本發(fā)明屬于腫瘤藥物，尤其是一種納米海綿免疫藥劑及制備方法和抗腫瘤應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是大多數(shù)腫瘤的標(biāo)志，并導(dǎo)致約90％的癌癥患者死亡。當(dāng)前的臨床干預(yù)措施，如腫瘤切除、化療和放療，雖然能消除一些原發(fā)性腫瘤，但往往無法防止腫瘤復(fù)發(fā)，甚至可能促進(jìn)轉(zhuǎn)移。近年來，光熱療法(ptt)的時(shí)空選擇性為治療實(shí)體腫瘤提供了另一途徑。ptt具有非侵入性和局部精準(zhǔn)治療的能力，適當(dāng)?shù)膒tt通過破壞腫瘤細(xì)胞完整性并釋放腫瘤相關(guān)抗原，誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡(icd)從而啟動(dòng)受控的免疫抗腫瘤反應(yīng)，并通過免疫記憶效應(yīng)和特異性抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

2、然而，最近的研究表明，過度的ptt將引發(fā)不受控的炎癥反應(yīng)，可能會(huì)壓倒ptt觸發(fā)的免疫原性，并導(dǎo)致皮膚膿腫、永久性組織損傷、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)腫瘤再生。更糟糕的是，腫瘤的異常代謝產(chǎn)物乳酸(la)將作為炎癥的放大器，與多種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等之間存在信號(hào)串?dāng)_，直接或間接地加劇了腫瘤免疫抑制微環(huán)境(tme)的形成。具體來說，炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tnf-α)和白細(xì)胞介素-6(il-6)通過nf-κb通路啟動(dòng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)，增強(qiáng)癌細(xì)胞的干性和遷移行為。另一方面，轉(zhuǎn)移前生態(tài)位(pmn)在初級(jí)腫瘤形成期間悄然建立，并因過度的ptt炎癥反應(yīng)而惡化。各種炎性介質(zhì)將重塑肺實(shí)質(zhì)，為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctcs)提供“土壤”。伴隨ptt相關(guān)炎癥反應(yīng)，免疫抑制細(xì)胞涌入腫瘤病灶，并在高腫瘤代謝產(chǎn)物乳酸環(huán)境中得到滋養(yǎng)，成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的幫兇。這種腫瘤內(nèi)的代謝失衡將與ptt炎癥反應(yīng)相互驅(qū)動(dòng)，而其代謝產(chǎn)物乳酸被譽(yù)為免疫混亂的策劃者。

3、為緩解腫瘤和pmn中的炎癥微環(huán)境，研究人員發(fā)現(xiàn)了包裹白細(xì)胞膜(如中性粒細(xì)胞膜，巨噬細(xì)胞膜)的納米藥劑，這些納米藥劑不僅具有炎癥“歸巢”特性，還能作為誘餌吸附炎癥分子，被稱為納米海綿，它們已被證明能針對(duì)關(guān)節(jié)炎、敗血癥等疾病進(jìn)行抗炎治療，但還未見在腫瘤疾病中的應(yīng)用，并且解決治療相關(guān)炎癥與腫瘤代謝串?dāng)_的一體式治療方案還未見報(bào)道。

4、基于以上背景，我們研究了一種細(xì)胞狀納米海綿(pl@m1m)，作為新一代光學(xué)免疫試劑，旨在系統(tǒng)性地對(duì)抗原發(fā)性腫瘤并抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。通過介孔多巴胺(mpda)作為ptt核心，吸附乳酸脫氫酶a的sirna(sildha)，并包裹m1型巨噬細(xì)胞膜。由于pl@m1m的炎癥細(xì)胞膜表面的多種受體，其不僅積聚在炎癥病灶處，還可中和大量炎癥細(xì)胞因子，因此，pl@m1m可以避免ptt引起的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。另一方面，pl@m1m將切斷作為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctcs)滋生“土壤”的pmn的“營養(yǎng)”供給，使pmn不適合其生存，從而進(jìn)一步防止轉(zhuǎn)移。同時(shí)，sildha將干擾乳酸的產(chǎn)生，切斷炎癥-乳酸間的正反饋通訊，并重組腫瘤的整體免疫微環(huán)境。總之，pl@m1m改進(jìn)了傳統(tǒng)ptt抗腫瘤治療的不足，系統(tǒng)性地抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，為新一代光熱納米藥物的發(fā)展提供了范例。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的需求，本發(fā)明構(gòu)建了一種細(xì)胞狀納米海綿pl@m1m體系，介孔聚多巴胺(mpda)表面通過n,n-二甲基乙二胺(dmea)進(jìn)行叔胺修飾，以促進(jìn)sildha的加載，并用作ptt劑和乳酸代謝調(diào)節(jié)劑(即pl)。最后，pl被新收集的m1型巨噬細(xì)胞(m1m)膜碎片包裹(即pl@m1m)。最終，pl@m1m可以在多個(gè)步驟中抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。首先，基于m1m的“歸巢”炎癥能力，pl@m1m可以通過光免疫治療顯著靶向破壞的原發(fā)性腫瘤。隨后，pl@m1m通過膜表面受體自發(fā)中和ptt炎癥細(xì)胞因子，抑制原發(fā)性腫瘤的emt過程。pl@m1m“歸巢”至pmn，通過中和細(xì)胞因子進(jìn)行抗炎，并防止ctcs在pmn中定殖。最后，sildha可以通過阻斷腫瘤炎癥-乳酸代謝交叉，減少免疫抑制細(xì)胞耐受性，并重振免疫抑制腫瘤微環(huán)境，進(jìn)一步防止腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

