本發(fā)明屬于生物，涉及肝癌疫苗的制備，具體涉及基于kif20a蛋白的溫敏水凝膠疫苗、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、世界范圍內(nèi)肝癌發(fā)病率占所有惡性腫瘤第6位，死亡率占第3位。肝細胞癌(hepatocellular?carcinoma,hcc)是肝癌最常見的組織學分型，占80％以上[1]。在中國，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第4位，死亡率第2位，嚴重危害國民生命和健康。

2、pd-1/l1阻斷治療是hcc系統(tǒng)性治療的重要方式，臨床療效普遍優(yōu)于靶向治療和化療，但依舊無法滿足中晚期hcc患者長期生存的需求。因此，增強pd-1/l1免疫檢查點阻斷治療的療效，提高客觀緩解率，對改善晚期hcc肝癌患者預后具有重要意義，這不僅是目前亟需解決的臨床問題，也是當前重大的臨床需求。

3、腫瘤疫苗是一種新型的腫瘤免疫治療方法，旨在通過激發(fā)機體的免疫系統(tǒng)來攻擊并殺死腫瘤細胞。目前，世界范圍內(nèi)也有多項腫瘤疫苗的臨床試驗正在進行，因此，腫瘤疫苗是一種可以有效激活cd8+t細胞功能并具有廣泛臨床轉(zhuǎn)化前景的治療方法。然而，目前hcc疫苗臨床試驗使用的抗原，如甲胎蛋白(α-fetoprotein,afp)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,gpc3)、類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human?telomerase?reverse?transcriptase,htert)等，免疫激活效果普遍不是特別理想。因此，發(fā)現(xiàn)更有效的疫苗抗原是目前的迫切需求。

4、驅(qū)動蛋白家族成員20a(kinesin?family?member?20a,kif20a)又名mklp2(mitotic?kinesin-like?protein?2)，是一種微管馬達蛋白。kif20a在細胞分裂過程中起重要作用，特別是在有絲分裂的后期，它參與細胞質(zhì)分裂(細胞器的分配)和中心體的定位。在hcc中，kif20a的表達水平顯著升高，并與hcc惡性程度大、預后不良以及生存率低相關(guān)。本課題組前期研究指出，kif20a促進了hcc的染色體不穩(wěn)定性，進而介導了hcc的惡性生物學行為。kif20a在hcc細胞中高表達，而在正常組織中表達較低，是一種相對較新的taa，其疫苗也用于多種惡性腫瘤治療，但尚未見針對hcc治療效果的研究。目前，雖然有使用kif20a多肽作為腫瘤疫苗的相關(guān)研究，但是僅針對單一人類白細胞抗原(human?leukocyteantigen,hla)亞型的限制性表位，難以在人群中廣泛推廣。此外，多肽僅提供單一的抗原表位，往往僅能激活單一的免疫反應(yīng)，而有效的免疫反應(yīng)通常需要b細胞、cd4+和cd8+t細胞的同時激活，因此既往研究kif20a多肽疫苗效果也不理想，而使用kif20a蛋白免疫源性更強，可以提供更多抗原表位，因此，使用完整蛋白作為抗原可以在一定程度上克服多肽的局限性。

5、脂質(zhì)體作為一種合成的磷脂囊泡，已被美國和中國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于臨床，是一種安全、穩(wěn)定、適用性廣的遞送平臺。此外，脂質(zhì)體對淋巴結(jié)具有良好地靶向性，還能保護抗原，使其免受過早降解而喪失免疫源性。因此，將kif20a蛋白和免疫佐劑r848負載到脂質(zhì)體中，實現(xiàn)抗原和免疫佐劑的同步遞送，不僅在一定程度上可以改善藥物分布，還可以提高抗原和免疫佐劑向淋巴結(jié)的遞送效率，更高效地激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

6、水凝膠在疫苗的構(gòu)建方面也展現(xiàn)出廣闊的前景。水凝膠是一種三維交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以使水凝膠保留大量水分，又可以維持特定的體積和形狀。此外，通過不同的設(shè)計，水凝膠可以表現(xiàn)出不同的機械強度、孔隙度和自愈性等特點，還可以響應(yīng)外部環(huán)境的變化，如溫度、酸堿度和例子濃度等，這使其在藥物控釋方面展現(xiàn)出廣泛的前景。近年來，水凝膠在疫苗領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，它不僅可以對疫苗的有效成分具有保護作用，還可以緩慢釋放抗原，避免了疫苗在體內(nèi)的非特異性分布，從而最小化不良副作用并最大化免疫反應(yīng)，是新一代腫瘤疫苗的研究熱點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供基于kif20a蛋白的溫敏水凝膠疫苗、制備方法及應(yīng)用，基于kif20a蛋白構(gòu)建hcc疫苗，進一步通過共遞送脂質(zhì)體和溫敏水凝膠合理地優(yōu)化疫苗性能，增強其免疫激活效率。

