背景技術(shù)：

1、dna可以通過其螺旋結(jié)構(gòu)傳輸電子，這使得dna在分子電子學(xué)領(lǐng)域成為有吸引力的分子線。dna具有均勻的一維結(jié)構(gòu)(直徑約2nm)、可編程自組裝，故可以根據(jù)沃森-克里克(watson-crick)堿基配對(duì)規(guī)則(g與c配對(duì)，a與t配對(duì))設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)，并且其長(zhǎng)度可從納米級(jí)到微米級(jí)進(jìn)行調(diào)節(jié)，精度達(dá)到埃級(jí)。

2、然而，dna的電導(dǎo)率取決于其序列，相較于鳥嘌呤-胞嘧啶(g-c)堿基對(duì)，胸腺嘧啶-腺嘌呤(t-a)堿基配對(duì)對(duì)會(huì)降低dna分子的電導(dǎo)率。盡管僅包含g-c堿基對(duì)的同質(zhì)序列在電荷傳輸方面表現(xiàn)出相對(duì)較高的電洞遷移率，但由于分子長(zhǎng)度及所需的高純度，合成過程極為困難。此外，富含g-c的dna容易形成不必要的二級(jí)甚至四級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基于dna的分子裝置的測(cè)量和組裝復(fù)雜化。因此，提高用于dna分子線中的a-t堿基對(duì)的電導(dǎo)率是十分必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)總體上提供具有改善電導(dǎo)率的經(jīng)修飾腺苷及其在例如dna分子線中使用經(jīng)修飾a-t堿基對(duì)的方法。

2、一方面，本技術(shù)的特征在于一種包括導(dǎo)電或半導(dǎo)電分子線的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含納米結(jié)構(gòu)，其包括一個(gè)或多個(gè)核酸堿基對(duì)，其中，所述納米結(jié)構(gòu)內(nèi)至少有一個(gè)核堿基包括2-氨基-7-脫氮-腺嘌呤或以下：

3、

4、另一方面，本技術(shù)的特征在于一種鑒定、表征或定序生物聚合物的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：由第一電極和第二電極形成的納米間隙；具有兩個(gè)末端的納米結(jié)構(gòu)，所述納米結(jié)構(gòu)包含一個(gè)或多個(gè)核酸堿基對(duì)，納米結(jié)構(gòu)橋接在電極之間的納米間隙，其中，每個(gè)電極化學(xué)鍵合至納米結(jié)構(gòu)的其中一個(gè)末端，且納米結(jié)構(gòu)包括2-氨基-7-脫氮-腺嘌呤；以及附接于納米結(jié)構(gòu)上的感測(cè)探針，所述探針能與生物聚合物相互作用或進(jìn)行化學(xué)或生化反應(yīng)。

5、另一方面，本技術(shù)的特征在于一種改善分子線電導(dǎo)率的方法，包括：提供分子線，所述分子線為包含一個(gè)或多個(gè)核酸堿基對(duì)的納米結(jié)構(gòu)；以及修飾至少一個(gè)核酸堿基為2-氨基-7-脫氮-腺嘌呤。

6、另一方面，本技術(shù)的特征在于一種鑒定、表征或定序生物聚合物的方法。此方法包括：通過將第一電極和第二電極彼此靠近地放置在非導(dǎo)電基板上或通過彼此重疊并由非導(dǎo)電層隔開以形成納米間隙；提供包含長(zhǎng)度與所述納米間隙相當(dāng)?shù)囊粋€(gè)或多個(gè)核酸堿基對(duì)的納米結(jié)構(gòu)，其中，所述納米結(jié)構(gòu)內(nèi)的至少一個(gè)核酸堿基是2-氨基-7-脫氮-腺嘌呤；將納米結(jié)構(gòu)的一端化學(xué)鍵結(jié)至第一電極，并將納米結(jié)構(gòu)的另一端化學(xué)鍵結(jié)至第二電極；以及附接感測(cè)探針到所述納米結(jié)構(gòu)上，其中，所述感測(cè)探針能夠與所述生物聚合物進(jìn)行物理上相互作用或進(jìn)行化學(xué)或生化反應(yīng)。

