本發(fā)明涉及一種包含轉(zhuǎn)化酶、β-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶的口腔護理組合物，所述組合物作為藥物的用途，所述組合物在治療口腔疾病中的用途，包括向人受試者施用所述組合物的治療方法，包括使口腔生物膜與所述組合物接觸的預(yù)防或去除口腔生物膜的方法，用于降低口腔生物膜形成風險的方法，以及包含所述組合物的套裝盒。

背景技術(shù)：

1、生物膜是在很多不同環(huán)境中的固體表面(包括口腔表面)上發(fā)現(xiàn)的細菌群落?？谇簧锬せ蜓谰吆泻芏嗯c口腔健康問題(例如口腔惡臭、脫礦、齲齒、蛀牙、牙齒潛在缺失和牙齦病(牙齦炎和牙周炎))相關(guān)的細菌。

2、口腔生物膜的形成發(fā)生在三個階段中，分別稱為停滯期、生長期、和穩(wěn)定狀態(tài)。在停滯期，來自唾液的糖蛋白與口腔表面(例如牙齒)結(jié)合，并且形成稱為菌膜的結(jié)構(gòu)，該菌膜充當細菌的附著位點。在生長期，發(fā)生共聚集，即第二細菌定殖者附著至第一細菌定殖者，引起生物膜多樣性增加以及生物膜生長和成熟。在穩(wěn)定狀態(tài)，生物膜生長減緩并最終停止。這一基于階段的形成周期導(dǎo)致生物膜存在幾個連續(xù)層面中，這使得生物膜的物理磨損更加困難。

3、在生物膜內(nèi)，駐留的細菌細胞分布在細胞外聚合物基質(zhì)中，該細胞外聚合物基質(zhì)主要由水、蛋白質(zhì)、外泌多糖、脂多糖、脂質(zhì)、表面活性劑、和細胞外dna組成，其中外泌多糖占生物膜干重的主要部分(h.c.flemming和j.wingender(2010),nat.rev.microbiol.[微生物自然評論]8,623-633)。外泌多糖主要是葡萄糖和果糖均聚物，包括(1-3)-α-d-葡聚糖、(1-4)-α-d-葡聚糖、(1-6)-α-d-葡聚糖和(2-6)-β-d-果聚糖。這些多糖是通過由口腔細菌(例如鏈球菌屬物種(streptococcus?spp.)、乳桿菌屬物種(lactobacillus?spp.)、和放線菌屬物種(actinomyces?spp.))分泌的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶從攝取的蔗糖合成的。變聚糖和右旋糖酐是在牙菌斑的形成中特別重要的葡聚糖。變聚糖具有高度支化的結(jié)構(gòu)，其主鏈由與側(cè)鏈中的(1-3)-α鍵和(1-6)-α-糖苷鍵連接的葡萄糖分子構(gòu)成。右旋糖酐也是葡萄糖的高分子量聚合物，在主鏈和側(cè)鏈上含有多個連續(xù)的(1-6)-α-鍵，以(1-3)-α-鍵開始(m.pleszczynska等人(2016),biotechnol.appl.biochem.[應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)]64(3),337-346)。果聚糖主要是線性多糖并且主要由與β-(2,6)連接的果糖基殘基和一些與β-(2,1)連接的分支組成。

4、因為對抗微生物劑的抗性提高以及生物膜的機械特性，很多目前的口腔護理產(chǎn)品在解決生物膜形成和緩解相關(guān)口腔健康問題方面十分低效。生物膜去除的關(guān)注點在于機械磨損。然而，生物膜的多層性質(zhì)給機械磨損造成困難，并且由于生物膜的機械去除(例如，通過刷牙)擴大和加深了生物膜在口腔中附著和擴展的區(qū)域，潛在地增加而不是降低了問題的嚴重性，從而使機械磨損進一步受到影響。

