本文描述了用于穩(wěn)定rna和蛋白抗原以長(zhǎng)期儲(chǔ)存和在經(jīng)皮微針貼片中使用的組合物和方法、填充微針的方法以及使用方法。

背景技術(shù)：

1、疫苗通常需要重復(fù)注射(即初始-加強(qiáng)-加強(qiáng)方案)才能提供全面的免疫保護(hù)。這些多次注射是痛苦的、昂貴的和不方便的，導(dǎo)致患者依從性(compliance)/遵從性(adherence)低以及后勤問題嚴(yán)重。基于rna的療法，包括mrna疫苗(例如抗covid-19的mrna疫苗)，也需要多次注射，這是痛苦、不方便且昂貴的。此外，這些mrna存在嚴(yán)重的熱不穩(wěn)定性問題，這需要將疫苗儲(chǔ)存在嚴(yán)苛的寒冷環(huán)境中(即約-80℃)。最近在脂質(zhì)納米顆粒(lnp)中配制mrna或?qū)rna與穩(wěn)定劑(例如魚精蛋白)以水溶液形式復(fù)合的工作表明，mrna可以在惡劣的溫度和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)數(shù)月。然而，對(duì)這些mrna復(fù)合物的免疫反應(yīng)是劑量依賴性的，并隨施用途徑而變化。

2、之前有報(bào)道稱，與從免注射皮內(nèi)裝置獲得的結(jié)果相比，使用注射器/針頭進(jìn)行常規(guī)肌肉注射并不能對(duì)這些mrna復(fù)合物產(chǎn)生良好的反應(yīng)。據(jù)推測(cè)，這很可能是由于深層肌肉區(qū)域(與真皮區(qū)域相比)缺乏免疫細(xì)胞來攝取和翻譯穩(wěn)定的mrna復(fù)合物。此外，據(jù)認(rèn)為mrna的穩(wěn)定性可以通過在賦形劑的輔助下以干燥形式配制mrna來增強(qiáng)，所述賦形劑例如使用多元醇(例如含有-oh的賦形劑，例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、絲等)以在干燥過程中創(chuàng)造高粘性環(huán)境來保護(hù)干燥的mrna。然而，迄今為止，還沒有人成功地在室溫或體溫下長(zhǎng)期穩(wěn)定mrna。盡管如上所述，在用魚精蛋白配制mrna方面已經(jīng)取得了一些成就，但是報(bào)道的轉(zhuǎn)染效率并不一致，并且依賴于用于經(jīng)皮遞送的大型裝置來提高mrna疫苗的效率。

3、免注射疫苗微針(mn)貼片(類似于尼古丁貼片)提供了一種出色的皮內(nèi)遞送系統(tǒng)，易于使用，患者可以在家自行施用。與常規(guī)的皮下或肌內(nèi)皮下注射不同，mn靶向皮膚頂部的表皮層，皮膚頂部的表皮層有許多樹突狀朗格漢(langerhan)細(xì)胞，有利于mrna的攝取和翻譯以增強(qiáng)免疫原性。事實(shí)上，先前的研究表明，與皮下注射相同劑量的疫苗相比，通過皮內(nèi)注射mn遞送流感疫苗時(shí)，其中和抗體滴度增加了3倍或4倍。然而，迄今為止開發(fā)的大多數(shù)可用mn貼片(例如nanopatchtm)依賴于將疫苗涂覆或混合至聚合物mn上或聚合物mn內(nèi)的簡(jiǎn)單方法，因此僅提供立即釋放(即在時(shí)間0時(shí)突然釋放)。當(dāng)前mn的這種局限性要求長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)貼片應(yīng)用以模擬加強(qiáng)疫苗注射。這給如何適當(dāng)儲(chǔ)存mn貼片(即使用低溫以避免疫苗的熱不穩(wěn)定性)和維持后續(xù)貼片應(yīng)用的疫苗生物活性以及如何使患者記住疫苗時(shí)間表以在精確時(shí)間進(jìn)行其他加強(qiáng)給藥帶來了重大負(fù)擔(dān)。