2、本發(fā)明采用的具體方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供基于kif20a蛋白的溫敏水凝膠疫苗的制備方法，包括以下步驟：

4、步驟一、共遞送脂質(zhì)體vac的合成

5、分別稱取dotap、膽固醇和dspe-peg2000，溶于氯仿中，超聲分散均勻，取定量于圓底燒瓶中，加入r848，充分溶解后，在40℃下真空旋蒸直至溶劑完全蒸發(fā)，隨后再加入氯仿，重復旋蒸步驟；待旋蒸結(jié)束后，圓底燒瓶內(nèi)壁形成一層薄膜；取kif20a蛋白水溶液，在水浴下超聲1分鐘水化；將所得溶液吸入脂質(zhì)體擠出器中，在40℃下將脂質(zhì)體分別推過200nm孔徑和100nm孔徑的聚碳酸酯膜；隨后，將所得溶液加入納米透析裝置透析12小時；最后，將溶液洗出，加水定容，轉(zhuǎn)移至玻璃瓶內(nèi)，凍干，得共遞送脂質(zhì)體vac；

6、步驟二、plga-peg-plga三嵌段共聚物水凝膠的合成

7、取一干凈的三口圓底燒瓶，加入磁力攪拌子，隨后加入peg1500，連接油泵，抽真空、通氮氣，排除瓶內(nèi)氧氣殘留；隨后在油浴鍋中加熱至120℃并攪拌30分鐘，使peg1500充分融化；打開油泵抽真空，繼續(xù)120℃加熱2小時以徹底除去peg1500中可能存在的水分；稱取dl-丙交酯和乙交酯，轉(zhuǎn)移至通風櫥，向圓底燒瓶內(nèi)通入氮氣，迅速將稱好的dl-丙交酯和乙交酯加入瓶內(nèi)，塞好瓶塞；抽真空，排除瓶內(nèi)水分和氧氣，120℃加熱30分鐘，使dl-丙交酯和乙交酯溶解并與peg1500充分混合；使用注射器吸取辛酸亞錫，注入圓底燒瓶內(nèi)，封管，并將溫度上升到150℃，維持8小時；待反應(yīng)降至室溫后，向圓底燒瓶內(nèi)加入二氯甲烷，使粗產(chǎn)物充分溶解，并轉(zhuǎn)移至一平底燒瓶中，加入石油醚，使沉淀析出，過濾，所得固體重新溶于二氯甲烷中，加入石油醚析出沉淀并抽濾，得到高純度的plga-peg-plga三嵌段共聚物，所得固體在真空環(huán)境干燥24小時至恒重，保存待用；

8、步驟三、kif20a溫敏水凝膠疫苗csf-vacgel的制備

9、將共遞送脂質(zhì)體vac負載到溫敏水凝膠中，制備成溫敏水凝膠疫苗csf-vacgel，具體步驟如下：

10、①將步驟二所得plga-peg-plga三嵌段共聚物溶于超純水，4℃下攪拌24小時，再加入小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子gm-csf，得到csfgel，4℃保存待用；

11、②向csfgel中加入步驟一所得共遞送脂質(zhì)體vac粉末，渦旋使其分散均勻，得到kif20a溫敏水凝膠疫苗csf-vacgel。

12、作為對上述制備方法的進一步優(yōu)化，步驟一中，所述dotap、膽固醇和dspe-peg2000的摩爾量為50:4:5。

13、作為對上述制備方法的進一步優(yōu)化，步驟二中，dl-丙交酯和乙交酯的摩爾量比為3:1。

14、作為對上述制備方法的進一步優(yōu)化，步驟三的①中，plga-peg-plga三嵌段共聚物的質(zhì)量百分比為15％，gm-csf的濃度為10μg/ml；步驟三的②中，共遞送脂質(zhì)體vac的濃度為1mg/ml。

15、第二方面，本發(fā)明提供上述的制備方法制備的溫敏水凝膠疫苗。

16、第三方面，上述的溫敏水凝膠疫苗在制備肝癌疫苗藥物中的應(yīng)用。

17、有益效果：本發(fā)明制備基于kif20a蛋白的肝癌疫苗，通過脂質(zhì)體和plga-peg-plga三嵌段共聚物水凝膠優(yōu)化疫苗性能，用于增強pd-l1阻斷治療的療效。具體優(yōu)勢表現(xiàn)有：

18、1.通過脂質(zhì)體實現(xiàn)kif20a蛋白和免疫佐劑r848的共遞送，增強免疫激活效果；

19、2.plga-peg-plga三嵌段共聚物溫敏水凝膠實現(xiàn)在體緩釋效果；

20、3.上述水凝膠疫苗在小鼠體內(nèi)增強了pd-l1阻斷治療效果。