本發(fā)明涉及分子生物學診斷治療領域，具體涉及mirna-211-5p抑制劑在制備用于預防和/或治療慢性骨髓炎骨缺損的藥物或試劑盒的應用。

背景技術：

1、慢性骨髓炎(chronic?osteomyelitis，co)是一種以進行性骨破壞、骨壞死為主要特征的骨組織感染性疾病，發(fā)病率達10％，且呈上升趨勢；由于其易復發(fā)、難治愈、骨缺損或骨不不連高發(fā)等特點，成為臨床骨科疑難病癥。目前，co治療原則是對感染部位進行徹底的清創(chuàng)，然后通過骨移植術、masquelet技術等進行骨缺損區(qū)的重建。然而以上方法雖能有效解決慢性骨髓炎清創(chuàng)術后節(jié)段性骨缺損，但由于手術創(chuàng)傷大、髓腔清除等因素可致斷端骨質(zhì)缺損部位的成骨功能抑制，仍存在骨缺損處愈合困難等問題。延遲的骨愈合或骨不愈合將造成嚴重的肢體功能障礙，給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。臨床上通過給予外源性的生長因子，如堿性成纖維生長因子及骨形態(tài)發(fā)生蛋白等以促進骨修復，但是這些外源性因子在體內(nèi)半衰期短、極易降解、價格昂貴，且存在誘發(fā)腫瘤的潛在風險。因此，探尋骨缺損修復機制和干預策略，對治療慢性骨髓炎骨缺損具有重要意義。

2、骨缺損修復是一個再生過程，包括炎癥、成骨、軟骨生成等多個生理過程，正常生理條件下骨創(chuàng)傷初期引發(fā)機體急性炎癥激活，炎癥反應消退則進入骨組織修復或再生階段，然而骨損傷部位如致病菌侵入、內(nèi)毒素及外源性支架等外界因素可引起機體過度的炎癥反應，導致多種炎癥因子白介素-1(il-1)、腫瘤壞死因子-α(tnf-α)等合成和釋放，造成組織或細胞的正常生理功能受損，進而影響骨修復進程。骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemesenchymal?stem?cells，bmscs)具有自我更新和多向分化的潛能，通過向成骨細胞(ob)方向分化參與骨形成，已被證明在骨修復及骨再生方面作用巨大。現(xiàn)有研究顯示，過度炎癥反應抑制bmscs分化功能，與慢性骨髓炎骨缺損發(fā)生發(fā)展密切相關。tnf-α是貫穿co炎癥反應全過程中最為重要的炎癥因子，是常用的炎癥環(huán)境模擬因子，研究發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制bmscs礦化結(jié)節(jié)及成骨分化因子堿性磷酸酶(alp)生成，延緩骨愈合。表明炎癥微環(huán)境介導bmscs成骨分化功能失調(diào)是慢性骨髓炎骨缺損發(fā)生重要原因，揭示慢性骨髓炎骨缺損狀態(tài)下bmscs分化調(diào)控機制是開拓新療法的重要內(nèi)容。

