本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體是一種針對腸道健康設(shè)計的益生菌制劑及其制備方法，旨在通過優(yōu)化益生菌的配方與釋放機制，實現(xiàn)對腸道微生態(tài)的有效調(diào)節(jié)，促進腸道健康，預(yù)防和治療腸道相關(guān)疾病。

背景技術(shù)：

1、腸道微生態(tài)平衡對于人體健康至關(guān)重要，益生菌作為腸道內(nèi)的重要微生物，對維持腸道健康具有不可替代的作用。然而，現(xiàn)有市場上的益生菌產(chǎn)品存在菌種單一、活性不足、難以在腸道特定部位有效釋放等問題，導(dǎo)致其效果有限。因此，開發(fā)一種能夠精準定位、高效釋放的腸道益生菌制劑顯得尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有益生菌產(chǎn)品存在的菌種單一、活性不足、釋放效果差等問題，提供一種包含多種高效益生菌的腸道益生菌制劑，該制劑能夠在腸道特定部位(如結(jié)腸)精準釋放，從而有效調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，促進腸道健康。

2、本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

3、一種腸道益生菌制劑，其特征在于，含有下列重量份數(shù)的各菌種：

4、植物乳桿菌cd發(fā)酵前體粉劑?????????10000億單位；

5、兩歧雙歧桿菌發(fā)酵前體粉劑?????????5000億單位；

6、動物雙歧桿菌乳亞種發(fā)酵前體粉劑???4000億單位；

7、嗜酸乳桿菌發(fā)酵前體粉劑???????????1000億單位；

8、低聚果糖d-果糖與低聚半乳糖???????100重量份；

9、(植物乳桿菌cd為專利號：zl200710014488.6名稱為：植物乳桿菌cd及其用途)

10、各菌種發(fā)酵前體粉劑均為菌種通過發(fā)酵方式將菌種活體菌的含量濃縮至發(fā)酵前體的形式。

11、作為優(yōu)選，植物乳桿菌cd活體菌提取過程：①活化：選取培養(yǎng)至對數(shù)期末的植物乳桿菌cd菌液至濃度為1～9×108cfu/ml，接種于植物乳桿菌cd固體培養(yǎng)基斜面上進行活化，30℃培養(yǎng)1～3d后取活化菌菌苔培養(yǎng)；②純化：取植物乳桿菌cd活化菌苔接種至mrs肉湯內(nèi)，30℃80～120rpm搖床培養(yǎng)20h，取100μl培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至9ml?mrs肉湯內(nèi)，再置于30℃80～120rpm搖床培養(yǎng)18～24h，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3～6次，再取最后一次活化液100μl接種于含5mlmrs肉湯的離心管內(nèi)進行30℃80～120rpm搖床培養(yǎng)18～24h；最后取100μl培養(yǎng)液與含9ml10％脫脂奶粉的離心管中進行混合，在37℃下振蕩45min，以3000rpm/min的速度離心10min后去除上清液，洗滌沉淀并將菌體懸浮于生理鹽水中，此步操作重復(fù)三次在37℃下振蕩45min進行菌體沉淀與生理鹽水的洗脫，最后制成重懸液，即為待離心菌液；經(jīng)計算獲得菌液內(nèi)活菌數(shù)為1～9×108cfu/ml；③濃縮：待離心菌液經(jīng)濃縮器濃縮后，制成菌數(shù)達到1～9×1011cfu/ml的濃縮菌液；經(jīng)梯度稀釋法檢查濃縮菌液中植物乳桿菌cd活菌數(shù)與純化前的菌液活菌數(shù)相等；④過濾：使用0.22μm?ph＝7.0的微孔濾膜，濾膜中空部加入預(yù)冷的已滅菌的生理鹽水，菌量為1～9×1011cfu/ml濃縮菌液置于微孔濾膜上方進行過濾，濾膜一端插入液體培養(yǎng)基，濾膜上方置入適量的預(yù)冷的純水，菌液從過濾膜中流出，流出液則為過濾菌液；⑤烘干：過濾菌液置于培養(yǎng)箱進行48℃培養(yǎng)24h烘干；⑥粉碎：烘干后獲得粉狀濃縮菌體產(chǎn)品，在-20℃環(huán)境并利用粉碎機粉碎；⑦包裝：粉末存放在-4℃的條件下待用；⑧粉劑活菌計算：稱取0.1g菌粉和9.99g無菌脫脂奶粉充分混勻，取0.1g混合溶液于無菌離心管內(nèi)，加入9ml?10％碳酸鈉溶液混勻，70℃水浴10min，90～120rpm震蕩30min，稀釋后對菌液進行梯度稀釋，取0.1ml菌液涂布到溴甲酚紫固體平板上，37℃培養(yǎng)12～18h，計數(shù)并計算樣品內(nèi)活菌數(shù)，稀釋度為1～100×101×107cfu/g。