3、一種納米海綿免疫藥劑，利用改性劑對(duì)納米光熱劑表面改性，隨后通過靜電吸附作用搭載乳酸la代謝干擾劑，最后用細(xì)胞膜仿生外衣對(duì)納米光熱劑表面進(jìn)行包裹，最終構(gòu)建成細(xì)胞狀納米海綿免疫藥劑；

4、所述的納米光熱劑選自有機(jī)光熱材料；有機(jī)光熱材料選自小分子有機(jī)染料、超分子復(fù)合物、共軛聚合物；

5、小分子有機(jī)染料優(yōu)選：吲哚菁綠(indocyanine?green,icg)，羅丹明b(rhodamineb)；

6、超分子復(fù)合物優(yōu)選：染料-金屬配合物復(fù)合物,mof-染料復(fù)合物；

7、共軛聚合物優(yōu)選：聚噻吩(polythiophene),聚苯乙烯(polystyrene)。

8、改性劑選自：胺類化合物或陽離子聚合物；

9、所述的乳酸代謝干擾劑：通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶1、乳酸脫氫酶a亞基ldha靶點(diǎn)來調(diào)控乳酸的產(chǎn)生，通過包括單羧基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1、單羧基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體來調(diào)控乳酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，通過乳酸氧化酶來調(diào)控乳酸的降解；

10、所述的細(xì)胞膜仿生外衣選自巨噬細(xì)胞膜、巨噬細(xì)胞外泌體膜、中性粒細(xì)胞膜。

11、作為優(yōu)選方式，納米光熱劑為共軛聚合物時(shí)，為介孔聚多巴胺mpda。

12、作為優(yōu)選方式，改性劑為胺類化合物時(shí)，選自dmea或三乙烯四胺，優(yōu)選dmea；

13、改性劑為陽離子聚合物時(shí)，選自聚賴氨酸、聚丙烯胺pam、聚胺、聚乙烯胺。

14、作為優(yōu)選方式，所述的乳酸la代謝干擾劑，優(yōu)選sildha來調(diào)控乳酸la的產(chǎn)生。

15、作為優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞膜仿生外衣優(yōu)選m1型巨噬細(xì)胞膜。

16、作為優(yōu)選方式，所述的抗腫瘤藥物的納米海綿免疫藥劑的制備方法包括如下步驟：

17、第一步,合成pl@m1m：

18、將聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物和1,2,4-三甲基苯溶解在水醇混合液中，加入三羥甲基氨基甲烷tris和多巴胺水溶液，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，離心分離，超聲去除模板劑聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物和1,2,4-三甲基苯，得到mpda懸浮于乙醇中；

19、修飾mpda：將mpda懸浮于tris緩沖液中，添加dmea，室溫?cái)嚢?小時(shí)，離心收集，通過動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)dls及zeta電位分析檢測表面電荷，凝膠滯留實(shí)驗(yàn)測試sildha負(fù)載能力，混合攪拌后離心得到pl復(fù)合物；

20、第二步：合成pl@m1m納米海綿：脂多糖lps誘導(dǎo)m0型巨噬細(xì)胞極化為m1型巨噬細(xì)胞，提取m1m，與pl超聲混合，擠出后離心得到pl@m1m；通過透射電鏡tem、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)dls、瓊脂糖凝膠電泳sds-page和流式細(xì)胞術(shù)分析形態(tài)、尺寸、表面電位和蛋白質(zhì)表達(dá)，并評(píng)估穩(wěn)定性和溶血性。