3、micrornas(mirnas)是約22個核苷酸的rnas，通過與3′-非翻譯區(qū)(utrs)中的識別位點相互作用來識別目標mrnas，并在轉(zhuǎn)錄后抑制目標基因的表達。以往研究表明骨髓炎骨缺損患者、模型動物mirnas譜發(fā)生明顯改變，而某些mirna已被證實直接參與骨再生、骨修復調(diào)控，且越來越多證據(jù)證實mirnas介導骨修復與調(diào)控bmscs分化密切相關。如mir-211-5p通過smad/β-catenin通路調(diào)控小鼠bmscs的成骨分化(wang?h，shi?x，guoz,eta1.microrna-211-5p?predicts?the?progression?of?postmenopausal?osteoporosisand?attenuates?osteogenesis?by?targeting?dual?specific?phosphatase?6[j].bioengineered.2022，1?3(3)：5709-5723.)；mir-211-5p過表達的bmscs后成骨分化因子runx2表達顯著降低([1]ju?w，zhang?g，zhang?x，et?al.involvement?of?mirna-211-5pand?arhgap?11a?interaction?during?osteogenic?differentiation?of?mc3t3-e1cells[j].front?surg.2022，9：857170.doi：10.3389/fsurg.2022.857170.[2]huang?j，zhao?l，fan?y，et?al.the?micrornas?mir-204and?mir-211maintain?joint?homeostasisand?protect?against?osteoarthritis?progression[j].nat?commun.2019，10(1)：2876.doi：10.1038/s41467-019-10753-5.)等。慢性骨髓炎骨缺損發(fā)展過程中炎癥因子tnf-α介導mirnas譜發(fā)生改變，造成bmscs成骨分化功能失調(diào)(kuang?w，zheng?l，xu?x，etal.dysregulation?of?the?mir-146a-smad4?axis?impairs?osteogenesis?of?bonemesenchymal?stem?cells?under?inflammation[j].bone?res.201?7，21(5)：17037.doi：10.1038/boneres)。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決上述存在的問題，申請人前期研究發(fā)現(xiàn)慢性骨髓炎骨缺損患者血清及慢性骨髓炎骨缺損大鼠骨組織mir-211-5p表達顯著上調(diào)。tnf-α誘導bmscs后mir-211-5p表達顯著升高，且成骨分化功能抑制。mir-211-5p或可作為慢性骨髓炎骨缺損的重要標志。

2、基于申請人前期研究，進一步研究了mir-211-5p抑制劑對慢性骨髓炎骨缺損大鼠的治療作用。因此，本發(fā)明提供一種mirna標志物mirna-211-5p的應用，具體為mirna-211-5p抑制劑在制備用于預防和/或治療慢性骨髓炎骨缺損的藥物或試劑盒的應用。將geo數(shù)據(jù)庫中骨不連患者和正常骨愈合患者的mirna數(shù)據(jù)進行深度分析，檢測出差異mirna表達譜。制備骨髓炎骨不連大鼠和tnf-α誘導的bmscs模型，實時定量pcr驗證mirna-211-5p表達。進一步制備mirna-211-5p激動劑(mimic)和抑制劑(inhibitor)，研究其對bmscs成骨分化能力及靶基因bmpra的影響。為臨床診斷和治療感染性骨不連提供新的標志物。

3、本發(fā)明的具體技術方案如下：

4、本發(fā)明提供了mirna-211-5p抑制劑在制備用于預防和/或治療慢性骨髓炎骨缺損的藥物或試劑盒的應用。

5、優(yōu)選的，所述mirna-211-5p抑制劑的序列為：

6、5’-aggcaaaggaugacaaagggaa-3’。

7、具體的，應用時，所述mirna-211-5p抑制劑激活bmp2信號通路，在骨不連或炎癥狀態(tài)下促進bmpr1a表達。

8、即mirna抑制劑可以增加bmpr1a基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達。

9、本發(fā)明還提供了一種組合物在制備用于預防和/或治療慢性骨髓炎骨缺損的藥物或試劑盒的應用，所述組合物含有有效量的mirna-211-5p抑制劑和藥學上可接受的病毒、載體或輔料。

10、優(yōu)選的，所述mirna-211-5p抑制劑的序列為：

11、5’-aggcaaaggaugacaaagggaa-3’。

12、具體的，所述藥學上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒中的一種或多種。

13、本發(fā)明還提供了一種用于特異性檢測mirna-211-5p的探針或引物在制備用于診斷和/或預后評估慢性骨髓炎骨缺損的試劑盒中的應用。

14、具體的，所述引物的序列如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示。

15、本發(fā)明具體涉及篩選并驗證mirna-211-5p對骨髓間充質(zhì)干細胞(bmscs)增殖分化的影響。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染mirna-211-5p模擬物(mimic)抑制bmpr1a表達，抑制bmscs增殖分化；轉(zhuǎn)染mirna-211-5p抑制劑(inhibitor)促進bmpr1a表達，為臨床診斷和治療感染性骨不連提供新靶標、新途徑。