本發(fā)明屬于細胞膜偽裝納米顆粒，具體涉及一種仿生鐵基納米顆粒及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、公開該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、癌癥免疫療法，能夠激活宿主免疫系統(tǒng)，以安全有效的方式對抗癌癥。然而，由惡性細胞、間質(zhì)細胞、浸潤性免疫細胞控制的高度復雜的腫瘤免疫抑制微環(huán)境限制了實體瘤對免疫治療的應(yīng)答，導致對癌癥免疫療法有反應(yīng)的患者數(shù)量較少(≈20％)。其中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tams)通常是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多、最典型的常駐免疫抑制細胞，在某些實體腫瘤中所占比例高達50％。在發(fā)展性腫瘤中，tams功能性極化產(chǎn)生的m2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞(m2?tams)在腫瘤微環(huán)境中普遍存在，并且在支持腫瘤進展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。參與如提供營養(yǎng)支持、促進免疫逃逸、促進血管生成和影響組織重塑等多種過程。將m2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞(m2?tams)重編程為m1型腫瘤相關(guān)巨噬細胞(m1?tams)，可提高白介素-12(il-12)、γ干擾素(ifn-γ)和α腫瘤壞死因子(tnf-α)在cd4+t細胞(th1)中的表達，并提高相關(guān)th1免疫應(yīng)答，從而抑制腫瘤生長。

3、tams中的高濃度的鐵和活性氧也可能在巨噬細胞極化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，鐵補充劑ferumoxytol可通過m1型巨噬細胞的極化引發(fā)促炎免疫應(yīng)答。據(jù)報道，空心氧化鐵(fe3o4)納米顆?？梢源龠Mtams中m2表型向m1表型的轉(zhuǎn)化，引發(fā)th1細胞因子如il-12、ifn-γ、tnf-α的表達增加，并重新激活th1免疫應(yīng)答。然而，納米顆粒在長期循環(huán)過程中很容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，導致其難以進入腫瘤免疫微環(huán)境。

4、另一方面，癌細胞可以利用自身的代謝副產(chǎn)物劫持腫瘤浸潤免疫細胞的功能，為癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移獲得好處。例如，在癌細胞糖酵解過程中，攝入的葡萄糖經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化優(yōu)先分解轉(zhuǎn)化為丙酮酸，最后由乳酸脫氫酶(ldh)催化生成乳酸。癌細胞糖酵解分泌的乳酸經(jīng)過積累后，可被tams精確感知，從而導致tams的功能性極化，產(chǎn)生m2?tams，進而導致腫瘤進展和轉(zhuǎn)移。大黃素是一種富含蒽醌的天然產(chǎn)物，具有顯著的ldh抑制劑活性，能夠抑制和中和腫瘤的細胞外酸化過程，進而抑制tams的向m2?tams的功能性極化過程。然而，大黃素有限的溶解度極大地阻礙了其生物利用度，導致腫瘤低蓄積和體內(nèi)腫瘤相關(guān)巨噬細胞的低攝取。

5、因此，亟需開發(fā)一種能夠靶向?qū)嶓w腫瘤中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tams)，并能協(xié)同促進tams向m1型極化的藥物遞送系統(tǒng)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種仿生鐵基納米顆粒及制備方法和應(yīng)用，設(shè)計了一種半乳糖修飾的紅細胞膜包裹的空心fe3o4納米平臺，內(nèi)部包載大黃素，以逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境，促進抗腫瘤免疫治療生效。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

3、第一方面，一種仿生鐵基納米顆粒，包括：載藥fe3o4納米顆粒，和復合在所述載藥fe3o4納米顆粒表面的紅細胞膜，所述紅細胞膜由半乳糖修飾；

4、所述載藥fe3o4納米顆粒所包載的藥物為大黃素，所述大黃素質(zhì)量占載藥前的空心fe3o4納米顆粒的質(zhì)量的20～40％；

5、所述空心fe3o4納米顆粒的尺寸為直徑180～220nm；

6、所述半乳糖與紅細胞膜的細胞來源個數(shù)比為100μg：(2.68～6.25)×109個。

7、可選的，所述載藥fe3o4納米顆粒的尺寸為直徑320～360nm。

8、第二方面，上述仿生鐵基納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

9、s1、取質(zhì)量比為(2～2.5):1的大黃素與空心fe3o4納米顆粒，將大黃素的乙醇溶液與空心fe3o4納米顆粒的乙醇分散液混合，室溫攪拌均勻，離心棄上清液，之后真空干燥，獲得載藥fe3o4納米顆粒；

