本發(fā)明涉及骨缺損修復(fù)，具體涉及了雙模式釋放il-4和tcp的pga-sf核殼支架及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、由外傷、手術(shù)、感染、先天畸形及腫瘤導(dǎo)致的骨缺損是全球面臨的重大醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)。骨再生是一個動態(tài)過程，可分為炎癥期、骨形成期和骨重塑期，現(xiàn)有的傳統(tǒng)骨移植替代材料無法匹配骨再生的動態(tài)變化及滿足骨愈合的差異化需求，理想的骨移植替代材料應(yīng)與植入?yún)^(qū)域的骨愈合進程相匹配，包括材料降解速率與新骨生成匹配，以及材料釋放的活性成分與不同時期骨愈合需求相匹配。復(fù)合材料為骨移植替代材料的可控降解提供了研發(fā)思路。

2、發(fā)明人使用絲素蛋白(sf)和聚乙醇酸(pga)制造了一種同軸的pga-sf核殼支架(pga-sf-fs)，以滿足骨移植的需求。sf殼層展現(xiàn)出優(yōu)秀的成骨活性，同時保護pga免于快速降解，而pga核芯則賦予支架出色的韌性(yuan?zhang，stepwise?degradable?pga-sfcore-shell?electrospinning?scaffold?with?superior?tenacity?in?wetting?regimefor?promoting?bone?regeneration，mater?today?bio.2024mar?12:26:101023.doi:10.1016/j.mtbio.2024.101023.ecollection?2024jun.)。與生物相容性和成骨作用相關(guān)的實驗(如細(xì)胞附著、增殖、分化和礦化)證明了pga-sf核殼支架在促進細(xì)胞生長和成骨分化方面的卓越能力。利用sprague-dawley大鼠顱骨缺損模型進行的體內(nèi)測試表明，隨著植入時間的增加，pga-sf核殼支架能加速骨再生，其逐步降解有助于匹配宿主骨組織的重塑動力學(xué)。另外，通過cd31和col-1的免疫組化染色實驗，確認(rèn)了pga-sf核殼支架增強再血管化和成骨反應(yīng)的能力。pga-sf核殼支架充分利用兩種成分的優(yōu)勢，表現(xiàn)出濕潤條件下逐步降解和優(yōu)異的韌性，使其成為治療骨缺陷的有希望的候選材料。

3、但是，pga-sf核殼支架仍然存在一定的缺陷，例如，不能有效調(diào)控骨再生動態(tài)過程中炎癥反應(yīng)，促進骨再生和礦化的效果有限等。亟需在pga-sf核殼支架的基礎(chǔ)上進行改進，以滿足應(yīng)用需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供雙模式釋放il-4和tcp的pga-sf核殼電紡絲支架，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的pga-sf核殼支架抗炎以及促進骨再生和礦化的效果有限的技術(shù)問題。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、雙模式釋放il-4和tcp的pga-sf核殼電紡絲支架，其由靜電紡絲構(gòu)成；所述靜電紡絲包括聚乙醇酸材質(zhì)的核芯和絲素蛋白材質(zhì)的外殼；在核芯中加載有磷酸三鈣，在外殼上吸附有細(xì)胞因子白介素4。

4、本技術(shù)方案還提供了一種雙模式釋放il-4和tcp的pga-sf核殼電紡絲支架的制備方法，包括以下依次進行的步驟：

5、s1電紡液配制：將絲素蛋白溶于六氟異丙醇，獲得絲素蛋白電紡液；將聚乙醇酸溶于六氟異丙醇，獲得聚乙醇酸溶液，然后將磷酸三鈣分散于聚乙醇酸溶液中，獲得聚乙醇酸混合電紡液；

6、s2電紡：將絲素蛋白電紡液注入同軸靜電紡絲機的同軸針頭的外層針頭，將聚乙醇酸混合電紡液注入同軸靜電紡絲機的同軸針頭的內(nèi)層針頭；經(jīng)電紡、乙醇浸泡、戊二醛浸泡、干燥后，獲得pga/tcp-sf電紡絲支架；

7、s3加載il-4：將pga/tcp-sf電紡絲支架放置于il-4溶液，經(jīng)孵育后后的pga/tcp-sf/il-4電紡絲支架。

8、進一步，在s1中，絲素蛋白電紡液的絲素蛋白的濃度為8wt％；聚乙醇酸混合電紡液的聚乙醇酸的濃度為10wt％，磷酸三鈣的濃度為1-5wt％。

9、進一步。在s1中，絲素蛋白由如下方法制備：使用沸騰的碳酸鈉溶液處理蠶繭碎片脫膠，再經(jīng)過水漂洗、烘干，加入溴化鋰溶液溶解；經(jīng)過透析、離心后凍干，獲得絲素蛋白。