21、作為優(yōu)選方式，本發(fā)明的抗腫瘤藥物的納米海綿免疫藥劑的制備方法，包括如下步驟：

22、第一步,合成pl@m1m

23、首先將0.36g聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物和0.36g?1,2,4-三甲基苯溶解在65ml水和60ml乙醇的混合物中；攪拌30min后，向混合物中加入5ml的18mg/ml的tris水溶液，然后加入5ml的12mg/ml多巴胺水溶液；在室溫下攪拌反應(yīng)混合物24h；然后以13000rpm離心10min分離得到的顆粒；通過重復(fù)超聲去除模板劑，即樣品首先在乙醇中超聲30min，離心，分散在體積比2:1的乙醇和丙酮的混合溶液中進(jìn)行超聲處理；最終的產(chǎn)品被懸浮在乙醇中以供進(jìn)一步使用；

24、將1mg?mpda懸浮在2ml?tris緩沖液中，然后添加不同濃度的dmea，在室溫下攪拌2小時(shí)；通過離心收集dmea修飾的mpdad；通過dls檢測不同dmea濃度下mpdad的表面電荷；通過凝膠滯留實(shí)驗(yàn)測試sildha負(fù)載能力，將sildha與mpdad按質(zhì)量比sildha：mpdad＝1:0-1:6混合，攪拌4小時(shí)后，通過離心得到mpdad與sildha復(fù)合物pl；

25、第二步：合成pl@m1m納米海綿

26、通過lps誘導(dǎo)m0型巨噬細(xì)胞極化為m1型巨噬細(xì)胞，使用膜蛋白提取試劑盒提取m1m，通過bca蛋白測定法分析總蛋白含量；將提取的m1m與pl超聲，通過聚碳酸酯膜擠出，離心得到pl@m1m；通過tem觀察mpda和pl@m1m的形態(tài)，通過dls分析其水動(dòng)力直徑、表面電位和在sds-page和流式細(xì)胞術(shù)分析m1m、pl@m1m的蛋白質(zhì)表達(dá)；通過觀察cy5熒光與細(xì)胞膜染料dio的重疊，確定m1m與pl的空間定位；最后評(píng)估了pl@m1m在pbs中的穩(wěn)定性以及其溶血性。

27、本發(fā)明還提供一種抗腫瘤藥物組合物，包括上述的納米海綿免疫藥劑。

28、本發(fā)明還提供一種納米海綿免疫藥劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述納米海綿免疫藥劑pl@m1m克服了光熱抗腫瘤藥物的副作用，例如系統(tǒng)性炎癥級(jí)聯(lián)促腫瘤反應(yīng)；納米海綿免疫藥劑pl@m1m利用m1m的炎癥靶向能力，通過光免疫治療消融原發(fā)性腫瘤，并通過膜表面受體中和炎癥因子，抑制腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)過程；pl@m1m"歸巢"至pmn，防止循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctcs)定殖；sildha阻斷腫瘤炎癥與乳酸代謝的交互作用，減少免疫抑制，激活腫瘤微環(huán)境，防止腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)；納米海綿免疫藥劑pl@m1m能夠通過m1m的炎癥靶向、中和細(xì)胞因子、激活腫瘤微環(huán)境的多重機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的全面抑制。

29、作為優(yōu)選方式，使用本發(fā)明的納米海綿免疫藥劑，用于治療如下癌癥的藥物：包括但不限于器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，包括有皮膚癌、惡性黑色素瘤、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、喉癌、甲狀腺癌，舌癌，前列腺癌、陰莖癌、睪丸腫瘤，陰道惡性腫瘤、外陰惡性腫瘤中的一種。

30、本發(fā)明的機(jī)理如下：

31、本發(fā)明構(gòu)建了一種細(xì)胞狀納米海綿pl@m1m體系，介孔聚多巴胺(mpda)表面通過n,n-二甲基乙二胺(dmea)進(jìn)行叔胺修飾，以促進(jìn)sildha的加載，并用作ptt劑和乳酸代謝調(diào)節(jié)劑(即pl)。最后，pl被新收集的m1型巨噬細(xì)胞(m1m)膜碎片包裹(即pl@m1m)。最終，納米海綿免疫藥劑pl@m1m可以在多個(gè)步驟中抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。首先，基于m1m的“歸巢”炎癥能力，納米海綿免疫藥劑pl@m1m可以通過光免疫治療顯著靶向破壞的原發(fā)性腫瘤。隨后，pl@m1m通過膜表面受體自發(fā)中和ptt炎癥細(xì)胞因子，抑制原發(fā)性腫瘤的emt過程。納米海綿免疫藥劑pl@m1m“歸巢”至pmn，通過中和細(xì)胞因子進(jìn)行抗炎，并防止ctcs在pmn中定殖。最后，sildha可以通過阻斷腫瘤炎癥-乳酸代謝交叉，減少免疫抑制細(xì)胞耐受性，并重振免疫抑制腫瘤微環(huán)境(tme)，進(jìn)一步防止腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

