本發(fā)明人工耳廓制備領域，具體涉及一種基于3d打印-選擇性冷凍技術的多功能復合人工耳廓支架材料及其制備方法

背景技術：

1、人工耳廓是一種用于替代喪失或損傷耳廓結構的整形修復醫(yī)療器械。它采用生物相容性材料制造，能夠高度仿生恢復耳部外觀，提升患者的自信。然而，盡管在美觀和功能恢復上取得了一些成效，但相關手術和植入的過程仍面臨一系列問題，特別是感染風險和術后并發(fā)癥。這些問題不僅給患者帶來生理和心理上的壓力，也增加了醫(yī)護人員的工作負擔。目前，針對這些問題尚未找到高效的解決方案。

2、隨著組織工程和材料科學的進步，以軟骨細胞為基礎的人工耳廓逐漸從實驗室走向臨床應用。這種類型的人工耳廓通過組織工程技術，利用患者自身或捐贈的軟骨細胞進行培養(yǎng)、擴增和成型，最終制成與自然耳廓在結構和功能上較為相似的替代品。這種方法不僅在外觀上恢復了耳廓，還具有更好的生物相容性，降低了排異反應和術后感染的風險。此外，該類人工耳廓結合了生物材料和3d打印支架技術，在多種細胞因子的誘導下，形成更契合患者個體需求的耳廓支架，從而為軟骨細胞的附著、生長與分化提供了優(yōu)良的條件。

3、不過，由于人工耳廓的厚度，其周邊組織的微弱血供不足以支持中間細胞的正常生理功能，導致缺氧性細胞凋亡，進而形成壞死核心。這種現(xiàn)象會加速人工耳廓細胞的凋亡和崩解，影響其長期在體內的存活。對此，目前常見的解決方案，是通過設計具有孔隙結構的水凝膠支架并打印，在支架中光固化負載有間充質干細胞的水凝膠。但是此類方法仍然具有許多缺點，例如人工耳廓具有復雜的力學結構和外形，需要在不同厚度結構中負載不同體積的水凝膠與間充質干細胞，因此需要在不同厚度和部位設計不同的孔徑結構；此外為了保證人工耳廓植入體內后具有優(yōu)良的營養(yǎng)與廢物交換能力，需要在人工耳廓支架上設計具有取向性的孔徑結構。而目前的光固化打印，在打印水凝膠支架上無法在微米尺度上滿足這樣的設計要求，并且打印形成的疏松支架并不能滿足人工耳廓嚴苛的力學需求和細胞附著

4、基于上述問題，本發(fā)明創(chuàng)新的采用選擇性冷凍和凍干的工程技術，先通過光固化打印人工耳廓支架的致密結構；隨后將人工耳廓支架的對耳輪、耳垂結構緊密的貼合在冷臺表面，此時由于人工耳廓漏斗形的特殊形態(tài)的其余部分和冷臺有一定距離。將冷臺降溫至-60～-40℃，進行選擇性冷凍，由于人工耳廓結構距離冷臺距離不同，外部結構緊貼冷臺，降溫速率較快，會率先凍結形成較小的冰晶，而中央結構遠離冷臺，降溫速率較慢，會形成較大的冰晶。并且由于溫度是從外部傳導至內部，形成的冰晶是連續(xù)且向心的結構，在凍干機中進行凍干時，會形成向心性的孔道結構。該類結構能夠在人工耳廓的不同部位負載不同密度的間充質干細胞，在體外軟骨分化后形成的人工耳廓軟骨結構會更貼近于真實的耳廓的力學結構，此外，向心性的孔道為人工耳廓中軟骨細胞的生長與分化帶來諸多優(yōu)勢：1)中央部分細胞的營養(yǎng)與廢物交換提供了更高的效率，為該類人工耳廓在體內的長期存活提供了生理學基礎；2)滴涂方法負載的細胞，容易附著人工耳廓支架的表面，外側小中心大的向心性促進了軟骨細胞的向內生長、遷移與成骨分化。

5、此外，本發(fā)明通過對耳廓進行3d重建，提供了一種更加便捷的人工耳廓建模方法。這不僅極大地提升了醫(yī)患之間的溝通效果，還能在設計階段更好地滿足患者在美學和功能上對耳部結構重建的需求。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，以及結合各類材料和工藝的優(yōu)點，提供一種基于3d打印-選擇性冷凍技術的多功能復合人工耳廓支架材料及其制備方法，以促進軟骨細胞自外向內進行成軟骨分化，為新型人工耳廓支架研發(fā)提供新思路。