5、鑒于生物膜在口腔疾病中的重要作用，本領(lǐng)域需要可有效靶向口腔生物膜的口腔護理組合物。wo?1997/38669(諾維信公司(novozymes))描述了包含變聚糖酶和右旋糖酶的口腔護理組合物，wo?1998/57653(諾維信公司)提供了包含右旋糖酶和支鏈淀粉酶的口腔護理組合物，wo?2000/17331披露了包含類芽孢桿菌(paenibacillus)果聚糖酶的口腔護理組合物，并且wo?2020/099490(諾維信公司)描述了包含變聚糖酶和dna酶的口腔護理組合物。然而，仍然需要靶向口腔生物膜的口腔護理組合物。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了包含轉(zhuǎn)化酶、β-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶的口腔護理組合物，可用于預(yù)防口腔生物膜形成。

2、在第一方面，本發(fā)明涉及一種口腔護理組合物，該口腔護理組合物包含轉(zhuǎn)化酶、β-葡糖苷酶、葡糖淀粉酶和至少一種口腔護理成分。在該第一方面的優(yōu)選的實施例中，該口腔護理組合物進一步包含α-淀粉酶。

3、在第二方面，本發(fā)明涉及一種根據(jù)第一方面的組合物，用作藥物。

4、在第三方面，本發(fā)明涉及一種根據(jù)第一方面的組合物，用于在治療口腔疾病中使用。

5、在第四方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或去除口腔生物膜的方法，該方法包括使該口腔生物膜與根據(jù)第一方面的口腔護理組合物接觸。

6、在第五方面，本發(fā)明涉及一種用于降低口腔生物膜形成風險的方法，該方法包括使該口腔生物膜與根據(jù)第一方面的口腔護理組合物接觸。

7、在第六方面，本發(fā)明涉及一種套裝盒，該套裝盒包含：

8、a)根據(jù)第一方面的口腔組合物；和

9、b)使用說明書。

10、定義

11、根據(jù)此詳細描述，以下定義適用。注意，單數(shù)形式“一種/個(a/an)”以及“該/這些(the)”包括復(fù)數(shù)個指示物，除非上下文中另外明確指明。

12、除非另外定義或由上下文明確指示，否則本文所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

13、α-淀粉酶：術(shù)語“α-淀粉酶”意指具有α-淀粉酶活性的多肽，該多肽催化含有三個或更多個(1→4)-α-連接的d-葡萄糖單元的多糖中(1→4)-α-d-糖苷鍵的內(nèi)切水解。α-淀粉酶的學(xué)名是4-α-d-葡聚糖葡聚糖水解酶(ec?3.2.1.1)。術(shù)語“α-淀粉酶(alpha-amylase和α-amylase)”和表達“具有α-淀粉酶活性的多肽”在整個申請中可互換使用。出于本發(fā)明的目的，可以根據(jù)下文實例2中描述的α-淀粉酶活性測定i或α-淀粉酶活性測定ii確定α-淀粉酶活性。

14、β-葡糖苷酶：術(shù)語“β-葡糖苷酶”意指具有β-葡糖苷酶活性的多肽，該多肽催化末端非還原性β-d-葡萄糖殘基的水解并釋放β-d-葡萄糖。β-葡糖苷酶的學(xué)名是β-d-葡萄糖苷葡糖水解酶(ec?3.2.1.21)。術(shù)語“β-葡糖苷酶(beta-glucosidase和β-glucosidase)”和表達“具有β-葡糖苷酶活性的多肽”在整個申請中可互換使用。出于本發(fā)明的目的，可以根據(jù)下文實例2中描述的β-葡糖苷酶活性測定確定β-葡糖苷酶活性。

15、生物膜預(yù)防：術(shù)語“生物膜預(yù)防”意指多肽減少在限定條件下生長的生物膜量的能力。出于本發(fā)明的目的，可以根據(jù)本文實例4或?qū)嵗?確定生物膜預(yù)防。

16、義齒：術(shù)語“義齒”旨在涵蓋義齒本身以及矯正器、隱形牙箍、固定器等。

17、片段：術(shù)語“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽，其中該片段具有成熟多肽的酶活性。轉(zhuǎn)化酶的片段具有轉(zhuǎn)化酶活性，β-葡糖苷酶的片段具有β-葡糖苷酶活性，葡糖淀粉酶的片段具有葡糖淀粉酶活性，以及α-淀粉酶的片段具有α-淀粉酶活性。

