本發(fā)明屬于生物，涉及一種增強(qiáng)mrna-lnp組織靶向遞送的方法。

背景技術(shù)：

1、隨著新冠病毒mrna疫苗的成功研發(fā)以及快速獲批，mrna藥物展現(xiàn)出其強(qiáng)有力的應(yīng)用前景。通過(guò)設(shè)計(jì)信使核糖核酸(mrna)的序列理論上可以表達(dá)任何蛋白質(zhì)，如抗原、治療性蛋白、基因編輯元件等等，因此它可被用于預(yù)防性疫苗研制、蛋白替代療法、基因編輯等諸多領(lǐng)域。此外，由于mrna生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低、周期短等特點(diǎn)，在臨床轉(zhuǎn)化中也備受青睞。但mrna攜帶負(fù)電荷且容易被酶降解，實(shí)際應(yīng)用中依賴(lài)安全、高效遞送載體，其中脂質(zhì)納米顆粒(lnp)被認(rèn)為是最佳載體選擇之一，臨床在研的mrna藥物項(xiàng)目超90％依賴(lài)于lnp。

2、lnp通常由可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇和聚乙二醇脂質(zhì)組成。其中，可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)是實(shí)現(xiàn)mrna高效負(fù)載與溶酶體逃逸的關(guān)鍵，也是各科研單位和研發(fā)公司布局的重點(diǎn)?？呻婋x陽(yáng)離子脂質(zhì)分子在低ph環(huán)境中(如ph?4.0)可以被質(zhì)子化，進(jìn)而結(jié)合mrna完成對(duì)其的包裹，而在生理環(huán)境中(ph?7.4)則不帶電，使得lnp呈電中性。目前大多數(shù)的mrna-lnp可用于局部肌肉注射的疫苗應(yīng)用，或靜脈給藥在肝臟分布和表達(dá)。然而，如何實(shí)現(xiàn)高效、特異的肝外器官靶向mrna遞送是領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)重要且關(guān)鍵問(wèn)題，有望拓寬mrna的應(yīng)用前景。

3、近年來(lái)，肝外器官靶向mrna遞送也是取得了一些進(jìn)展。主要有如下：1)電荷介導(dǎo)的靶向策略，通過(guò)在lnp中引入電正性陽(yáng)離子脂質(zhì)(如，季銨脂質(zhì)dotap)可實(shí)現(xiàn)肺靶向mrna遞送，引入電負(fù)性陰離子脂質(zhì)(如，磷酸脂質(zhì)18:1pa)可實(shí)現(xiàn)脾臟靶向mrna遞送，被稱(chēng)為sortlnp技術(shù)(cheng等人，nat.nanotechnol.,15:313-320,2020)；2)研發(fā)新型結(jié)構(gòu)可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)實(shí)現(xiàn)mrna靶向遞送(如qiu等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.,119:e2116271119,2022)；3)通過(guò)抗體修飾lnp策略，如在lnp表面修飾cd31抗體，成功實(shí)現(xiàn)mrna在肺部的表達(dá)(parhiz等人，j.control?release,291:106-115,2018)。

4、上述方法均有一定的優(yōu)勢(shì)和不足，如正電性陽(yáng)離子脂質(zhì)的潛在毒性、新型結(jié)構(gòu)可能的遞送效率低、抗體修飾lnp特異性差等。新型的mrna-lnp藥物具有非常廣闊的應(yīng)用前景，但是目前針對(duì)肝外器官、細(xì)胞的mrna靶向遞送是難點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明解決的問(wèn)題是提供增強(qiáng)mrna-lnp組織靶向遞送的方法。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明第一方面提供了一種增強(qiáng)核酸脂質(zhì)納米顆粒組織靶向遞送性的方法，包括如下步驟：將具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒表面修飾抗體，得到修飾抗體且具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒，實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)所述核酸脂質(zhì)納米顆粒的組織靶向遞送性。

3、上文所述方法中，所述組織為肺、腦或脾。

4、或，所述抗體為靶向肺的抗體、靶向腦的抗體或靶向脾的抗體。

5、上文所述方法中，所述靶向肺的抗體為cd31抗體、plasmalemma?vesicle-associated?protein(pv1)抗體或cd326抗體。

6、或，所述靶向腦的抗體為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體(具體可以為如下任一種或幾種組合：ox26、r17217和8d377)。

7、或，所述靶向脾的抗體為f4/80抗體,cd5抗體，cd4抗體，cd8抗體，cd3抗體或cd19抗體。

8、上文所述方法中，所述具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒為電荷驅(qū)動(dòng)靶向組織的核酸脂質(zhì)納米顆?；蚍请姾沈?qū)動(dòng)靶向組織的核酸脂質(zhì)納米顆粒；