7、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述分子線與電極電連接。

8、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述分子線橋接兩個(gè)電極之間的納米間隙。

9、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述分子線包括兩個(gè)末端，各末端化學(xué)鍵結(jié)至所述電極的一者。

10、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述電極的一者帶正電而另一者帶負(fù)電。

11、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述電極設(shè)置在非導(dǎo)電基底上或由非導(dǎo)電層分隔。

12、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述系統(tǒng)包括以下中的一個(gè)或多個(gè)：施加在第一電極和第二電極之間的偏壓；記錄通過納米結(jié)構(gòu)的電流波動(dòng)的裝置，所述電流波動(dòng)由感測(cè)探針和生物聚合物之間的相互作用所引起；以及識(shí)別或表征所述生物聚合物或所述生物聚合物的亞基的數(shù)據(jù)分析軟件。

13、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述納米結(jié)構(gòu)為核酸雙鏈體、核酸三鏈體、核酸四鏈體、核酸折紙結(jié)構(gòu)或其組合。

14、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述生物聚合物包含天然的、合成的或修飾的dna、rna、蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸、多醣或其類似物。

15、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述感測(cè)探針是多核苷酸或多肽。

16、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述感測(cè)探針是天然的、突變的、表達(dá)的或合成的核酸探針、分子鑷子、酶、受體、配體、抗原和抗體或其組合。

17、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述酶是天然的、突變的或合成的dna聚合酶、rna聚合酶、dna解旋酶、dna連接酶、dna外切核酸酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、rna引子酶、核糖體、蔗糖酶或乳糖酶。

18、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述納米結(jié)構(gòu)包含多肽。

19、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述多肽是天然的、突變的或合成的dna聚合酶、rna聚合酶、dna解旋酶、dna連接酶、dna外切核酸酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、rna引子酶、核糖體、蔗糖酶或乳糖酶。

20、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述納米間隙包括約3至1000nm、約5至100nm或約5至30nm。

21、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述納米間隙為5、10、20、25或30nm。

22、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述電極含有鉑(pt)、金(au)、銀(ag)、鈀(pd)、銠(rh)、釕(ru)、鋨(os)、銥(ir)、銅(cu)、錸(re)、鈦(ti)、鈮(nb)、鉭(ta)及其衍生物或其合金或組合。

23、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述ta的衍生物是tin或tan。

24、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述方法包括：在第一電極和第二電極之間施加偏壓；提供記錄通過納米結(jié)構(gòu)的電流波動(dòng)的裝置，所述電流波動(dòng)由感測(cè)探針和生物聚合物之間的相互作用引起；并提供識(shí)別或表征生物聚合物或生物聚合物亞基的數(shù)據(jù)分析軟件。

25、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述納米結(jié)構(gòu)為核酸雙鏈體、核酸三鏈體、核酸四鏈體、核酸折紙結(jié)構(gòu)或其組合。

26、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述生物聚合物是天然的、合成的或修飾的dna、rna、蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸、多醣或其類似物。

27、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述感測(cè)探針是天然的、突變的、表達(dá)的或合成的核酸探針、分子鑷子、酶、受體、配體、抗原和抗體或其組合。

28、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述酶是天然的、突變的或合成的dna聚合酶、rna聚合酶、dna解旋酶、dna連接酶、dna外切核酸酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、rna引子酶、核糖體、蔗糖酶或乳糖酶。

29、在上述各方面或其任何實(shí)施例中，所述納米間隙的尺寸或兩個(gè)電極之間的距離為約3至1000nm，優(yōu)選約5至100nm，并且最優(yōu)選約5至30nm。

30、在任何上述方面或其實(shí)施例中，電極含有鉑(pt)、金(au)、銀(ag)、鈀(pd)、銠(rh)、釕(ru)、鋨(os)、銥(ir)、銅(cu)、錸(re)、鈦(ti)、鈮(nb)、鉭(ta)及其衍生物或其組合。