18、葡糖淀粉酶：術(shù)語“葡糖淀粉酶”意指具有葡糖淀粉酶活性的多肽，該多肽催化末端(1→4)-連接的α-d-葡萄糖殘基依次從鏈的非還原端水解并釋放β-d-葡萄糖。葡糖淀粉酶也稱為葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶，并且其學(xué)名是4-α-d-葡聚糖葡糖水解酶(ec?3.2.1.3)。術(shù)語“葡糖淀粉酶”和表達“具有葡糖淀粉酶活性的多肽”在整個申請中可互換使用。出于本發(fā)明的目的，可以根據(jù)下文實例2中描述的葡糖淀粉酶活性測定確定葡糖淀粉酶活性。

19、轉(zhuǎn)化酶：術(shù)語“轉(zhuǎn)化酶”意指具有轉(zhuǎn)化酶活性的多肽，該多肽催化β-d-呋喃果糖苷中末端非還原性β-d-呋喃果糖苷殘基的水解。轉(zhuǎn)化酶也稱為β-呋喃果糖苷酶，并且其學(xué)名是β-d-呋喃果糖苷果糖水解酶(ec?3.2.1.26)。術(shù)語“轉(zhuǎn)化酶”和表達“具有轉(zhuǎn)化酶活性的多肽”在整個申請中可互換使用。出于本發(fā)明的目的，可以根據(jù)下文實例2中描述的轉(zhuǎn)化酶活性測定確定轉(zhuǎn)化酶活性。

20、成熟多肽：術(shù)語“成熟多肽”意指在n-末端和/或c-末端加工(例如，信號肽的去除)后呈其成熟形式的多肽。

21、親本：術(shù)語“親本”或意指對其進行改變以產(chǎn)生酶變體的酶。在一方面，親本是對其進行改變以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化酶變體的親本轉(zhuǎn)化酶。在一方面，親本是對其進行改變以產(chǎn)生β-葡糖苷酶變體的親本β-葡糖苷酶。在一方面，親本是對其進行改變以產(chǎn)生葡糖淀粉酶變體的親本葡糖淀粉酶。在一方面，親本是對其進行改變以產(chǎn)生α-淀粉酶變體的親本α-淀粉酶。

22、序列兩路一性：兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)度通過參數(shù)“序列同一性”來描述。

23、出于本發(fā)明的目的，使用如在emboss軟件包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件(the?european?molecular?biology?open?software?suite)，rice等人,2000,trendsgenet.[遺傳學(xué)趨勢]16:276-277)(優(yōu)選6.6.0版本或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德曼-翁施算法(needleman-wunsch?algorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物學(xué)雜志]48:443-453)來確定兩個氨基酸序列之間的序列同一性作為“最長同一性”的輸出。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。為了使needle程序報告最長同一性，必須在命令行中指定非簡化(-nobrief)選項。needle標記的“最長同一性”的輸出計算如下：

24、(相同的殘基x?100)/(比對長度–比對中的空位總數(shù))

25、出于本發(fā)明的目的，使用如在emboss軟件包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，rice等人,2000,同上)(優(yōu)選6.6.0版本或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,同上)來確定兩個多核苷酸序列之間的序列同一性作為“最長同一性”的輸出。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5以及ednafull(ncbi?nuc4.4的emboss版本)取代矩陣。為了使needle程序報告最長同一性，必須在命令行中指定非簡化(nobrief)選項。needle標記的“最長同一性”的輸出計算如下：

26、(相同的脫氧核糖核苷酸x?100)/(比對長度–比對中的空位總數(shù))

27、變體：術(shù)語“變體”意指在一個或多個位置處包含人為突變(即，取代、插入(包括延伸)和/或缺失(例如，截短))的轉(zhuǎn)化酶、β-葡糖苷酶、葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。取代意指用不同的氨基酸替代占據(jù)某一位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)某一位置的氨基酸；并且插入意指與占據(jù)某一位置的氨基酸相鄰并緊接其后添加1-5個氨基酸(例如，1-3個氨基酸、1個氨基酸)。