4、此外，在高傳染性疾病的大規(guī)模爆發(fā)期間，例如由病毒sars-cov-2引起的covid-19疫情，通常利用廣泛的疫苗接種來實(shí)現(xiàn)全球范圍的社區(qū)免疫，以防止病原體的傳播和潛在突變、相關(guān)疾病和生命損失。然而，依賴于皮下或肌肉注射的傳統(tǒng)疫苗接種方法受到后勤負(fù)擔(dān)的困擾，這阻礙了它們的大規(guī)?？焖俨渴稹Ｊ紫?，注射不舒服、疼痛，并且需要訓(xùn)練有素的專業(yè)人員來控制劑量。其次，大量研究工作表明，疫苗通常需要加強(qiáng)注射以維持有效的抗體水平和長(zhǎng)期免疫保護(hù)。這些加強(qiáng)注射在幾周或幾個(gè)月內(nèi)重復(fù)進(jìn)行，這不僅增加了后勤負(fù)擔(dān)，而且對(duì)患者遵守時(shí)間表也是一個(gè)挑戰(zhàn)。此外，由于患者需要前往醫(yī)院或醫(yī)療中心接種疫苗，疫情期間增加預(yù)約可能會(huì)增加交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)，并增加已經(jīng)因病例增加而不堪重負(fù)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)的負(fù)擔(dān)。在發(fā)展中國家，這些障礙可能更成問題，因?yàn)樵S多患者生活在偏遠(yuǎn)地區(qū)，負(fù)擔(dān)不起多次加強(qiáng)注射的重復(fù)出行。這些患者依從性和遵從性低的實(shí)質(zhì)性問題對(duì)針對(duì)sars-cov-2、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹病毒等的全球疫苗接種運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。第三，許多疫苗必須始終在極低溫度的嚴(yán)苛條件下儲(chǔ)存。這種冷鏈要求對(duì)在低收入或資源匱乏的社區(qū)傳播必要的疫苗構(gòu)成了重大障礙，因?yàn)樾枰娱L(zhǎng)疫苗的儲(chǔ)存時(shí)間以用于初次接種和加強(qiáng)接種?？偟膩碚f，(1)基于針頭的注射的痛苦和不方便的性質(zhì)降低了患者的依從性，(2)加強(qiáng)注射的需要，以及(3)冷鏈儲(chǔ)存的要求是當(dāng)前疫苗需要克服的關(guān)鍵問題，以便解決當(dāng)前的covid-19危機(jī)、增加全球疫苗覆蓋率，以及為我們應(yīng)對(duì)未來潛在的疫情做好準(zhǔn)備。

5、現(xiàn)在需要的是更易于使用、微創(chuàng)和更通用的可以優(yōu)化免疫功效并充分增強(qiáng)復(fù)合mrna疫苗和蛋白抗原疫苗的熱穩(wěn)定性的皮內(nèi)疫苗遞送系統(tǒng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文描述的一個(gè)實(shí)施方案是穩(wěn)定的rna疫苗組合物，所述組合物包含：rna與一種或多種陽離子聚合物的復(fù)合物；和一種或多種陽離子脂質(zhì)實(shí)體。在一個(gè)方面，rna包括mrna、mirna、sirna、trna、rrna或其他rna。在另一方面，一種或多種陽離子聚合物包括魚精蛋白、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、氨基基團(tuán)改性的聚碳酸酯、氨基基團(tuán)改性的多肽、聚β-氨基酯、陽離子纖維素、陽離子葡聚糖、陽離子環(huán)糊精或其組合中的一種或多種。在另一方面，陽離子聚合物包含魚精蛋白。在另一方面，一種或多種陽離子脂質(zhì)實(shí)體包括脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒。在另一方面，脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒包含二油酰-3-三甲基銨丙烷(dotap)、膽固醇、二甲基氨基乙烷-氨基甲?；懝檀见}酸鹽(dc-膽固醇)、二油酰-3-三甲基銨丙烷(dotma)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dopc)、dspe-peg(2000)胺、聚(乙二醇)二甲醚(peg-dme)、(6z,9z,28z,31z)-庚三烯酸-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)或其組合中的一種或多種。另一方面，所述組合物還包含一種或多種冷凍保護(hù)劑。在另一方面，一種或多種冷凍保護(hù)劑包含海藻糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、葡聚糖、甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇或其組合中的一種或多種。另一方面，所述組合物還包含一種或多種選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或其組合中的氨基酸。在另一方面，rna與一種或多種陽離子肽的復(fù)合物具有約20nm至約500nm的尺寸。在另一方面，陽離子脂質(zhì)實(shí)體具有約20nm至約500nm的尺寸。在另一方面，穩(wěn)定的rna在約37℃下熱穩(wěn)定至少約2個(gè)月。在另一方面，穩(wěn)定的rna在約80℃下熱穩(wěn)定至少約2小時(shí)。