10、進一步，在s2中，電紡的紡絲電壓為15kv-25kv；同軸針頭的噴嘴到接收板的垂直距離為18cm-20cm。

11、進一步，在s2中，同軸針頭的外層針頭的規(guī)格為14g，內(nèi)層針頭的規(guī)格為17g。

12、進一步，在s2中，絲素蛋白電紡液的進液速度為3.2ml/min，聚乙醇酸混合電紡液的進液速度為0.8ml/min。

13、進一步，在s2中，電紡過程中，空氣溫度為26±3℃，濕度為45±5％。

14、進一步，在s3中，il-4溶液的濃度為100-500ng/ml，孵育時間為4h。

15、本技術(shù)方案還提供了一種雙模式釋放il-4和tcp的pga-sf核殼電紡絲支架在制備治療骨缺損的醫(yī)用材料中的應(yīng)用。

16、進一步，所述骨缺損為非承重區(qū)發(fā)生的骨缺損。

17、本技術(shù)方案的技術(shù)原理和有益效果在于：

18、在本技術(shù)方案中，采用同軸靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建pga-sf核殼纖維，利用同軸靜電紡絲纖維的載藥功能，在核殼纖維支架外層sf負(fù)載具有炎癥調(diào)控功能的細(xì)胞因子白介素4(interleukin?4，il-4)，在材料植入早期持續(xù)釋放以促進巨噬細(xì)胞m2型極化，限制過度的炎癥反應(yīng)；在內(nèi)層pga纖維中負(fù)載具有促成骨功能的磷酸三鈣(tricalcium?phosphate，tcp)，實現(xiàn)新骨再生和礦化。通過il-4和tcp兩者協(xié)同作用以更好滿足骨缺損修復(fù)需求。

19、骨再生是一個受多種因素影響的復(fù)雜生理過程，本方案的紡絲支架充分地適應(yīng)了骨愈合動態(tài)過程中早期炎癥期與后期骨修復(fù)期的對生物因子需求的差異。本方案的pga/tcp-sf/il-4核殼纖維支架可逐級釋放雙因子。用于抑制過度炎癥和促進持續(xù)骨再生，il-4從同軸靜電紡纖維外層sf快速釋放，tcp從核層pga持續(xù)釋放。通過對支架的形貌、理化性能進行表征，體外實驗通過raw?264.7和bmscs的共培養(yǎng)觀察支架對巨噬細(xì)胞極化及bmscs的成骨分化行為影響，最后在體內(nèi)實驗中評估了支架的炎癥改善能力和促成骨行為。

20、本方案的靜電紡絲支架所達(dá)到的有益效果在于：

21、(1)支架可以很好的模擬細(xì)胞外基質(zhì)，具有良好的生物相容性，有利于細(xì)胞的黏附及增殖。

22、改進骨移植材料的主要策略是通過膠原蛋白和無機物的結(jié)合來模仿天然骨的成分、結(jié)構(gòu)和特性。天然骨的細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)主要由嵌入膠原纖維的納米羥基磷灰石(haps)組成，從而形成交錯的纖維間礦化模式。sf的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和生物相容性顯示出與骨膠原類似的特征。tcp與hap具有相同的化學(xué)成分和晶體結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性、生物活性和骨誘導(dǎo)性。由嵌入sf纖維的tcp組成的pga/tcp-sf/il-4可模擬由嵌入納米hap的膠原纖維構(gòu)成的天然骨結(jié)構(gòu)。與hap的緩慢降解阻礙新骨形成不同，tcp可以完全降解，從而促進成骨。電紡絲具有多種優(yōu)勢，包括高表面體積比、相互連接的孔隙以及模仿天然ecm形態(tài)的納米纖維。在同軸纖維中嵌入tcp粒子可避免tcp或hap在電紡絲過程中造成的阻礙。在本研究中，電紡絲支架是用隨機排列的微納米纖維制造的，這些微納米纖維與天然ecm非常相似，從而創(chuàng)造了有利于細(xì)胞活動的仿生環(huán)境。

23、(2)體外實驗證實，與單一負(fù)載il-4或tcp的支架相比，雙因子分級釋放的pga/tcp-sf/il-4支架更有效地限制了早期炎癥，促進巨噬細(xì)胞向促愈合型的m2型極化，同時促進了bmscs的成骨分化。

24、體內(nèi)實驗證實，pga/tcp-sf/il-4支架植入大鼠顱骨骨缺損后，營造良好的免疫微環(huán)境，更顯著促進骨再生。

25、雖然il-4和tcp作為活性成分已被廣泛研究，但il-4和tcp之間是否存在協(xié)同作用，如何有效發(fā)揮協(xié)同作用，仍不清楚。骨愈合是一個復(fù)雜的生理過程，包括炎癥免疫調(diào)節(jié)和多種事件，包括血管生成、成骨分化和生物礦化。在免疫階段，快速釋放的il-4和緩慢釋放的tcp可改善炎癥環(huán)境。與負(fù)載il-4或tcp或不負(fù)載il-4的支架相比，雙因子支架(pga/tcp-sf/il-4組)在體外和體內(nèi)都具有最明顯的抗炎效果，發(fā)揮il-4和tcp的協(xié)同作用。tcp通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化和調(diào)控wnt信號通路增強了bmscs的成骨分化，強調(diào)了tcp通過免疫調(diào)節(jié)特性在骨愈合中的治療潛力。在成骨階段，tcp的持續(xù)釋放顯著增強了成骨活性。此外，骨免疫調(diào)節(jié)生物材料pga/tcp-sf/il-4通過il-4和tcp的雙模式釋放，針對巨噬細(xì)胞和bmscs之間的交流，系統(tǒng)地調(diào)節(jié)細(xì)胞行為和骨免疫環(huán)境，從而促進骨再生。