方面，本公開內(nèi)容提供了一種用于篩選響應(yīng)外部刺激的轉(zhuǎn)錄活性的方法，該方法包括使用上述任何方法來記錄在不存在和存在外部刺激的情況下多個dna序列的轉(zhuǎn)錄活性，并比較在不存在和存在外部刺激的情況下轉(zhuǎn)錄活性之間的差異，其中在存在外部刺激的情況下轉(zhuǎn)錄活性的差異可以用作用于調(diào)節(jié)治療性治療的篩選方法。