2、本發(fā)明采用以下技術方案實現(xiàn)：

3、一種基于3d打印-選擇性冷凍技術的多功能復合人工耳廓支架材料的制備方法，包括如下步驟：

4、1)人工耳廓支架設計：使用激光雷達結合深度感知應用根據(jù)需要進行耳廓三維重建，得到3d模型文件，為帶孔結構的耳廓模型；

5、2)打印預溶液的配置:分別配制出低濃度和高濃度的colma溶液并冷卻，其中高濃度的colma溶液即無細胞的打印預溶液，然后將間充質干細胞(mscs)分散在低濃度的colma溶液中，得到載細胞滴涂預溶液；

6、3)人工耳廓支架打印與選擇性冷凍：進行光固化打印得到人工耳廓凝膠支架；然后將人工耳廓凝膠支架浸泡于無菌pbs中，浸泡完成后進行選擇性冷凍和凍干，得到人工耳廓支架即形成一級多孔支架基底層；

7、4)人工耳廓支架的成軟骨分化：向載細胞滴涂預溶液中加入含促成軟骨因子并使用滴涂法引入到步驟3)得到的人工耳廓支架上，待其孔結構吸附足量的載細胞滴涂預溶液后，進行光固化，隨后在含促成軟骨因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成二級載細胞凝膠層；

8、5)人工耳廓支架的保護層制備：在步驟4)得到的人工耳廓支架表面循環(huán)浸漬-uv固化，形成三重高濃度colma凝膠保護層，制得基于3d打印-選擇性冷凍技術的多功能復合人工耳廓支架材料。

9、進一步的，步驟1)中，可以通過帶有激光雷達的移動設備中使用深度感知應用對耳廓進行掃描重建，所述的3d建模方法包括潑濺法、高斯混合模型和表面網(wǎng)格細分法中的一種或多種。

10、進一步的，步驟2)中，打印預溶液的配置過程中，在無菌、避光及60-80℃條件下將colma凍干粉末溶于含有光引發(fā)劑的pbs溶液中，colma的取代度為60-90％，所述低濃度的colma溶液濃度為5-7.5wt％，所述高濃度的colma溶液濃度為10-20wt％；

11、所述冷卻為冷卻到37℃以下；

12、所述光引發(fā)劑為lap、irgacure、i2959中的一種或幾種，濃度為0.1-0.25wt％；

13、所述的間充質干細胞在p2-p5代以內，濃度1×107個/ml。

14、進一步的，步驟3)中，所述的光固化打印過程中，將所述無細胞的打印預溶液裝載至光固化打印機中，依照步驟1)得到的3d模型文件，采用螺旋花瓶打印模式，光源為350-410nm的uv光源，功率為20-40mw/cm2，噴嘴直徑為100-400μm，打印層厚度為100-400μm，打印溫度為35-37℃，濕度為60-80％；

15、所述浸泡時間為至少30min。

16、進一步的，步驟3)中，所述選擇性凍冷凍過程中，人工耳廓凝膠支架的對耳輪、耳垂結構緊密的貼合在冷臺表面，此時漏斗型人工耳廓其余部分與冷臺無接觸，冷臺溫度為-60～-40℃，冷凍時間為1-3h；

17、所述凍干的真空度小于0.1mbar。

18、進一步的，步驟4)中，所述載細胞滴涂預溶液和培養(yǎng)基中添加的成軟骨因子為tgf-β(轉化生長因子β)，bmps(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)，igf-1(胰島素樣生長因子-1)和fgf-2(成纖維細胞生長因子-2)中的一種或多種，濃度分別為10-20ng/ml和5-10ng/ml；

19、所述培養(yǎng)基為低葡萄糖的dmem、α-mem中的一種或多種，培養(yǎng)時間為4到8周；

20、所述滴涂法的時間為30-50s；

21、所述光固化過程中，光源為350-410nm的uv光源，功率為20-40mw/cm2，固化時間為10-15s。

22、進一步的，步驟5)中，循環(huán)浸漬-uv固化工藝過程中，浸漬液為colma凍干粉末溶于含有0.1-0.25wt％lap的pbs溶液中，配置15-20wt％的colma溶液，浸漬時間10-30s，光固化時光源為350-410nm的uv光源，功率為20-40mw/cm2，固化時間為20-30s，循環(huán)次數(shù)為3-5次。

23、一種基于3d打印-選擇性冷凍技術的多功能復合人工耳廓支架材料，采用任一所述的方法制得。

24、相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

25、1)本發(fā)明使用簡單的colma作為原材料，創(chuàng)新性的利用3d光固化打印，選擇性冷凍、低溫凍干、溶液滴涂、體外成軟骨分化和循環(huán)浸漬包被等組合工藝，制備一種基于3d打印-選擇性冷凍技術的多功能復合人工耳廓支架材料，此類工藝組合，為本發(fā)明首創(chuàng)。

