本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種靶向fap的car-t細(xì)胞在制備治療心肌炎慢性期心臟纖維化的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、心肌炎患者的慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化，損傷后，活化的成纖維細(xì)胞會(huì)分泌大量纖維化因子和細(xì)胞外基質(zhì)，積聚在心肌間質(zhì)和血管周?chē)g隙，重塑心肌。心肌纖維化是心肌間質(zhì)的重塑過(guò)程，其特點(diǎn)是心肌組織間質(zhì)成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原纖維過(guò)度堆積、單位質(zhì)量心肌的膠原濃度和體積分?jǐn)?shù)顯著增加，以及各類(lèi)膠原比例失調(diào)和分布異常。其原因是肌成纖維細(xì)胞在慢性炎癥反應(yīng)下過(guò)度沉積細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，導(dǎo)致疤痕形成和組織硬化，心臟功能逐漸受損，最終導(dǎo)致心力衰竭。然而，臨床上用于干預(yù)心肌炎的藥物大多側(cè)重于抗心力衰竭或心律失常，而不是纖維化過(guò)程，無(wú)法阻止和消除活化的成纖維細(xì)胞。

2、多種刺激可導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生，包括非炎癥途徑和炎癥途徑，如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)途徑和tgf-β途徑。炎癥導(dǎo)致的心肌損傷是心肌纖維化的重要原因之一。在慢性炎癥過(guò)程中，以單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的大量免疫細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)，造成心肌損傷，同時(shí)分泌大量促炎介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-1，形成慢性炎癥微環(huán)境。在這種細(xì)胞環(huán)境中，細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子大量釋放，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族成員和wingless/int-1，它們是纖維化過(guò)程的主要效應(yīng)因子。tgf-β和wnt1與干細(xì)胞表面受體結(jié)合并啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)，最終分別導(dǎo)致smad2/3和cbp/β-catenin轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。這導(dǎo)致靶基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步加強(qiáng)了肌成纖維細(xì)胞的分化和膠原蛋白、層粘連蛋白和纖維連接蛋白的產(chǎn)生和分泌，從而促進(jìn)了心肌纖維化過(guò)程。

3、目前臨床治療纖維化的重點(diǎn)是減輕慢性炎癥、減少促炎癥和促纖維化因子的分泌以及抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的發(fā)展。這包括通過(guò)血管緊張素受體抑制劑或松弛素來(lái)抑制tgf-β和smad，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑之間的平衡，從而治療纖維化。然而，活化的肌成纖維細(xì)胞并不會(huì)就此止步，纖維化過(guò)程也不會(huì)中斷。因此，亟需開(kāi)發(fā)新的治療策略來(lái)針對(duì)心肌炎慢性期的纖維化。

4、嵌合抗原受體t胞療法(car-t)在腫瘤、自身免疫和白血病治療領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展。它從患者的免疫系統(tǒng)中提取t細(xì)胞，在體外培養(yǎng)和改造t細(xì)胞，使其具有識(shí)別和攻擊特定癌細(xì)胞的能力，然后將改造后的t細(xì)胞注射回患者體內(nèi)，t細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)會(huì)消滅癌細(xì)胞。美國(guó)食品和藥物管理局已批準(zhǔn)將car-t細(xì)胞療法用于某些形式的白血病和淋巴瘤患者。最近的研究表明，car-t細(xì)胞療法在實(shí)體瘤、自身免疫性疾病、慢性感染、心臟病和與衰老有關(guān)的疾病方面同樣具有前景。因此，利用car-t細(xì)胞靶向非癌細(xì)胞是一種新的嘗試。喬納森-愛(ài)潑斯坦團(tuán)隊(duì)利用car-t細(xì)胞療法治療纖維化引起的心力衰竭取得了定量的良好效果，研究表明car-t細(xì)胞療法能有效抑制angii誘導(dǎo)的心力衰竭模型小鼠的心肌纖維化過(guò)程。然而，car-t療法目前能否應(yīng)用于慢性炎癥誘發(fā)的心肌纖維化尚不清楚。