31、在任何上述方面或其實(shí)施例中，所述方法涉及：提供2-氨基-7-脫氮-腺嘌呤三磷酸；并通過酶將2-氨基-7-脫氮-腺嘌呤三磷酸摻入納米結(jié)構(gòu)內(nèi)的核酸鏈中。

32、本技術(shù)提供經(jīng)修飾的腺苷。本技術(shù)定義的組合物和制品是單獨(dú)或其它方式制造，與下列提供的實(shí)施例相關(guān)。本技術(shù)的其他特征和優(yōu)點(diǎn)自詳細(xì)說明和權(quán)利要求書中顯而易見。

33、定義

34、除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本技術(shù)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義。以下參考文獻(xiàn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本技術(shù)中使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般定義：singleton等人，dictionary?of?microbiology?and?molecular?biology(第二版，1994)；the?cambridge?dictionary?of?science?and?technology(walker編輯，1988)；theglossary?of?genetics，第五版，r.rieger等人(編輯)。springer?verlag(1991)；以及hale&marham，the?harper?collins?dictionary?of?biology(1991)。如本文所用，除非另有說明，以下術(shù)語(yǔ)具有下面賦予它們的含義。

35、術(shù)語(yǔ)“銜接子”是指例如通過連接添加至核酸的序列。銜接子的長(zhǎng)度可以是約5至約100個(gè)堿基，并且可以提供定序引子結(jié)合位點(diǎn)(例如，擴(kuò)增引子結(jié)合位點(diǎn))和分子條形碼，例如樣品標(biāo)識(shí)符序列或分子標(biāo)識(shí)符序列，優(yōu)選地是唯一識(shí)別符序列。銜接子可添加至核酸分子的1)5'末端、2)3'末端或3)兩端。雙鏈銜接子含有與核酸連接的雙鏈末端。適配器可以具有懸垂部分或可以是鈍端的。如下文將更詳細(xì)描述的，可以通過僅將銜接子的一條鏈連接至片段來將雙鏈銜接子新增至片段?？梢允褂镁酆厦笇暯幼拥奈催B接鏈的序列加入片段。y型轉(zhuǎn)接器和環(huán)形轉(zhuǎn)接器是雙鏈轉(zhuǎn)接器的類型。

36、術(shù)語(yǔ)“改變”是指由例如本文所描述的標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域已知方法所檢測(cè)的核堿基或多核苷酸的結(jié)構(gòu)、活性或傳導(dǎo)特征的變化(增加或減少)。如本文所使用的，改變包括電導(dǎo)率的10％變化、25％的變化、40％的變化、50％％或更大的電導(dǎo)率變化。

37、術(shù)語(yǔ)“類似物”是指不相同，但具有類似的功能或結(jié)構(gòu)特征的分子。

38、本文所用術(shù)語(yǔ)“反義鏈”是指與關(guān)注的目標(biāo)核酸實(shí)質(zhì)上或100％互補(bǔ)的多核苷酸。例如，反義鏈可以與mrna(信使rna)分子、非mrna的rna序列(例如microrna、piwirna、trna、rrna和hnrna)或編碼或非編碼的dna序列完全或部分互補(bǔ)。術(shù)語(yǔ)“反義鏈”和“引導(dǎo)鏈”在本文中可互換使用。

39、在本技術(shù)中，“包含”、“含有”和“具有”等術(shù)語(yǔ)具有美國(guó)專利法所賦予的含義，并且可以表示“包括”、“包含”等；“基本上由...組成”或“基本上由...構(gòu)成”同樣具有美國(guó)專利法中所賦予的含義，且所述術(shù)語(yǔ)是開放式，允許所列舉者更多的內(nèi)容存在，只要所列舉者的基本或新穎特征不因所列舉者以外的內(nèi)容的存在而改變，但排除現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)施例。

