本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種prrsv活載體疫苗，更具體的涉及一種表達(dá)白細(xì)胞介素-15和白細(xì)胞介素-18的重組prrsv基因工程活載體疫苗及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，prrs)是一種嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染性疫病，其病原prrsv是單股正鏈rna病毒，屬于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科，動(dòng)脈炎病毒屬。prrsv因其特殊的基因組結(jié)構(gòu)和基因調(diào)控機(jī)制被研究人員利用反向遺傳技術(shù)用作病毒活載體。prrsv的基因組編碼了多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。首先在基因組結(jié)構(gòu)上，prrsv的基因組對(duì)外源基因具有一定的容納力。它的基因組大約有15kb，其中一部分可以被替換或插入外源基因。另外，prrsv的基因組中部分orfs有重疊(overlap)序列，而另外一個(gè)orfs間區(qū)有基因間隔，那么，這些區(qū)域成為插入外源基因的優(yōu)選區(qū)域。在此區(qū)間插入外源基因獲得的重組病毒，其自身基因的表達(dá)和病毒的生物學(xué)特性與親本病毒差異不顯著。高飛等在高致病性(highly-pathogenic)prrsv弱毒疫苗株(vhun4-f112)的基因組orf1b和orf2a中插入豬瘟病毒的e2基因，另外，在e2基因3'端添加了prrsv的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列6(trs6)，讓e2作為新的亞基因組進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以此構(gòu)建了全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒pprrsv-e2，經(jīng)過(guò)marc-145上的轉(zhuǎn)染和拯救，獲得了重組病毒rprrsv-e2株，該重組病毒能夠表達(dá)豬瘟病毒的e2基因，重組病毒rprrsv-e2也與親本病毒vhun4-f112的生長(zhǎng)特性相似。rprrsv-e2的成功說(shuō)明prrsv的orf1b和orf2a之間是一個(gè)很好的插入位點(diǎn)，比較適合外源基因的插入。

2、大量研究表明，密碼子優(yōu)化后可明顯提高外源蛋白的表達(dá)量，對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化可以從密碼子的偏好性入手，從而提高外源蛋白的表達(dá)量。董聰(2019)等依據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性對(duì)fad依賴的葡萄糖脫氫酶密碼子進(jìn)行優(yōu)化，然后通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體、篩選及優(yōu)化后，獲得了一株高效表達(dá)fad依賴的葡萄糖脫氫酶的重組菌株，解決了fad依賴的葡萄糖脫氫酶難以可溶性重組表達(dá)的問(wèn)題。stachyra(2016)等對(duì)禽流感病毒(h5n1)的血凝素(ha)編碼基因進(jìn)行了優(yōu)化，其密碼子的第三位幾乎均是胞嘧啶(c)或鳥(niǎo)嘌呤(g)，增加了編碼基因中cg的含量，通過(guò)一系列試驗(yàn)表明，此種密碼子的優(yōu)化提高了dna疫苗的基因表達(dá)，還增加了免疫原性。

3、編碼同一種氨基酸的密碼子成為同義密碼子，在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及翻譯的過(guò)程中，同義密碼子的具有不同的使用頻率，且密碼子具有偏好性，即某一個(gè)細(xì)菌或者某一種病毒常使用一種或多種固定的同義密碼子來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，故而確定了與自身相匹配的一系列常用密碼子。不同病毒的對(duì)密碼子的使用并不是隨機(jī)決定的，而是具有一定的偏好性。如尼帕病毒(nipah?virus,niv)的各蛋白基因組的密碼子偏好以a/u結(jié)尾，b、c型的乙型肝炎病毒偏好以u(píng)/c結(jié)尾的密碼子，人類免疫缺陷病毒1型l亞型則偏好以a/u結(jié)尾的密碼子，新型冠狀病毒(sars-cov-2)各蛋白密碼子中以a/u結(jié)尾的占比約84.98％。將插入pprsv中的外源基因進(jìn)行序列優(yōu)化后，可以確保其在病毒基因組中的穩(wěn)定表達(dá)。這包括使用適合宿主病毒的調(diào)控序列或啟動(dòng)子，以促進(jìn)外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，同時(shí)減少對(duì)病毒自身生物學(xué)特性的不良影響，確保疫苗在宿主中有效表達(dá)目標(biāo)蛋白，從而激發(fā)免疫反應(yīng)。

