本發(fā)明屬于生物材料，具體涉及一種親水性脂肪來源脫細胞基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、脂肪源性脫細胞基質(zhì)(decellular?adipose-derived?matrix,dam)生物支架可以在體內(nèi)實現(xiàn)脂肪組織再生并用于軟組織重建，有廣闊的臨床應(yīng)用前景。自2010年flynn提出經(jīng)典的dam制備方法以來，已有十多種改良和優(yōu)化方法的報道，但各方法主要存在以下問題：

2、1、制備的優(yōu)化缺乏針對性。所有的制備過程都包括破碎細胞、去除細胞成分、去除脂質(zhì)成分幾個步驟。沒有以保留某種有益成分為目的而設(shè)計的具有針對性的優(yōu)化方法。

3、2、制備成本高。經(jīng)典的脫細胞方法需要各種生物酶(胰蛋白酶、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、脂肪酶)等。雖然極大的縮短了脫細胞總耗時，但酶的成本很高，而且酶來源于牛、羊等，增加了引入異種抗原的風險。

4、3、制備過程繁瑣、耗時。經(jīng)典的脫細胞方法需要109個小時，多種洗滌試劑和酶反復重復使用，步驟繁瑣。長時間的漂洗會導致有益成分的流失，并破壞支架的物理結(jié)構(gòu)。各種優(yōu)化方法中，無酶法省略了酶的使用，且一定程度上縮短了制備時間，但也均需要三天以上的時間。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種親水性脂肪來源脫細胞基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明在保留dam中有益成分，即親水性成分的基礎(chǔ)上，提出了一種新的基于無酶法進行脫細胞的技術(shù)方案。

2、本發(fā)明所提供的技術(shù)方案如下：

3、一種親水性脂肪來源脫細胞基質(zhì)支架的制備方法，包括以下步驟：

4、1)從物理破碎后的脂肪組織中獲取親水性脂肪源性脫細胞基質(zhì)前體；

5、2)采用曲拉通x-100(tritonx-100)溶液對親水性脂肪源性脫細胞基質(zhì)前體進行化學漂洗，得到上清液和沉淀；

6、3)分離出步驟2)得到的沉淀，并進行超純水洗滌，收集沉淀，得到親水性脂肪來源脫細胞基質(zhì)支架。

7、上述技術(shù)方案中：

8、通過蛋白質(zhì)譜分析可知，采用triton行化學漂洗，較無酶法在第一步采用nacl水溶液漂洗相比，可保留更多的蛋白成分；

9、其次，將長時間的水漂洗設(shè)置在最后一步，此時dam的親水性蛋白已纏繞成絮，不溶于水，使用水進行漂洗不會損失親水性的有益蛋白；

10、最后，由于為親水性蛋白，不含脂質(zhì)成分，該技術(shù)方案可以省略異丙醇脫脂的步驟。

11、這是該流程制備的支架具有優(yōu)越成脂效果的根本原因。

12、具體的，步驟1)中：所述脂肪組織為廢棄的吸脂脂肪組織。

13、基于上述技術(shù)方案，可以對廢棄的吸脂脂肪組織進行利用。

14、具體的，步驟1)中，所述親水性脂肪源性脫細胞基質(zhì)前體為：從物理破碎形成的脂肪漿液中分離出油和親脂性成分所得到的親水性成分。

15、可以采用現(xiàn)有的基于對親水性和親油性成分的分離原理的手段分離出親水性成分，也可以采用如下方法：

16、1、支架供體的準備：

17、從臨床收集廢棄的吸脂脂肪組織200ml作為供體。將其中粗大的纖維組織、筋膜等挑出后，分裝于50ml離心管，每管25ml脂肪組織，加入25mlpbs浸泡、上下顛倒5次搖勻，低速離心(500g，2min)，去除油脂、血液、腫脹液等，保留中間的脂肪層。pbs洗滌重復三遍。

18、2、物理破碎：

19、收集洗滌后的脂肪組織，再次離心以盡可能去除水分。勻漿機(fj200-sh,huxiltd.,shanghai,china)高速攪拌(20,000r/min)2分鐘，直至完全成液體，沒有肉眼可見的顆粒狀成分。

20、3、親水性和親脂性成分的分離：將每50ml物理破碎后的脂肪液體高速離心(3500g，3min)，取沉淀即為親水性dam前體成分，可得到親水性dam前體的體積為3.5ml。

21、具體的，步驟2)包括以下步驟：

22、2a)在離心管中加入親水性脂肪源性脫細胞基質(zhì)前體和tritonx-100溶液；

23、2b)搖床上震蕩；

24、2c)高速離心，去除上清液，向沉淀部分加入新的tritonx-100溶液；或者，通過濾網(wǎng)將液體成分過濾，向收集的固體成分中加入新的tritonx-100溶液；

25、2d)再重復步驟2b)至2c)兩次至少兩次，得到上清液和沉淀。

26、具體的，步驟2a)中，tritonx-100溶液的體積濃度為0.8～1.2％；親水性脂肪源性脫細胞基質(zhì)前體與tritonx-100溶液的體積比為1:(9～11)。

27、具體的，步驟2b)中，操作溫度為36～38℃；操作時間為4.5～5.5小時。

28、具體的，步驟2c)中，高速離心的離心力為3400～3600g，時間為2.5～3.5min；新的tritonx-100溶液的體積濃度為0.8～1.2％。

29、具體的，步驟2c)中，再重復步驟2b)至2c)兩次，得到上清液和沉淀。

30、具體的，步驟3)包括以下步驟：

31、3a)高速離心去除上清液，向沉淀中加入超純水，搖床上震蕩；或者，通過濾網(wǎng)將液體成分過濾，向收集的固體成分中加入新的超純水；

32、3b)高速離心去除上清液，向沉淀中第二次加入超純水，搖床上震蕩；

33、3c)高速離心去除上清液，向沉淀中第三次加入超純水，搖床上震蕩；

34、3d)離心，收集沉淀，得到親水性脂肪來源脫細胞基質(zhì)支架。

35、具體的，步驟3a)中，親水性脂肪源性脫細胞基質(zhì)前體與超純水的體積比為1:(9～11)；搖床震蕩的溫度為36～38℃，時間為0.4～0.6小時。

36、具體的，步驟3b)中，親水性脂肪源性脫細胞基質(zhì)前體與超純水的體積比為1:(9～11)；搖床震蕩的溫度為36～38℃，時間為6～9小時。

37、具體的，步驟3c)中，親水性脂肪源性脫細胞基質(zhì)前體與超純水的體積比為1:(9～11)；搖床震蕩的溫度為36～38℃，時間為0.4～0.6小時。

38、本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方案制備得到的親水性脂肪來源脫細胞基質(zhì)支架。

39、具體的，親水性脂肪來源脫細胞基質(zhì)支架中bfgf、vegf、cxcl12和ccl21四種關(guān)鍵細胞因子的含量總量大于1ng/ml。

40、本發(fā)明還提供了親水性脂肪來源脫細胞基質(zhì)支架的應(yīng)用，用于制備脂肪再生生物支架。

41、本發(fā)明的有益效果如下：

42、1、提供了適合親水性dam的制備步驟，有效提高了支架的成脂效果(參考圖3)。

43、2、降低了制備成本，整個過程僅使用1％稀釋程度的tritonx-100溶液，與經(jīng)典的使用酶的方法相比成本大大降低。

44、3、簡化了流程，整個制備的漂洗流程僅需25小時。短時間的漂洗保證了dna的有效去除(參考圖5)，同時保留了更多的有益成分，如生長因子(參考圖6)。