40、術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指能夠配對(duì)形成雙鏈核酸分子或其部分。在一個(gè)實(shí)施例中，反義分子與目標(biāo)序列大部分互補(bǔ)。互補(bǔ)性不需為完美的，而可以包括在1、2、3或更多個(gè)核苷酸處的錯(cuò)配。

41、術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)”是指包含雙鏈基因的至少一個(gè)片段，使得雙鏈抑制性核酸分子的一條鏈能與所述基因的互補(bǔ)鏈結(jié)合。

42、術(shù)語(yǔ)“降低”是指相對(duì)于參考水平降低至少約5％。減少可以是5％、10％、15％、20％、25％或50％，甚至可以多達(dá)75％、85％、95％或更多，以及任何中間百分比。

43、術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”是指識(shí)別待檢測(cè)分析物的存在、不存在的量或特征。在一些實(shí)施例中，所述分析物是經(jīng)修飾的腺苷。在其他實(shí)施例中，使用本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)所述經(jīng)修飾的腺苷的電導(dǎo)率。

44、術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)標(biāo)記”是指當(dāng)關(guān)注的分子連接時(shí)，使后者可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)到的組合物。例如，有用的標(biāo)記包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠體顆粒、熒光染料、電子致密試劑、酶(例如，常用于elisa中)、生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原(hapten)。

45、術(shù)語(yǔ)“dft(density?functional?theory)”是指計(jì)算分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的密度泛函理論。在本技術(shù)中，使用市售軟件spartan(wavefunction,inc.,usa)進(jìn)行dft分析。具體而言，本技術(shù)的dft計(jì)算使用b3lyp/6-31g*方法，如spartan’20教程和用戶指南(wavefunction,inc.,2022,downloads.wavefun.com/spartan20manual.pdf)中進(jìn)一步描述者，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。

46、本文所使用的關(guān)于基因的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”或“表達(dá)的”是指所述基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物。細(xì)胞中dna分子的表達(dá)水平可以根據(jù)細(xì)胞內(nèi)存在的相應(yīng)mrna的量或由細(xì)胞產(chǎn)生的dna編碼的蛋白質(zhì)的量所確定(sambrook等，1989molecular?cloning：a?laboratory?manual，18.1-18.88)。轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)可以在細(xì)胞中瞬時(shí)或穩(wěn)定地發(fā)生。在“瞬時(shí)表達(dá)”期間，轉(zhuǎn)染基因在細(xì)胞分裂期間不會(huì)轉(zhuǎn)移到子細(xì)胞。由于其表達(dá)僅限于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，因此所述基因的表達(dá)會(huì)隨著時(shí)間的推移而喪失。相反，當(dāng)所述基因與賦予轉(zhuǎn)染細(xì)胞選擇優(yōu)勢(shì)的另一種基因共轉(zhuǎn)染時(shí)，可以發(fā)生轉(zhuǎn)染基因的穩(wěn)定表達(dá)。這種選擇優(yōu)勢(shì)可能是對(duì)呈現(xiàn)給細(xì)胞的某種毒素的抗性。

47、術(shù)語(yǔ)“片段”指多肽或核酸分子的一部分。此部分優(yōu)選包含參考核酸分子或多肽全長(zhǎng)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個(gè)核苷酸或氨基酸。

48、術(shù)語(yǔ)“高通量定序”是指允許對(duì)大量核酸進(jìn)行定序的定序技術(shù)。

49、術(shù)語(yǔ)“雜交”是指互補(bǔ)核堿基之間的氫鍵，可以是沃森-克里克、胡斯坦(hoogsteen)或反向胡斯坦氫鍵。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過形成氫鍵配對(duì)的互補(bǔ)核堿基。