32、本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述的細(xì)胞狀納米海綿pl@m1m的方法，所述方法包括如下步驟：

33、1.合成負(fù)載sildha的mpda：mpda是一種優(yōu)異的光熱劑，具有高生物相容性，高光熱轉(zhuǎn)換效率，制備工藝簡單，表面官能團(tuán)豐富等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是在藥物遞送系統(tǒng)和光熱治療等癌癥治療應(yīng)用中具有廣闊的應(yīng)用前景。在此基礎(chǔ)上我們利用dmea修飾通過michael加成/schiff堿反應(yīng)等化學(xué)反應(yīng)與mpda官能團(tuán)醛基形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵，因此在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下具有較好的穩(wěn)定性(mpdad)，有助于保護(hù)sirna并提高遞送效率，在表面修飾后獲得正電荷通過靜電吸附sildha獲得mpdad/sildha(pl)。

34、2.構(gòu)建細(xì)胞狀納米海綿pl@m1m：對(duì)pl用m1型巨噬細(xì)胞膜進(jìn)行仿生包覆，以實(shí)現(xiàn)炎癥歸巢及炎性細(xì)胞因子中和能力。首先是對(duì)收集獲得m1型巨噬細(xì)胞膜，用lps(100pg/ml)誘導(dǎo)m0型巨噬細(xì)胞極化為m1型巨噬細(xì)胞。使用膜蛋白提取試劑盒獲得m1型巨噬細(xì)胞膜碎片(m1m)，采用bca蛋白測定法分析所獲得的m1m中的總蛋白含量。提取的m1m首先用pl超聲處理5min，然后用微型擠出機(jī)反復(fù)推擠，最后將懸浮液離心得到pl@m1m。

35、本發(fā)明的納米海綿pl@m1m體系可以瘤內(nèi)直接給藥或靜脈給藥,pl@m1m通過炎癥“歸巢”低炎癥ppt消融原發(fā)腫瘤并抑制其emt過程，并結(jié)合代謝干擾重組tme。更重要的是，pl@m1m還減輕了pmn的壓力，阻止了它作為“土壤”為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctcs)的增殖提供“養(yǎng)分”。pl@m1m克服了傳統(tǒng)光熱試劑的炎癥相關(guān)副作用，切斷了ptt炎癥與腫瘤代謝通信的聯(lián)系，最大程度上抑制了消除了原發(fā)腫瘤?？棺园l(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)果也證明，在納米海綿pl@m1m治療后，小鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，并明顯改變了肺部pmn的炎癥狀態(tài)，再挑戰(zhàn)模型中也取得了令人滿意的結(jié)構(gòu)，延長了小鼠生存率。最后通過對(duì)小鼠血常規(guī)、肝功、腎功檢測結(jié)果表明納米海綿pl@m1m具有良好的生物安全性。

36、本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

37、(1)設(shè)計(jì)了一種新型的細(xì)胞狀納米海綿(pl@m1m)，結(jié)合了低炎光熱療法和代謝調(diào)節(jié)功能，通過炎性細(xì)胞因子中和聯(lián)合乳酸代謝干擾，系統(tǒng)性地抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

38、(2)納米海綿具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，包括介孔聚多巴胺表面正電荷改性后作為光熱核心、攜帶sirna和m1型巨噬細(xì)胞膜片段，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)炎癥灶的靶向治療和多重功能干預(yù)。首次將納米海綿治療方式應(yīng)用到抗腫瘤領(lǐng)域，并巧妙利用生物膜表面受體中和細(xì)胞因子策略實(shí)現(xiàn)低炎光熱治療。

39、(3)通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，納米海綿具有炎癥歸巢特性，在抗腫瘤方面表現(xiàn)出顯著的效果，包括抑制腫瘤生長、阻止轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，并且能夠有效地調(diào)節(jié)原發(fā)腫瘤微環(huán)境以及繼發(fā)部位pmn的炎癥微環(huán)境，為腫瘤治療領(lǐng)域帶來了新的可能性。