本發(fā)明涉及新型非熱殺菌，具體而言，涉及一種具活性氧轉(zhuǎn)化與膜靶向雙功能的光敏劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、由致病菌引起的食源性疾病在世界各地普遍存在，造成了巨大的損失和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在過去的25年中，全球食源性致病菌感染的發(fā)病率大幅上升，四分之一感染者的健康狀況不容樂觀(ahmed,a.m.,&shimamoto,t.isolation?and?molecular?characterizationof?salmonella?enterica,escherichia?coli?o157:h7?and?shigella?spp.from?meatand?dairy?products?in?egypt.international?journal?of?food?microbiology,2014,168,57-62)。因此，開發(fā)新型高效的殺菌技術(shù)以對(duì)抗食源性致病菌一直受到研究人員、生產(chǎn)商和消費(fèi)者的高度關(guān)注，對(duì)食品安全與人類健康具有重大意義。

2、相較于傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)來說，非熱殺菌可以更大限度地保持食品天然的色、香、味等品質(zhì)，減少對(duì)食品的負(fù)面影響。光動(dòng)力滅活(pdi)作為一種新型非熱殺菌技術(shù)，已被廣泛認(rèn)為是殺滅微生物并確保食品品質(zhì)和安全的有效方法，因其綠色安全、無毒無殘留、不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，近年來逐漸成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。pdi系統(tǒng)的三要素分別為光、氧氣和光敏劑。其原理為在特定波長光源照射下，光敏劑吸收能量產(chǎn)生躍遷，并把能量傳遞給氧分子，將o2轉(zhuǎn)化具有高度氧化能力的活性氧(ros)，ros破壞細(xì)胞微結(jié)構(gòu)、dna、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡。

3、bertoloni等人首次報(bào)道了pdi對(duì)微生物的滅活效力，該研究指出外源性血卟啉在波長為380nm，250w光照下表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和酵母菌的滅活效力(bertoloni,g.,salvato,b.,&dallacqua,m.hematoporphyrin-sensitized?photoinactivation?ofstreptococcus?faecalis.photochemistry&photobiology,1984,39,811-816)。現(xiàn)階段的研究表明，pdi對(duì)大多數(shù)致病菌具有廣譜的殺菌功能。wu等人研究了天然光敏劑姜黃素介導(dǎo)的pdi對(duì)v.parahaemolyticus的滅活效率，姜黃素濃度為10和20μm時(shí)，在470nm?led照射(3.6j/cm2)下，v.parahaemolyticus的細(xì)胞數(shù)量降低至不可檢測(cè)的水平(wu,j.,mou,h.j.,xue,c.h.,leung,a.w.,xu,c.s.,&tang,q.j.(2016).photodynamic?effect?of?curcuminon?vibrio?parahaemolyticus.photodiagnosis?and?photodynamic?therapy,2016,15,34-39)。然而，大多數(shù)天然光敏劑的水溶性差、遇光易分解、理化性質(zhì)不穩(wěn)定，并且傳統(tǒng)光敏劑在高濃度條件下傾向于形成聚集體，產(chǎn)生光猝滅效應(yīng)，從而削弱了ros的產(chǎn)生。

4、小檗堿(bbr)是一種天然聚集誘導(dǎo)發(fā)光物質(zhì)(aiegens)，具有扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(tict)效應(yīng)，在白光(10mw/cm2)照射下，可以殺滅90％的革蘭氏陽性staphylococcusaureus和49％的革蘭氏陰性escherichia?coli(lee,m.m.s.,zheng,l.,yu,b.,xu,w.,kwok,r.t.k.,lam,j.w.y.,xu,f.,wang,d.,&tang.b.z.(2019).a?highly?efficient?andaie-active?theranostic?agent?from?natural?herbs.materials?chemistryfrontiers,3,1454–1461)。因此，基于天然aie光敏劑bbr開發(fā)的pdi系統(tǒng)可以在聚集態(tài)下產(chǎn)生大量ros殺滅細(xì)菌細(xì)胞，不受聚集引起的光淬滅效應(yīng)的限制。但是其殺菌效率無法達(dá)到有效殺菌標(biāo)準(zhǔn)(>3log?cfu/ml)，因此，bbr介導(dǎo)的pdi系統(tǒng)的殺菌效率亟待進(jìn)一步提高。此外，bbr為水溶性物質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)其aie特性，需在有機(jī)試劑中使bbr分子聚集，限制分子內(nèi)振動(dòng)。然而，有機(jī)試劑具有細(xì)胞毒性，不適用于食品工業(yè)，為避免有機(jī)試劑的使用，cn110755610a公開了一種具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的抗菌水凝膠及其制備方法，通過將bbr與氨基酸衍生物fmoc-phe-oh共混制備水凝膠，利用氨基酸衍生物自組裝形成的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及靜電相互作用來限制黃連素分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)黃連素的聚集誘導(dǎo)發(fā)光，制備具有光動(dòng)力抗菌效果的水凝膠；然而，在該發(fā)明中，由bbr產(chǎn)生的ros的半衰期短(3μs)、作用半徑小(100nm)，極大地限制了實(shí)際應(yīng)用中pdi的殺菌效率(zhang,a.,wu,h.,chen,x.,chen,z.,pan,y.,qu,w.,hao,h.,chen,d.,&xie,s.(2023).targeting?and?arginine-drivensynergizing?photodynamic?therapy?with?nutritional?immunotherapy?nanosystemsfor?combating?mrsa?biofilms.science?advances,2023,9,9116)。