9、所述電荷驅(qū)動(dòng)靶向組織的核酸脂質(zhì)納米顆粒中脂質(zhì)包括可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)，馬來(lái)酰亞胺修飾的聚乙二醇脂質(zhì)和永久性陽(yáng)離子脂質(zhì)；

10、所述非電荷驅(qū)動(dòng)靶向組織的核酸脂質(zhì)納米顆粒中脂質(zhì)包括可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)和馬來(lái)酰亞胺修飾的聚乙二醇脂質(zhì)。

11、上文所述方法中，所述電荷驅(qū)動(dòng)靶向組織的核酸脂質(zhì)納米顆粒中脂質(zhì)還包括輔助脂質(zhì)；

12、所述非電荷驅(qū)動(dòng)靶向組織的核酸脂質(zhì)納米顆粒中脂質(zhì)還包括輔助脂質(zhì)；

13、所述輔助脂質(zhì)包括類(lèi)固醇、磷脂和其他peg脂質(zhì)中的任一種或任2種或3種。

14、上文所述方法中，所述永久性陽(yáng)離子脂質(zhì)(permanently?cationic?lipid)為具有季銨鹽特性的脂質(zhì)分子；

15、或，所述磷脂為具有藥學(xué)上接受的雙親性脂質(zhì)磷脂結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)。

16、上文所述方法中，所述具有季銨鹽特性的脂質(zhì)分子為dotap、ddab、dotma或epc；

17、或，所述具有藥學(xué)上接受的雙親性脂質(zhì)磷脂結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)為dope、dspe、pope、4me、dopc或dspc；

18、或，所述類(lèi)固醇為膽固醇或其類(lèi)似物；

19、或所述其他peg脂質(zhì)為dmg-peg、dsg-peg或dspe-peg。

20、上文所述方法中，所述電荷驅(qū)動(dòng)靶向組織的核酸脂質(zhì)納米顆粒為電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒；其中，各個(gè)脂質(zhì)的摩爾比分別如下：所述可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)占總脂質(zhì)的摩爾比為20％-80％，所述永久性陽(yáng)離子脂質(zhì)占總脂質(zhì)的摩爾比為10％-50％，所述馬來(lái)酰亞胺修飾的聚乙二醇脂質(zhì)占總脂質(zhì)的摩爾比為0.5-5％，所述輔助脂質(zhì)占總脂質(zhì)的摩爾比為0-40％。

21、或，上文所述方法中，所述非電荷驅(qū)動(dòng)靶向組織的核酸脂質(zhì)納米顆粒為非電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒，其中，各個(gè)脂質(zhì)的摩爾比分別如下：所述可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)占總脂質(zhì)的摩爾比為20％-80％，所述馬來(lái)酰亞胺修飾的聚乙二醇脂質(zhì)占總脂質(zhì)的摩爾比為0.5-5％，和，所述輔助脂質(zhì)占總脂質(zhì)的摩爾比為0-45％。

22、上述方法中，所述電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒中所述永久性陽(yáng)離子脂質(zhì)占總脂質(zhì)的摩爾比為30％；

23、或，所述非電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒中所述可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)占總脂質(zhì)的摩爾比為50％。

24、上述電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒中可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)可為sm-102、alc-0315、mc3、c12-200、ckk-e12、4a3-sc8或5a2-sc8，但不限于此；

25、上述非電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒中可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)可為a3-n11f、306-n16b、113-n16b、98n12-5或7c1，但不限于此。

26、上述馬來(lái)酰亞胺修飾的聚乙二醇脂質(zhì)中的聚乙二醇脂質(zhì)可為dspe-peg或dmg-peg，但不限于此。

27、上述膽固醇類(lèi)似物可為β-sitosterol、7α-hydroxycholesterol或25-hydroxycholesterol，但不限于此。

28、上述dmg-peg可為dmg-peg2000，但不限于此。

29、上述dspe-peg可為dspe-peg2000，但不限于此。

30、上述dspe-peg-mal可為dspe-peg2000-mal，但不限于此。

31、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒由如下摩爾比的脂質(zhì)組成：27％-50％?sm-102、10-50％?dotap、1.5％dspe-peg-mal和20-40％?chol；總摩爾比不超過(guò)100％(具體如圖1c)。

32、更進(jìn)一步地，所述電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒由如下摩爾比的脂質(zhì)組成：38.7％?sm-102、30％?dotap、1.5％dspe-peg-mal和29.8％膽固醇；總摩爾比不超過(guò)100％(具體為實(shí)施例中的4c-dotap?lnp)。

33、在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述非電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒由如下摩爾比的脂質(zhì)組成：23-50％?a3-n11f、10-24％?dope、1.5-5％?dspe-peg-mal和38-48％膽固醇；總摩爾比不超過(guò)100％(具體如圖7c)。