50、術(shù)語(yǔ)“分離的”、“純化的”或“生物純的”是指在不同程度上脫離其天然狀態(tài)下通常伴隨的成分的材料。術(shù)語(yǔ)“分離”表示與原始來源或周圍環(huán)境在某種程度上的分離。術(shù)語(yǔ)“純化”表示高于分離的程度。術(shù)語(yǔ)“純化的”或“生物純的”蛋白質(zhì)充分不含其他材料，使得任何雜質(zhì)不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響蛋白質(zhì)的生物特性或引起其他不良后果。也就是說，如果本技術(shù)的核酸或勝肽在通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基或者在化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品，則本技術(shù)的核酸或勝肽是純化的。通常使用分析化學(xué)技術(shù)確定純度和均勻性，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜。術(shù)語(yǔ)“純化的”可以表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中基本上產(chǎn)生一條帶。對(duì)于可以修飾(例如磷酸化或糖基化)的蛋白質(zhì)，不同的修飾可以產(chǎn)生不同的分離的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可以單獨(dú)純化。

51、術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”是指不含在本技術(shù)的核酸分子所源自的生物體天然存在的基因組中位于所述基因側(cè)翼的基因的核酸(例如，dna)。因此，所述術(shù)語(yǔ)包括例如摻入載體中的重組dna；轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《荆换蜻M(jìn)入原核生物或真核生物的基因組dna中；或作為獨(dú)立于其他序列的單獨(dú)分子(例如，經(jīng)由pcr或限制性內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)生的cdna或基因組或cdna片段)存在。此外，所述術(shù)語(yǔ)包括從dna分子轉(zhuǎn)錄的rna分子，以及作為編碼附加多肽序列的雜合基因的一部分的重組dna。

52、術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”是指已與其天然伴隨的組分分離的本技術(shù)的多肽。通常，當(dāng)多肽至少60％(按重量計(jì))不含與其天然相關(guān)的蛋白質(zhì)和天然存在的有機(jī)分子時(shí)，所述多肽是分離的。優(yōu)選地，所述制劑含有按重量計(jì)至少75％、更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少99％的本技術(shù)的多肽。本技術(shù)的分離的多肽可以例如從天然來源提取、通過表達(dá)編碼此類多肽的重組核酸來獲得或通過化學(xué)合成蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量純度，例如柱層析法、聚丙烯酰胺凝膠電泳或通過hplc分析。

53、術(shù)語(yǔ)“分子線”是指能夠傳導(dǎo)電流的分子或分子結(jié)構(gòu)。

54、術(shù)語(yǔ)“納米間隙”是指兩個(gè)物體之間的間隙，其尺寸在納米級(jí)范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述納米間隙形成在兩個(gè)電極之間。

55、術(shù)語(yǔ)“納米結(jié)構(gòu)”是指具有一維或多維的任何結(jié)構(gòu)，其尺寸測(cè)量為納米級(jí)范圍內(nèi)。

56、術(shù)語(yǔ)“rna-seq”指檢測(cè)和定量生物樣本中的rna分子的rna定序技術(shù)，其例如可用于研究細(xì)胞反應(yīng)。相關(guān)術(shù)語(yǔ)“scrna-seq”是單細(xì)胞rna定序，例如，其可以是基于液滴的單細(xì)胞rna-seq或“drop-seq”，于本技術(shù)的實(shí)施例中是一種分析至少數(shù)十萬個(gè)單獨(dú)細(xì)胞中的rna表達(dá)的定序技術(shù)，但也可以使用任何其他高通量定序平臺(tái)。

57、如本文所用，術(shù)語(yǔ)“獲得”如在“獲得試劑”中的使用，包括合成、購(gòu)買或以其他方式取得所述試劑。

58、術(shù)語(yǔ)“減少”是指至少10％、25％、50％、75％或100％的負(fù)改變。

59、術(shù)語(yǔ)“參考”是指標(biāo)準(zhǔn)或控制條件。在一些實(shí)施例中，將包含一種或多種經(jīng)修飾核堿基(例如，經(jīng)修飾腺苷)的多核苷酸的電導(dǎo)率與不包含修飾核堿基或包含相較于對(duì)應(yīng)多核苷酸較少的經(jīng)修飾核堿基(例如，a-t)的參考多核苷酸(例如，dna分子)的電導(dǎo)率進(jìn)行比較。