5、因此，亟需開(kāi)發(fā)一種針對(duì)心肌炎慢性期所致心肌纖維化的car-t療法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種靶向fap的car-t細(xì)胞在制備治療心肌炎慢性期心臟纖維化的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)fap是心肌炎病理中靶向心臟成纖維細(xì)胞的潛在候選者，并開(kāi)發(fā)了一種fap特異性car-t細(xì)胞(αfap-car-t)，αfap-car-t對(duì)心肌炎慢性期的纖維化治療效果優(yōu)異。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供以fap基因和/或fap蛋白作為作用靶點(diǎn)的物質(zhì)在制備治療心肌炎慢性期心臟纖維化的藥物中的應(yīng)用。

4、優(yōu)選地，所述以fap基因作為作用靶點(diǎn)的物質(zhì)是降低fap基因活性和/或表達(dá)量的抑制劑。

5、優(yōu)選地，所述以fap蛋白作為作用靶點(diǎn)的物質(zhì)是降低fap蛋白表達(dá)與功能的抑制劑，或靶向fap蛋白的抗體、靶向fap蛋白的car分子、靶向fap蛋白的car細(xì)胞。

6、優(yōu)選地，所述抑制劑包括：小分子化合物、表達(dá)fap基因的干擾rna載體或fap基因敲低或者敲除體系的載體中任意一種或兩種的組合。

7、優(yōu)選地，所述載體包括：腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、質(zhì)粒、脂質(zhì)體或納米顆粒中任意一種或至少兩種的組合。

8、優(yōu)選地，所述靶向fap蛋白的car細(xì)胞包括：car-t、car-nk、car-nkt、car-m(car-巨噬細(xì)胞)、car?treg或car-γδt中任意一種。

9、本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)fap特異性car-t細(xì)胞能有效靶向表達(dá)小鼠fap蛋白的細(xì)胞，car-t細(xì)胞被激活后還能有效清除表達(dá)小鼠fap蛋白的細(xì)胞。

10、本發(fā)明還提供了靶向fap蛋白的car-t細(xì)胞在制備治療心肌炎慢性期心臟纖維化的藥物中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)心肌炎慢性期所致心肌纖維化的car-t療法。通過(guò)心肌炎患者、擴(kuò)張型心肌病患者和健康人的rna測(cè)序數(shù)據(jù)，來(lái)確定心肌炎慢性期纖維化的特異基因和心臟纖維化的內(nèi)源性靶點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建car-t來(lái)表達(dá)針對(duì)靶點(diǎn)的嵌合抗原受體。隨后，構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎(eam)模型和病毒性心肌炎模型(cvb9)，以模擬與炎癥相關(guān)的慢性心肌纖維化。通過(guò)靜脈將car-t定期注射到心肌炎小鼠體內(nèi)，研究其治療心肌炎慢性階段心肌纖維化的效果。根據(jù)eam、cvb9小鼠心肌樣本和人類(lèi)心肌炎患者樣本的研究結(jié)果，成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)是心肌炎慢性期患者中表達(dá)量最高的纖維化基因，其表達(dá)量與心臟纖維化程度相關(guān)。因此fap被選為心肌炎慢性期纖維化的標(biāo)志物。表達(dá)靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白的嵌合抗原受體t細(xì)胞(αfap-car-t)能識(shí)別活化的心肌成纖維細(xì)胞，并顯著減輕小鼠炎癥損傷后的心臟纖維化并恢復(fù)功能。這種方法有效地減輕了小鼠心肌炎慢性期的心臟纖維化，并恢復(fù)了炎癥損傷后的功能。這些發(fā)現(xiàn)為car-t在治療心臟免疫相關(guān)疾病方面的發(fā)展提供了證據(jù)。

12、優(yōu)選地，所述靶向fap蛋白的car分子特異性結(jié)合心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)的fap蛋白，所述car分子的胞外識(shí)別結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列選自：

13、如seq?id?no.2所示的氨基酸序列；或者如seq?id?no.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，具有結(jié)合fap功能的氨基酸序列。

14、優(yōu)選地，所述car分子包括：信號(hào)肽、胞外識(shí)別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域依次串聯(lián)組成。

15、優(yōu)選地，所述跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)閏d28鉸鏈區(qū)和cd28跨膜區(qū)。

16、優(yōu)選地，所述信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?yàn)閏d28信號(hào)內(nèi)域和cd3z內(nèi)域。