26、2)本基于3d打印-選擇性冷凍技術的多功能復合人工耳廓支架材料，具有多功能復合結構，在滿足人工耳廓基礎的外觀結構的同時，通過負載細胞提升了其生物相容性，并且通過選擇性冷凍和凍干技術形成取向性孔徑，增強了細胞的營養(yǎng)與廢物交換能力。上述功能的深度整合，完善了人工耳廓的完整的生理結構，為其體內長期存活奠定了生理學基礎。

27、3)利用激光雷達結合深度感知應用對人工耳廓進行3d建模，替代了傳統(tǒng)的灌注倒模和基于ct的建模方法。與灌注倒模建模方法相比，這種3d建模方法提供了自定義人工耳廓形態(tài)的可能性；與ct建模方法相比，該方法極大地簡化了建模成本和難度?；颊吆歪t(yī)生可以通過直接溝通，對人工耳廓在美學和功能上進行自定義調節(jié)。這種用于人工耳廓建模的方法是本發(fā)明的獨創(chuàng)之處。

28、4)本發(fā)明結合3d打印、選擇性冷凍和凍干技術，在凝膠人工耳廓支架中形成通常3d光固化打印機難以形成的孔徑尺度，傳統(tǒng)光固化打印形成的支架孔徑結構受到打印噴嘴、打印臺精度和材料溶脹系數(shù)的三重限制，在這類打印水凝膠材料中，很難形成微小的孔徑，從而限制了間充質干細胞在其中的負載，并降低了最終成骨分化的硬度。而本發(fā)明采用凍干工藝形成致密的孔結構，能夠以更高密度負載間充質干細胞，從而形成具有更高強度的人工耳廓。

29、5)本發(fā)明基于人工耳廓的形態(tài)結構特點和形態(tài)中的力學結構差異，創(chuàng)新性的改進選擇性冷凍和凍干工藝。在選擇性冷凍步驟中，人工耳廓支架的對耳輪、耳垂結構緊密的貼合在冷臺表面，此時由于人工耳廓漏斗形的特殊形態(tài)的其余部分和冷臺有一定距離。將冷臺降溫至-60℃～-40℃，進行選擇性冷凍，由于人工耳廓結構距離冷臺距離不同，外部結構緊貼冷臺，降溫速率較快，會率先凍結形成較小的冰晶，而中央結構遠離冷臺，降溫速率較慢，會形成較大的冰晶。并且由于溫度是從外部傳導至內部，形成的冰晶是連續(xù)且向心的結構，在凍干機中進行凍干時，會形成向心性的孔道結構。該類結構能夠在人工耳廓的不同部位負載不同密度的間充質干細胞，在體外軟骨分化后形成的人工耳廓軟骨結構會更貼近于真實的耳廓的力學結構，此外，向心性的孔道為人工耳廓中軟骨細胞的生長與分化帶來諸多優(yōu)勢：1)中央部分細胞的營養(yǎng)與廢物交換提供了更高的效率，為該類人工耳廓在體內的長期存活提供了生理學基礎；2)滴涂方法負載的細胞，容易附著人工耳廓支架的表面，外側小中心大的向心性促進了軟骨細胞的向內生長、遷移與成骨分化。上述優(yōu)勢所帶來的軟骨力學結構，呈現(xiàn)外部較為柔軟，中央較為堅硬的分布，這樣的分布更貼近于天然耳廓的力學結構，在天然耳廓中，外部的耳輪和耳垂相對柔軟，起到外形支撐的作用，內部的耳甲，對耳輪和對耳屏比價堅硬，起到面部的連接和支撐作用。，這樣的設計不僅從外觀上滿足了患者耳廓重建的需求，進一步從力學支撐，觸感等方面全面模擬耳廓結構，極大的滿足了患者的對耳廓修復的美觀和真實感需求。

30、6)本發(fā)明在人工耳廓結構中創(chuàng)新性的使用三重結構，仿照真實耳廓“軟骨-結締組織-真皮層”結構，對人工耳廓凝膠支架使用凍干工藝并滴涂含促成軟骨因子的載細胞滴涂預溶液，形成人工耳廓支架和二級載細胞凝膠層，這兩層結構所形成的軟骨和結締組織，起到了主要外形維持和力學支撐作用；并用循環(huán)浸漬包被在表面形成高濃度colma凝膠保護層，用于進一步增強人工人工耳廓的強度。

31、7)本發(fā)明中的3d建模流程和基于選擇性冷凍的的凝膠的成軟骨技術適用于各類患者人工耳廓軟骨重建和修補，技術具有極強的普適性。