60、術(shù)語(yǔ)“參考序列”是用作序列比較基礎(chǔ)的定義序列。參考序列可以是指定序列的子集或整體；例如，全長(zhǎng)cdna或基因序列的片段或完整的cdna或基因序列。對(duì)于多肽，參考多肽序列的長(zhǎng)度通常為至少約16個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少約20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少約25個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選約35個(gè)氨基酸、約50個(gè)氨基酸或約100個(gè)氨基酸。對(duì)于核酸，參考核酸序列的長(zhǎng)度通常為至少約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少約60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少約75個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選約100個(gè)核苷酸或約300個(gè)核苷酸或任意長(zhǎng)度。

61、可用于本技術(shù)方法的核酸分子包括編碼本技術(shù)多肽或其片段的任何核酸分子。此類核酸分子不需要與內(nèi)源性核酸序列100％相同，但通常會(huì)表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上的同一性。與內(nèi)源序列具有“實(shí)質(zhì)上同一性”的多核苷酸通常能夠與雙鏈核酸分子的至少一條鏈雜交?？捎糜诒炯夹g(shù)方法的核酸分子包括編碼本技術(shù)多肽或其片段的任何核酸分子。此類核酸分子不需要與內(nèi)源性核酸序列100％相同，但通常會(huì)表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上的同一性。與內(nèi)源序列具有“實(shí)質(zhì)上同一性”的多核苷酸通常能夠與雙鏈核酸分子的至少一條鏈雜交?！半s交”是指在各種嚴(yán)格條件下，互補(bǔ)多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之間配對(duì)形成雙鏈分子(參見例如wahl，g.m.和s.l.berger(1987)methods?enzymol.152:399；kimmel，a.r.(1987)methods?enzymol.152:507)。

62、例如，嚴(yán)格鹽濃度通常小于約750mm氯化鈉和75mm檸檬酸三鈉，優(yōu)選小于約500mm氯化鈉和50mm檸檬酸三鈉，更優(yōu)選小于約250mm氯化鈉和25mm檸檬酸三鈉。低嚴(yán)格雜交可以在不存在例如甲酰胺的有機(jī)溶劑的情況下獲得，而高嚴(yán)格雜交可以在至少約35％甲酰胺、更優(yōu)選至少約50％甲酰胺存在下獲得。嚴(yán)格的溫度條件通常包括至少約30℃、更優(yōu)選至少約37℃、最優(yōu)選至少約42℃的溫度。改變附加參數(shù)，例如雜交時(shí)間、例如十二烷基硫酸鈉(sds)的去污劑的濃度以及載體dna的包含或排除，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。根據(jù)需要，通過組合這些不同的條件實(shí)現(xiàn)不同程度的嚴(yán)格性。在優(yōu)選的實(shí)施例中，在30℃下，在750mm氯化鈉、75mm檸檬酸三鈉和1％的sds中進(jìn)行雜交。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，在37℃下，在500mm氯化鈉、50mm檸檬酸三鈉、1％的sds、35％甲酰胺和100μg/ml變性鮭魚精子dna(ssdna)中進(jìn)行雜交。在最優(yōu)選的實(shí)施例中，在42℃下，在250mm氯化鈉、25mm檸檬酸三鈉、1％的sds、50％甲酰胺和200μg/ml變性鮭魚精子dna(ssdna)中進(jìn)行雜交。這些條件的有用變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。