17、優(yōu)選地，所述信號(hào)肽與胞外識(shí)別結(jié)構(gòu)域之間還有flag標(biāo)記。

18、優(yōu)選地，所述car分子包括seq?id?no.10所示的氨基酸序列。

19、優(yōu)選地，所述car-t細(xì)胞采用包括如下步驟的制備方法制得的：

20、構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有編碼靶向fap的car分子的核酸分子；

21、將所述表達(dá)載體與包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到重組慢病毒；

22、將所述重組慢病毒轉(zhuǎn)染到t細(xì)胞中表達(dá)，得到car-t細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)靶向fap的car分子。

23、優(yōu)選地，所述表達(dá)載體包括病毒載體。

24、優(yōu)選地，所述病毒載體包括慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺相關(guān)病毒載體中的任意一種，優(yōu)選為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

25、優(yōu)選地，所述編碼靶向fap的car分子的核酸分子包括seq?id?no.9所示。

26、優(yōu)選地，所述靶向fap的car分子的氨基酸序列包括seq?id?no.10所示。

27、第二方面，本發(fā)明提供一種靶向fap的嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體特異性結(jié)合心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)的fap蛋白，所述嵌合抗原受體的胞外識(shí)別結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列選自：

28、如seq?id?no.2所示的氨基酸序列；或者如seq?id?no.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，具有結(jié)合fap功能的氨基酸序列。

29、本發(fā)明中，所述如seq?id?no.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列與seq?id?no.2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，優(yōu)選為具有至少95％同一性的氨基酸序列。

30、優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體包括：信號(hào)肽、胞外識(shí)別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域依次串聯(lián)組成。

31、優(yōu)選地，所述跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)閏d28鉸鏈區(qū)和cd28跨膜區(qū)。

32、優(yōu)選地，所述信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?yàn)閏d28信號(hào)內(nèi)域和cd3z內(nèi)域。

33、優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no.10所示的氨基酸序列。

34、第三方面，本發(fā)明提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼第二方面所述的靶向fap的嵌合抗原受體。

35、第四方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括至少一個(gè)拷貝的第三方面所述的核酸分子。

36、優(yōu)選地，所述表達(dá)載體包括病毒載體。

37、優(yōu)選地，所述病毒載體包括慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺相關(guān)病毒載體中的任意一種，優(yōu)選為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

38、第五方面，本發(fā)明提供一種重組慢病毒，所述重組慢病毒采用包括如下步驟的制備方法制得的：將第四方面所述的病毒載體與包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到所述重組慢病毒。

39、第六方面，本發(fā)明提供一種靶向fap的嵌合抗原受體t細(xì)胞，所述嵌合抗原受體t細(xì)胞采用包括如下步驟的制備方法制得的：將第五方面所述的重組慢病毒轉(zhuǎn)染到t細(xì)胞中表達(dá)，得到所述嵌合抗原受體t細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)第二方面所述的靶向fap的嵌合抗原受體。

40、本發(fā)明中，所述靶向fap的嵌合抗原受體t細(xì)胞的制備方法包括：

41、(1)構(gòu)建編碼靶向fap的嵌合抗原受體的表達(dá)載體；

42、(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞，制備重組慢病毒；

43、(3)將步驟(2)中的重組慢病毒導(dǎo)入t細(xì)胞中，制備表達(dá)靶向fap的嵌合抗原受體t細(xì)胞。

44、第七方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括第六方面所述的靶向fap的嵌合抗原受體t細(xì)胞。

45、優(yōu)選地，所述藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的輔料。

46、第八方面，本發(fā)明提供第六方面所述的靶向fap的嵌合抗原受體t細(xì)胞和/或第七方面所述的藥物組合物在制備治療心肌炎慢性期心臟纖維化的藥物中的應(yīng)用。

47、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

48、(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)fap的表達(dá)與纖維化程度呈正相關(guān)，fap是心肌炎病理中靶向心臟成纖維細(xì)胞的潛在候選者。

49、(2)本發(fā)明構(gòu)建的fap特異性car?t細(xì)胞(同“car-t細(xì)胞”)能有效靶向并裂解表達(dá)小鼠fap蛋白的細(xì)胞，αfap-car?t對(duì)心肌炎慢性期的纖維化治療效果優(yōu)異。