2、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是穩(wěn)定rna的方法，所述方法包括：(a)形成包含rna和一種或多種陽離子聚合物的復(fù)合物；(b)將復(fù)合物與一種或多種包含脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒的陽離子脂質(zhì)實(shí)體混合以形成脂質(zhì)混合物；和(c)在真空下干燥脂質(zhì)混合物。一方面，一種或多種陽離子聚合物包括魚精蛋白、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、氨基改性的聚碳酸酯、氨基基團(tuán)改性的多肽、聚β-氨基酯、陽離子纖維素、陽離子葡聚糖、陽離子環(huán)糊精或其組合中的一種或多種。另一方面，陽離子聚合物包含魚精蛋白。在另一方面，脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒包含二油酰-3-三甲基銨丙烷(dotap)、膽固醇、二甲基氨基乙烷-氨基甲酰基膽固醇鹽酸鹽(dc-膽固醇)、二油酰-3-三甲基銨丙烷(dotma)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dopc)、dspe-peg(2000)胺、聚(乙二醇)二甲醚(peg-dme)、(6z,9z,28z,31z)-庚三烯酸-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)、二油?；字Ｒ掖及?dope)或其組合中的一種或多種。另一方面，所述方法還包括在干燥脂質(zhì)混合物之前，將脂質(zhì)混合物與一種或多種冷凍保護(hù)劑混合，所述冷凍保護(hù)劑包括海藻糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、葡聚糖、甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇或其組合中的一種或多種。另一方面，所述方法還包括在干燥脂質(zhì)混合物之前，將脂質(zhì)混合物與選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或其組合中的一種或多種氨基酸混合。

3、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文描述的方法制備的穩(wěn)定的rna疫苗。

4、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文描述的方法制備的穩(wěn)定rna在制備疫苗藥物中的用途。

5、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是穩(wěn)定的疫苗試劑組合物，所述組合物包含：疫苗試劑；和一種或多種冷凍保護(hù)劑，所述冷凍保護(hù)劑包含海藻糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、葡聚糖、甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇或其組合中的一種或多種。在一個(gè)方面，一種或多種冷凍保護(hù)劑的濃度為約0.3m至約1m。在另一方面，疫苗試劑和一種或多種冷凍保護(hù)劑以約1:1(v/v)至約1：6(v/v)的比例存在。另一方面，疫苗試劑是蛋白質(zhì)、其功能片段，或它們的組合。另一方面，通過凍干、真空或脫水(dessication)來干燥組合物。在另一方面，疫苗試劑在約37℃下熱穩(wěn)定至少約4個(gè)月。在另一方面，疫苗試劑在約100℃下熱穩(wěn)定至少約1小時(shí)。

6、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是制備穩(wěn)定的疫苗試劑核心的方法，所述方法包括：(a)將疫苗試劑與一種或多種冷凍保護(hù)劑混合，所述冷凍保護(hù)劑包括海藻糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、葡聚糖、甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇或其組合中的一種或多種；和(b)干燥混合物。一方面，在干燥之前，一種或多種冷凍保護(hù)劑具有約0.3m至約1m的濃度。一方面，在干燥之前，將疫苗試劑與一種或多種冷凍保護(hù)劑以約1:1(v/v)至約1:6(v/v)的比例混合。另一方面，疫苗試劑是蛋白質(zhì)、其功能片段，或它們的組合。另一方面，步驟(b)中的干燥通過凍干、真空或脫水來進(jìn)行。在另一方面，步驟(b)中的干燥進(jìn)行至少約4小時(shí)至約24小時(shí)。

7、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文描述的方法制備的穩(wěn)定的疫苗核心。

8、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文描述的方法制備的穩(wěn)定的疫苗核心在制備疫苗藥物中的用途。