34、更進(jìn)一步地，所述非電荷驅(qū)動(dòng)靶向肺的核酸脂質(zhì)納米顆粒由如下摩爾比的脂質(zhì)組成：50％?a3-n11f、10％?dope、1.5％?dspe-peg-mal和38.5％膽固醇；總摩爾比不超過(guò)100％(a3-n11f?lnp)。

35、上述核酸為經(jīng)化學(xué)修飾或未經(jīng)化學(xué)修飾的核酸分子。

36、上述經(jīng)化學(xué)修飾或未經(jīng)化學(xué)修飾的核酸分子例如dna分子或rna分子，優(yōu)選地lnp中總脂質(zhì)與核酸分子的質(zhì)量比為約1-100:1。

37、上述經(jīng)化學(xué)修飾或未經(jīng)化學(xué)修飾的dna分子，可以是任何類(lèi)型的dna分子(但不限于此)，包括但不限于線(xiàn)性或環(huán)狀dna、雙鏈或單鏈或多鏈組裝的dna、編碼或非編碼dna，其任選地選自質(zhì)粒、寡脫氧核苷酸、基因組dna、dna探針、dna適配體、dna納米框架、dna引物、同源修復(fù)dna模板、免疫刺激性dna或其組合。

38、上述經(jīng)化學(xué)修飾或未經(jīng)化學(xué)修飾的rna分子，可以是任何類(lèi)型的rna分子(但不限于此)，包括但不限于信使rna(mrna)、小干擾rna(sirna)、環(huán)狀rna(circrna或orna)、向?qū)na(sgrna)、缺口向?qū)na(nicking?sgrna)、小發(fā)夾rna(shrna)、病毒rna、復(fù)制子rna、轉(zhuǎn)運(yùn)rna(trna)、核糖體rna(rrna)、免疫刺激性rna(isrna)、微小rna(mirna)、小核rna(snrna)、rna適配體、反義rna、rna納米框架、rna核糖核蛋白復(fù)合物或其組合。

39、進(jìn)一步地，所述mrna表達(dá)具有治療功能的蛋白、熒光報(bào)告的蛋白或殺傷腫瘤的蛋白。

40、上述抗體通過(guò)其表面的巰基基團(tuán)與所述具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒表面的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)連接得到。

41、上述修飾抗體且具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒的遞送效果高于所述具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒。

42、第二方面，本發(fā)明提供了由第一方面所述方法制備的修飾抗體且具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒。

43、或，本發(fā)明提供了所述修飾抗體且具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒在制備靶向組織產(chǎn)品中的應(yīng)用。

44、或本發(fā)明提供了一種制備所述修飾抗體且具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒的方法，包括第一方面所述步驟。

45、上述制備修飾抗體且具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒的方法，具體包括如下步驟:

46、a1)將所述具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒中各個(gè)脂質(zhì)溶于有機(jī)溶劑中，得到脂質(zhì)有機(jī)相；再與mrna水相進(jìn)行混合，得到具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒；

47、a2)將所述具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒修飾所述抗體，得到修飾抗體且具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒。

48、或本發(fā)明提供了一種靶向組織產(chǎn)品，其活性成分為所述修飾抗體且具有組織靶向性的核酸脂質(zhì)納米顆粒。

49、上述產(chǎn)品為靶向遞送平臺(tái)或藥物。

50、上述組織為肺、腦或脾。

51、基于上述背景，本發(fā)明提出：結(jié)合上述多種策略有望彌補(bǔ)當(dāng)前靶向mrna-lnp面臨的不足。因此做了如下實(shí)驗(yàn)：1)參考sort?lnp技術(shù)，通過(guò)引入帶電荷脂質(zhì)獲得靶向lnp，與5組分sort?lnp不同，靶向lnp維持4組分，并將lnp中的peg-dmg脂質(zhì)進(jìn)行全替換為dspe-peg-mal(該脂質(zhì)可以提供用于抗體修飾的活性基團(tuán))；2)運(yùn)用cd31抗體建立對(duì)lnp表面修飾技術(shù)，并獲得抗體與lnp的最佳比例；3)分別在電荷驅(qū)動(dòng)的肺靶向lnp、結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的肺靶向lnp中，運(yùn)用cd31抗體修飾均顯著提升了mrna-lnp的遞送特異性、安全性、有效性。4)運(yùn)用上述增強(qiáng)型靶向lnp，完成了白介15超級(jí)激動(dòng)劑mrna的肺靶向遞送，在肺部腫瘤轉(zhuǎn)移小鼠模型中介導(dǎo)了高效率腫瘤免疫治療。這種新型的、抗體增強(qiáng)型肺靶向mrna-lnp遞送策略可以為肺部疾病的治療帶來(lái)新的突破，并極大程度拓寬mrna-lnp藥物的應(yīng)用深度和廣度。