5、綜上所述，經(jīng)過申請(qǐng)人的海量檢索，本領(lǐng)域至少存在傳統(tǒng)的pdi技術(shù)無法從源頭上對(duì)細(xì)胞和組織中的生物大分子提供持久的氧化，光敏劑也因其穩(wěn)定性差而不能高效地作用于目標(biāo)細(xì)胞的問題，因此，需要開發(fā)或者改進(jìn)一種具活性氧轉(zhuǎn)化與膜靶向雙功能的光敏劑及其制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，為了解決傳統(tǒng)的pdi技術(shù)無法從源頭上對(duì)細(xì)胞和組織中的生物大分子提供持久的氧化，光敏劑也因其穩(wěn)定性差而不能高效地作用于目標(biāo)細(xì)胞的問題，本發(fā)明提供了一種具活性氧轉(zhuǎn)化與膜靶向雙功能的光敏劑及其制備方法，具體技術(shù)方案如下：

2、一種具活性氧轉(zhuǎn)化與膜靶向雙功能的光敏劑，其制備原料包括bbr/no復(fù)合體和包埋載體；

3、所述bbr/no復(fù)合體的制備原料包括天然aiegens?bbr和no供體；

4、所述包埋載體的制備原料包括包埋腔體和細(xì)胞膜靶向定位肽；

5、所述細(xì)胞膜靶向定位肽為轉(zhuǎn)導(dǎo)激活肽。

6、進(jìn)一步地，所述no供體包括天然氨基酸；

7、所述天然氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、和l-精氨酸中的至少一種。

8、進(jìn)一步地，所述包埋腔體包括β-環(huán)糊精、葫蘆脲和羧甲基β-環(huán)糊精中的至少一種。

9、進(jìn)一步地，所述bbr/no復(fù)合體的制備方法包括以下步驟：

10、將250～350μm的所述天然aiegens?bbr和50～1500μm的所述no供體混合，然后在45～55℃下避光攪拌0.5～1.5h，然后冷卻至室溫，然后置于3～5℃下靜置10～15h，然后使用0.4～0.5μm的濾膜過濾，然后烘干，得到所述bbr/no復(fù)合體；

11、所述天然aiegens?bbr和no供體的化學(xué)計(jì)量比為1～2：1～4。

12、進(jìn)一步地，所述包埋載體的制備方法包括以下步驟：

13、將50～150μm所述細(xì)胞膜靶向定位肽加入edc/nhs共軛溶液中進(jìn)行活化處理，然后加入50～500μm所述包埋腔體，然后進(jìn)行震蕩反應(yīng)，然后置于透析膜中進(jìn)行流水透析處理，得到所述包埋載體；

14、所述細(xì)胞膜靶向定位肽和所述包埋腔體的化學(xué)計(jì)量比為1：1～4；

15、所述透析膜的分子量為1800～2200d；

16、所述流水透析處理的時(shí)間為22～28h。

17、進(jìn)一步地，所述活化處理的條件為轉(zhuǎn)速100～300rpm，溫度30～50℃，反應(yīng)時(shí)間1～3h；

18、所述震蕩反應(yīng)的條件為轉(zhuǎn)速100～300rpm，溫度30～50℃，反應(yīng)時(shí)間3～5h。

19、進(jìn)一步地，所述edc/nhs共軛溶液的制備方法包括以下步驟：

20、將0.05～0.15m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和0.01～0.03m的n-羥基丁二酰亞胺溶解于0.05～0.15m的2-嗎啉乙磺酸緩沖液中，然后調(diào)節(jié)共軛溶液ph值為5～6，得到所述edc/nhs共軛溶液。

21、本技術(shù)方案還提供了一種具活性氧轉(zhuǎn)化與膜靶向雙功能的光敏劑的制備方法，其包括以下步驟：

22、將bbr/no復(fù)合體和包埋載體在40～60℃下避光攪拌1～3h，然后冷卻至室溫，然后置于3～5℃下靜置10～15h，然后置于透析膜中進(jìn)行流水透析處理，得到所述光敏劑。

23、進(jìn)一步地，所述bbr/no復(fù)合體和包埋載體的化學(xué)計(jì)量為1～3：1～3；

24、所述透析膜的分子量為1500～2500d；

25、所述流水透析處理的時(shí)間為20～30h。

26、進(jìn)一步地，本技術(shù)方案還提供了一種光敏劑的應(yīng)用，其用于殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，殺菌率＞99％。

27、上述技術(shù)方案通過cmcd/tat腔體包埋以1：2比例制備的bbr/l-arg復(fù)合體得到的光敏劑可以將產(chǎn)生的ros快速高效地轉(zhuǎn)化為活性氮(rns)，對(duì)食品中常見的致病菌進(jìn)行高效殺滅。