9、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是用于將疫苗核心一步裝載至微針中的方法，所述方法包括：(a)通過將聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)的薄膜壓縮成型至硅樹脂或聚(二甲基硅氧烷)(pdms)模具中以形成微針殼組件，從而產(chǎn)生包含聚合物殼的核-殼微針組件，其中所述模具具有圓錐形空腔陣列；(b)通過將疫苗試劑與冷凍保護(hù)劑合并并在具有與微針模具相同的圓錐形空腔陣列的第二聚(二甲基硅氧烷)(pdms)模具上澆鑄疫苗核心來產(chǎn)生疫苗核心陣列，并干燥疫苗核心；(c)將疫苗核心陣列轉(zhuǎn)移至plga膜上；(d)將plga膜上的疫苗核心陣列與微針組件對(duì)齊，從而用疫苗核心填充微針殼組件中的核心；和(e)通過真空加熱固化微針組件以將疫苗核心封裝在微針內(nèi)。一方面，產(chǎn)生核-殼微針結(jié)構(gòu)還包括：去除多余的plga浮渣層。在另一方面，微針具有約600μm的高度和約300μm的底部直徑。在另一方面，疫苗核心具有約400μm的高度和約200μm的直徑。

10、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文描述的方法制造的一步裝載的微針。

11、本文所述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文所述方法制造的一步裝載的微針向有需要的受試者遞送疫苗的用途。

12、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是用于粉末填充微針組件的方法，所述方法包括:(a)在硅晶片上制備具有圓錐形空腔陣列的聚(二甲基硅氧烷)(pdms)模具；(b)將粉末狀疫苗試劑分散至模具空腔中；(c)將粉末狀疫苗試劑壓縮至模具空腔中；(d)重復(fù)步驟(b)和步驟(c)直至微針空腔被填充；(e)在填充的空腔上澆注一層一種或多種糖和水溶性聚合物以產(chǎn)生微針組件；以及(f)干燥微針組件。在一個(gè)方面，步驟(b)-步驟(d)在中和的靜電環(huán)境中進(jìn)行。在另一個(gè)方面，疫苗試劑裝載容量比溶液澆鑄的核心填充大約20倍。另一方面，疫苗試劑是蛋白質(zhì)、核酸或其組合。

13、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文描述的方法制造的填充的微針組件。

14、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文描述的方法制造的填充的微針組件向有需要的受試者遞送疫苗的用途。

15、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是用于制造微針組件的方法，所述方法包括：(a)通過以下步驟產(chǎn)生核心微針組件：用共聚物填充包括多個(gè)微針空腔的第一硅樹脂模具，旋轉(zhuǎn)第一硅樹脂模具以去除第一硅樹脂模具上的共聚物的第一浮渣層，并在每個(gè)填充有共聚物的腔中產(chǎn)生核心；(b)通過以下步驟產(chǎn)生治療試劑組件：用治療試劑填充第二硅樹脂模具中的多個(gè)空腔，旋轉(zhuǎn)第二硅樹脂模具以去除治療試劑的第二浮渣層，以及從第二模具中去除模制的治療試劑并將模制的治療試劑轉(zhuǎn)移至基底上；以及(c)將治療試劑組件與核心微針組件對(duì)齊，從而用治療試劑填充核心微針組件中的核心。在一個(gè)方面，第一硅樹脂模具和第二硅樹脂模具中的空腔是圓錐形的。另一方面，所述共聚物是聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)。另一方面，所述方法還包括通過將聚二甲基硅氧烷(pdms)澆注在主結(jié)構(gòu)上并固化來產(chǎn)生第一硅樹脂模具。另一方面，疫苗試劑是蛋白質(zhì)或核酸。另一方面，所述方法還包括通過以下步驟產(chǎn)生蓋組件：(a)用共聚物填充第三硅樹脂模具中的多個(gè)空腔以形成多個(gè)蓋；(b)旋轉(zhuǎn)第三硅樹脂模具以去除第三硅樹脂模具上的共聚物的第三浮渣層；(c)從第三模具中取出模制的蓋并將模制的蓋轉(zhuǎn)移至核心微針組件上；以及(d)將蓋組件與核心微針組件對(duì)齊，從而用蓋覆蓋核心微針組件中的核心。另一方面，所述方法還包括加熱以將蓋組件結(jié)合至核心微針組件上。另一方面，所述方法還包括用水溶性聚合物涂覆支撐陣列，并使支撐陣列與蓋組件接觸。另一方面，所述方法還包括加熱以將支撐陣列結(jié)合至蓋組件上，用于從第一硅樹脂模具中取出微針組件。

16、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文描述的方法制造的微針裝置。

17、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是通過本文描述的方法制造的微針裝置向有需要的受試者遞送疫苗的用途。