10、s2、將紅細胞膜懸浮在緩沖液中，按比例加入半乳糖，孵育25～35min后經(jīng)過濾膜擠出，獲得設(shè)定尺寸的半乳糖修飾的紅細胞膜；

11、s3、將s1中獲得的載藥fe3o4納米顆粒和s2中獲得的半乳糖修飾的紅細胞膜混合，進行包膜，得到仿生鐵基納米顆粒。

12、可選的，s1中的空心fe3o4納米顆粒的制備原料包括：質(zhì)量比為(1.0～1.5)：

13、(3.0～3.5)：(0.8～1.0)：(0.5～0.9)的六水三氯化鐵、檸檬酸鈉、尿素和聚丙烯酰胺；制備方法包括：按比例將六水三氯化鐵、檸檬酸鈉和尿素分散在蒸餾水中，之后加入聚丙烯酰胺，攪拌溶解后在200±20℃下反應(yīng)11～13h，降溫至室溫后離心分離出黑色沉淀，將黑色沉淀在60±5℃下干燥過夜，獲得空心fe3o4納米顆粒；

14、可選的，空心fe3o4納米顆粒的制備方法中，分離出黑色沉淀后，洗滌3次以上以去除未反應(yīng)物質(zhì)；

15、可選的，空心fe3o4納米顆粒的制備方法中，干燥方法為真空干燥。

16、可選的，s1中，混合方法為超聲分散25～35min.

17、可選的，s1中，真空干燥的溫度為60±5℃。

18、可選的，s2中的紅細胞膜的制備方法包括：全血在4±2℃下，以3000～3500rpm的轉(zhuǎn)速離心8～12min，棄上清液，經(jīng)pbs緩沖液洗滌后，將獲得的紅細胞在超純水中重懸2～3h誘導紅細胞破裂，之后以9000～9500rpm的轉(zhuǎn)速離心8～12min，取上清液，用pbs緩沖液洗滌至無色，獲得紅細胞膜。

19、可選的，s3中，薄膜方法包括：將含有載藥fe3o4納米顆粒與半乳糖修飾的紅細胞膜的pbs緩沖液混合通過200～250nm的過濾膜擠出。

20、第三方面，上述仿生鐵基納米顆粒和/或上述仿生鐵基納米顆粒的制備方法在如下a1)-a4)至少一種中的應(yīng)用：

21、a1)將m2?tams重編程為m1tams或制備將m2?tams重編程為m1tams的產(chǎn)品；

22、a2)抑制癌細胞增殖或制備抑制癌細胞增殖的產(chǎn)品；

23、a3)激活基于巨噬細胞和t細胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)或制備激活基于巨噬細胞和t細胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)的產(chǎn)品；

24、a4)制備治療腫瘤的產(chǎn)品。

25、可選的，所述癌細胞為乳腺癌細胞，具體為三陰性乳腺癌細胞。

26、可選的，所述腫瘤為乳腺癌腫瘤，具體為三陰性乳腺癌腫瘤。

27、本發(fā)明的有益效果為：

28、1.本發(fā)明能夠用于腫瘤免疫微環(huán)境的重塑，紅細胞膜包裹的納米顆?？梢浴把a償”納米顆粒與紅細胞之間的生物界面，從而減少免疫系統(tǒng)對納米顆粒的清除。此外，由于半乳糖凝集素在m2?tams中的高表達，半乳糖修飾的紅細胞膜可以有效地將納米顆粒轉(zhuǎn)運到腫瘤相關(guān)巨噬細胞中，內(nèi)部包封的大黃素在m2?tams內(nèi)部釋放，可以顯著抑制丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，進一步抑制和中和腫瘤酸化，重編程腫瘤相關(guān)巨噬細胞，從而使m2?tams發(fā)生極化?？招膄e3o4納米顆粒進一步將m2?tams轉(zhuǎn)換為m1?tams。

29、2.本發(fā)明能夠通過將m2?tams轉(zhuǎn)換為m1?tams，進而上調(diào)m1?tams分泌的腫瘤壞死因子(tnf-α)、白細胞介素12(il-12)，激活和募集cd8+和cd4+t細胞攻擊腫瘤細胞，由此改善腫瘤免疫治療效果。