4、在當(dāng)前的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)防控策略中，盡管減毒活疫苗和滅活疫苗作為主要手段，但它們存在一些技術(shù)上的缺陷。減毒活疫苗雖然能夠誘導(dǎo)較高同源性免疫保護(hù)，但長(zhǎng)期存在的疫苗株在免疫豬群中可能會(huì)與野生流行毒株重組，導(dǎo)致毒力重新演化，存在安全性隱患。另一方面，滅活疫苗雖然安全性較高，但其刺激的免疫應(yīng)答相對(duì)較弱，難以形成有效的免疫保護(hù)，市場(chǎng)接受度也不高。相比之下，利用prrsv作為載體構(gòu)建重組病毒，并通過(guò)密碼子優(yōu)化外源基因如il15和il18等免疫增強(qiáng)因子的表達(dá)，可以顯著提升疫苗的免疫效果。密碼子優(yōu)化可以確保外源蛋白在病毒基因組中穩(wěn)定、高效地表達(dá)，從而避免了傳統(tǒng)疫苗可能出現(xiàn)的毒力返祖和重組演化問(wèn)題。此外，結(jié)合il15、il18等免疫調(diào)節(jié)因子，不僅能夠有效激活免疫反應(yīng)，還有助于增強(qiáng)疫苗的免疫原性和保護(hù)效果。因此，這種技術(shù)不僅在疫苗研發(fā)中具有重要的應(yīng)用前景，特別是在治療免疫缺陷病毒感染和腫瘤等疾病方面，而且體現(xiàn)了在克服傳統(tǒng)疫苗技術(shù)缺陷和提高技術(shù)高度方面的顯著優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中疫苗的上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的在于，首先，提供一種表達(dá)豬源il15基因或il18基因的豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組疫苗。

2、其中所述的表達(dá)豬源il15基因或il18基因的豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組疫苗分別為rprrsv-il15-y和rprrsv-il18-y，所述重組疫苗是由重組質(zhì)粒pprrsv-il15-y和pprrsv-il18-y，轉(zhuǎn)染marc-145細(xì)胞后拯救得到。

3、其中，pprrsv-il15-y的全長(zhǎng)為16494bp，其中第1-9999位核苷酸序列如seq?idno.1所示，第10000-16494位核苷酸序列如seq?id?no.2所示；pprrsv-il18-y的全長(zhǎng)位16584bp，其中第1-9999位核苷酸序列如seq?id?no.3所示，第10000-16584位核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

4、進(jìn)一步的，本發(fā)明同時(shí)提供一種il15或il18基因的豬繁殖與呼吸綜合征病毒嵌合疫苗的批量制備方法，所述方法按以下步驟進(jìn)行：(1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：將marc-145細(xì)胞經(jīng)過(guò)edta-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成單層時(shí)，備用；(2)細(xì)胞種毒的繁殖：將病毒液按1/10的體積量接入已經(jīng)生長(zhǎng)良好細(xì)胞單層的細(xì)胞瓶，吸附1小時(shí)后，加入細(xì)胞維持液于細(xì)胞系單層，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)70-80％細(xì)胞出現(xiàn)病變后收獲，收獲后的毒液凍融2～3次后置于-15℃以下保存，取少量做半成品檢驗(yàn)；(3)配苗、分裝及凍干：將檢驗(yàn)合格的病毒培養(yǎng)液與常規(guī)穩(wěn)定劑按1︰1的體積比在一容器內(nèi)混合，充分搖勻，定量分裝；每頭份含細(xì)胞毒液不少于105.0tcid50，分裝后進(jìn)行冷凍干燥即得成品。

5、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種上述表達(dá)豬源il15基因或il18基因的豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，所述方法為根據(jù)豬源il15基因和豬源il18基因合成相關(guān)質(zhì)粒，在hun4-f112的orf1b和orf2a之間插入il15基因或il18基因，并在外源基因3'端下游插入prrsv的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列6(trs6)。將擴(kuò)增出的兩個(gè)嵌合il15片段和il18片段通過(guò)asc?i和ecorv雙酶切，然后回收產(chǎn)物連接到hun4-f112的asc?i和ecorv雙酶切載體上，從而獲得了嵌合重組質(zhì)粒，所述嵌合重組質(zhì)粒為pprrsv-il15-y和pprrsv-il18-y。

6、有益效果

7、本發(fā)明的嵌合il15或il18的prrsv的基因工程活疫苗候選株，是能夠穩(wěn)定表達(dá)il15或il18蛋白的高致病性prrsv細(xì)胞傳代致弱株hun4-f112嵌合重組弱毒疫苗株。使用本發(fā)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pprrsv-il15-y和pprrsv-il18-y，轉(zhuǎn)染marc-145細(xì)胞后所拯救出來(lái)的病毒具有和親本病毒vhun4-f112相似的病毒生物學(xué)特性。并且在至少連續(xù)10代次的傳代過(guò)程中能夠保持遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)，基于上述重組質(zhì)粒，構(gòu)建的兩株嵌合重組疫苗株rprrsv-il15-y和rprrsv-il18-y對(duì)豬體具有較好的安全性，免疫后可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，不僅能夠產(chǎn)生高水平的與親本疫苗相似的prrsv?n蛋白抗體，而且可以誘導(dǎo)更高的細(xì)胞免疫水平。因?yàn)榕R床上感染prrsv的同時(shí)，會(huì)繼發(fā)性引起其他病毒或者細(xì)菌的感染，而本研究中獲得的重組疫苗可以增強(qiáng)豬體的細(xì)胞免疫水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。