18、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是脈沖疫苗遞送系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：微針組件，所述微針組件包括多個(gè)填充有疫苗試劑的微針；微針包括可生物降解的聚合物；并且所述微針組件被構(gòu)造成在預(yù)定時(shí)間釋放具有預(yù)定劑量的疫苗試劑的疫苗試劑，同時(shí)微針組件保持嵌入在受試者中。一方面，可生物降解的聚合物隨時(shí)間降解，將治療試劑釋放至受試者體內(nèi)。在另一方面，所述系統(tǒng)還包括與微針組件電子通信的計(jì)算機(jī)處理器，所述計(jì)算機(jī)處理器用計(jì)算機(jī)可讀指令編程以啟動(dòng)疫苗試劑的釋放。在另一方面，所述系統(tǒng)還包括與計(jì)算機(jī)處理器電子通信的激活器，以啟動(dòng)治療試劑的釋放。在另一方面，多個(gè)微針中的每個(gè)微針是圓錐形的。另一方面，疫苗試劑是蛋白質(zhì)或核酸。在另一方面，多個(gè)微針中的至少一個(gè)微針包括約600μm的最大高度。

19、另一個(gè)實(shí)施方案是本文所述的脈沖式疫苗遞送系統(tǒng)向有需要的受試者遞送疫苗的用途。

20、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案的疫苗遞送系統(tǒng)包括：組件，所述組件包括：(a)基底，和(b)從基底延伸的多個(gè)微針，每個(gè)微針包括：包含可生物降解的聚合物的殼、包含疫苗試劑的核心和包含可生物降解的聚合物的蓋，所述蓋將核心包封在殼內(nèi)；其中所述多個(gè)微針中的每個(gè)微針的殼被選擇為在預(yù)定時(shí)間降解以將其中的疫苗試劑釋放至受試者的皮膚中。一方面，可生物降解的聚合物包括聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)或聚丙交酯酸(pla)。另一方面，蓋包括plga或pla。在另一方面，選擇多個(gè)微針的第一子集的殼在第一時(shí)間降解以將其中的治療試劑釋放至受試者的皮膚中，并且其中選擇多個(gè)微針的第二子集的殼在第二時(shí)間降解以將其中的治療試劑釋放至受試者的皮膚中。在另一方面，選擇多個(gè)微針的第一子集的殼在第一時(shí)間降解以將其中的第一劑量的疫苗釋放至受試者的皮膚中，并且其中選擇多個(gè)微針的第二子集的殼在第二時(shí)間降解以將其中的第二劑量的疫苗釋放至受試者的皮膚中。在另一方面，至少一個(gè)微針的核心包括約200μm的最大直徑和約300μm的最大高度。在另一方面，多個(gè)微針中的至少一個(gè)微針包括約600μm的最大高度。

21、另一個(gè)實(shí)施方案是本文所述的疫苗遞送系統(tǒng)向有需要的受試者施用疫苗的用途。

22、本文描述的另一個(gè)實(shí)施方案是向有需要的受試者施用疫苗的方法，所述方法包括：使疫苗遞送系統(tǒng)與受試者的皮膚接觸，所述疫苗遞送系統(tǒng)包括：組件，所述組件包括：基底和從基底延伸的多個(gè)微針，每個(gè)微針包括：包含可生物降解的聚合物的殼、包含疫苗試劑的核心和包含可生物降解的聚合物的蓋，所述蓋將核心包封在殼內(nèi)；其中所述多個(gè)微針中的每一個(gè)的殼被選擇為在預(yù)定時(shí)間降解以將其中的疫苗試劑釋放至受試者的皮膚中。一方面，疫苗試劑是蛋白質(zhì)或核酸。在另一方面，選擇多個(gè)微針的第一子集的殼在第一時(shí)間降解以將其中的治療試劑釋放至受試者的皮膚中，并且其中選擇多個(gè)微針的第二子集的殼在第二時(shí)間降解以將其中的治療試劑釋放至受試者的皮膚中。在另一方面，選擇所述多個(gè)微針的第一子集的殼在第一時(shí)間降解以將其中的第一劑量的疫苗釋放至受試者的皮膚中，并且其中選擇所述多個(gè)微針的第二子集的殼在第二時(shí)間降解以將其中的第二劑量的疫苗釋放至受試者的皮膚中。