52、本研究中，綜合領(lǐng)域內(nèi)靶向lnp的研發(fā)策略，以期通過(guò)“雙重靶向”手段提升mrna-lnp遞送的各項(xiàng)性能。主要的創(chuàng)新點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)如下：

53、1)參考sort?lnp技術(shù)(通過(guò)額外添加陽(yáng)離子脂質(zhì)到4組分lnp中實(shí)現(xiàn)肺靶向遞送)，優(yōu)化改進(jìn)基于dotap正電荷的肺靶向lnp處方，使用正電荷脂質(zhì)dotap完全替換掉lnp中輔助磷脂dspc，并使用dspe-peg-mal完全替換dmg-peg。與sort?lnp不同，不僅保留4組分，同時(shí)用dspe-peg-mal全替換原有dmg-peg，為后續(xù)抗體修飾lnp提供了mal的活性基團(tuán)。其中，含有30％?dotap的lnp處方(命名為4c-dotap?lnp)具有最佳的轉(zhuǎn)染效果和較好的特異性，效果優(yōu)于先前報(bào)道的5組分sort?lnp(5c-dotap?lnp))。

54、2)建立最佳cd31抗體與lnp比例。通過(guò)優(yōu)化cd31抗體用量，實(shí)現(xiàn)高效的基于抗體修飾的肺靶向mrna遞送(命名為anti?lnp)。

55、3)通過(guò)在4c-dotap?lnp上修飾cd31抗體的協(xié)同靶向策略(命名為synergistictargeted?lnp,syntar?lnp)，使得肺靶向mrna遞送效率進(jìn)一步顯著提高。syntar?lnp可以高效轉(zhuǎn)染、編輯肺臟內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞，并且穩(wěn)定性好。

56、4)通過(guò)與其他肺靶向lnp策略進(jìn)行對(duì)比，syntar?lnp相比于anti?lnp具有更優(yōu)越的特異性，顯著降低了肝臟部位的脫靶表達(dá)。syntar?lnp相較于4c-dotap?lnp和anti?lnp具有更高的肺部遞送效率，以及相較5組分sort?lnp更好的安全性。

57、5)前期建立的結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)靶向lnp技術(shù)(簡(jiǎn)稱(chēng)star?lnp，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)杙ct/cn2023/137998)中，可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)a3-n11f?lnp具有肺靶向遞送mrna功能。利用上述syntar策略，在a3-n11f?lnp上修飾cd31抗體進(jìn)一步增強(qiáng)了遞送效率，驗(yàn)證這種結(jié)合策略的普適性。

58、6)最后，基于早先開(kāi)發(fā)的白介素15超級(jí)激動(dòng)劑mrna技術(shù)(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)杙ct/cn2024/084406)，運(yùn)用syntar?lnp體系介導(dǎo)高效il-15mrna肺靶向遞送，并實(shí)現(xiàn)了小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移的高效抑制，證明了syntar?lnp平臺(tái)的有效性以及疾病治療應(yīng)用的能力。

59、7)基于1-6，開(kāi)發(fā)出一種廣譜、通用且遞送效率和特異性更好的mrna-lnp肺臟靶向遞送技術(shù)，并且能夠高效特異轉(zhuǎn)染肺部的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，為肺部疾病的治療提供了全新的治療手段。并且有合理的理由推斷，通過(guò)抗體聯(lián)合靶向lnp的“雙重靶向”策略有望擴(kuò)展到肺部之外的mrna遞送和治療中，如腦、肝、腎臟、心臟等。

60、本發(fā)明通過(guò)在新型肺靶向lnp的基礎(chǔ)上結(jié)合抗體修飾策略(雙重靶向)，成功實(shí)現(xiàn)了更加高效、特異、安全的肺臟靶向mrna遞送。且該策略適用于任何種類(lèi)的靶向lnp中(本項(xiàng)目中有電荷驅(qū)動(dòng)的dotap?lnp和結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的star?lnp兩種)。最后通過(guò)這種新型的lnp平臺(tái)遞送治療性的il-15超級(jí)激動(dòng)劑mrna，實(shí)現(xiàn)了對(duì)于肺部腫瘤的有效抑制。該成果對(duì)于遺傳性肺臟疾病，肺損傷，肺特發(fā)性纖維化，囊性纖維化，肺癌等疾病的治療具有重要參考意義和價(jià)值。此外，有理由相信，只要選擇合適的抗體以及靶向lnp，該策略可擴(kuò)寬到肺部之外的器官靶向遞送和治療當(dāng)中，如腦、心臟、腎臟、胰腺等。