63、對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，雜交后的洗滌步驟的嚴(yán)格性也會(huì)有所不同。洗滌的嚴(yán)格條件可以通過鹽濃度和溫度來定義。如上所述，可以通過降低鹽濃度或提高溫度來提高洗滌的嚴(yán)格性。例如，洗滌步驟的嚴(yán)格鹽濃度優(yōu)選小于約30mm氯化鈉(nacl)和3mm檸檬酸三鈉，且最優(yōu)選小于約15mm氯化鈉(nacl)和1.5mm檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴(yán)格溫度條件通常包括至少約25℃、更優(yōu)選至少約42℃、甚至更優(yōu)選至少約68℃的溫度。在優(yōu)選的實(shí)施例中，洗滌步驟將在25℃下，在30mm氯化鈉(nacl)、3mm檸檬酸三鈉和0.1％的sds中進(jìn)行。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，洗滌步驟將在42℃下，在15mm氯化鈉(nacl)、1.5mm檸檬酸三鈉和0.1％的sds中進(jìn)行。在最優(yōu)選的實(shí)施例中，洗滌步驟將在68℃下，在15mm氯化鈉(nacl)、1.5mm檸檬酸三鈉和0.1％的sds中進(jìn)行。這些條件的附加變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且描述于例如benton和davis(science?196:180,1977)；grunstein與hogness(proc.natl.acad.sci.,usa?72:3961,1975)；ausubel等人(current?protocols?in?molecular?biology，wiley?interscience，new?york，2001)；berger和kimmel(guide?to?molecular?cloning?techniques，1987，academic?press，newyork)；sambrook等人，molecular?cloning:a?laboratory?manual，cold?spring?harborlaboratory?press，new?york。

64、“基本上相同”是指多肽或核酸分子與參考氨基酸序列(例如，本文描述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文描述的任一核酸序列)表現(xiàn)出至少50％同一性。優(yōu)選地，這樣的序列在氨基酸或核酸上與用于比較的序列至少60％、更優(yōu)選80％或85％、更優(yōu)選90％、95％或甚至99％相同

65、序列同一性通常使用序列分析軟件(例如，威斯康辛大學(xué)生物技術(shù)中心遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組的序列分析軟件包，1710university?avenue,madison,wis.53705，blast、bestfit、gap或pileup/prettybox程序)來測(cè)量。此類軟件通過指定各種取代、刪除和/或其他修飾的同源性程度來匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下組別內(nèi)的取代：甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天門冬氨酸、麩氨酸、天門冬酰氨酸、麩酰氨酸；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；以及苯丙胺酸、酪胺酸。在確定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其機(jī)率得分在e-3和e-100之間，指示緊密相關(guān)的序列。

66、本文所提供的范圍應(yīng)理解為所述范圍內(nèi)所有值的簡(jiǎn)寫。例如，1至50的范圍應(yīng)理解為包括選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所組成的組的任何數(shù)字、數(shù)字的組合或子范圍。

67、除非特別說明或從上下文顯而易見，否則如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“或”應(yīng)理解為包括在內(nèi)。除非特別說明或從上下文顯而易見，否則本文所使用的術(shù)語(yǔ)“一”、“一個(gè)”和“所述”應(yīng)理解為單數(shù)或復(fù)數(shù)。

68、術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸分子，例如質(zhì)粒、黏粒、病毒或噬菌體。在一個(gè)實(shí)施例中，載體是表達(dá)載體，其是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，帶有一系列能夠使核酸分子在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的特定核酸組件。通常，表達(dá)受某些調(diào)控組件的控制，包括組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織偏好的調(diào)控組件和增強(qiáng)子。

69、除非具體說明或從上下文顯而易見，否則如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”應(yīng)理解為在本領(lǐng)域的正常公差范圍內(nèi)，例如在平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。大約可以理解為在10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以內(nèi)的規(guī)定值。除非上下文另有明確說明，本文提供的所有數(shù)值均由術(shù)語(yǔ)“約”修飾。

70、本文中變量的任何定義中的化學(xué)基團(tuán)列表的列舉包括所述變量作為任何單一基團(tuán)或所列基團(tuán)的組合的定義。本文對(duì)變量或方面的實(shí)施例的敘述包括作為任何單一實(shí)施例或與任何其他實(shí)施例或其部分組合的實(shí)施例。

71、本文提供的任何組合物或方法可以與本文提供的任何其他組合物和方法中的一種或多種組合。