12、作為優(yōu)選，兩歧雙歧桿菌發(fā)酵前體粉劑為由兩歧雙歧桿菌在純種培養(yǎng)基中進行活化；其中純種培養(yǎng)基是按質(zhì)量份計含有5重量份兩歧雙歧桿菌與45～50份培養(yǎng)基，將活化后的種子培養(yǎng)液接種入一級種子罐，接種量為6重量％，接種后在厭氧、溫度14～20℃下，攪拌發(fā)酵10小時，兩歧雙歧桿菌芽孢形成速度與菌體數(shù)量按質(zhì)量比為(2～5):(5～3)，種子液的活菌數(shù)和芽孢數(shù)均為1010～1011個/ml，將一級發(fā)酵罐的種子液接種入二級發(fā)酵罐，接種量4重量％，發(fā)酵培養(yǎng)，在罐中厭氧、溫度14～20℃下，攪拌發(fā)酵5小時，兩歧雙歧桿菌芽孢形成速度與菌體數(shù)量按質(zhì)量比為(2～5):(5～3)，種子液的活菌數(shù)和芽孢數(shù)均為1010～1011個/ml，將二級發(fā)酵罐的兩歧雙歧桿菌培養(yǎng)液按照固液質(zhì)量1:5的接種量接種到三級濃縮罐，密封且保持無菌環(huán)境進行濃縮發(fā)酵，在恒溫42℃，攪拌速率20rpm/min攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)時間4h，兩歧雙歧桿菌芽孢形成速度與菌體數(shù)量按質(zhì)量比為(2～5):(5～3)，在濃縮罐中活菌數(shù)和芽孢數(shù)(1010～1011)個/ml，對發(fā)酵完畢的菌液進行100倍稀釋后使用血球計數(shù)板計數(shù)，三級濃縮罐內(nèi)殘余液按固液質(zhì)量比1:5的接種量注入四級二次濃縮罐，重復(fù)濃縮罐中的發(fā)酵條件，經(jīng)二級濃縮罐內(nèi)收集到的兩歧雙歧桿菌芽孢，芽孢形成速度與菌體數(shù)量按質(zhì)量比為(1～3):(7～2)，本級濃縮罐中收集到的發(fā)酵液存放于4℃環(huán)境的冰箱內(nèi)且全程保持無菌狀態(tài)；濃縮后的培養(yǎng)液菌數(shù)和芽孢數(shù)(1010～1011)個/ml，二次濃縮后的發(fā)酵液經(jīng)過振蕩器振動10分鐘，將菌液接種入真空干燥箱中，在振動器上振動3s后關(guān)閉真空干燥箱閥門，抽真空，并維持壓力0.02mpa及溫度48℃下振動干燥1小時，取出干燥好的發(fā)酵結(jié)晶品，放于-20℃環(huán)境中進行保存。

13、作為優(yōu)選，所述動物雙歧桿菌乳亞種發(fā)酵前體粉劑為由動物雙歧桿菌乳亞種在純種培養(yǎng)基中進行活化；其中所述純種培養(yǎng)基按質(zhì)量份計含有5重量份動物雙歧桿菌乳亞種與45～50份培養(yǎng)基，所述動物雙歧桿菌乳酸桿菌的發(fā)酵過程與兩歧雙歧桿菌的發(fā)酵過程相同，不同在于濃度和發(fā)酵時間，在二級發(fā)酵罐中動物雙歧桿菌乳酸桿菌活菌數(shù)為1011～1012個/ml；動物雙歧桿菌乳酸桿菌芽孢與菌體數(shù)量按質(zhì)量比為3:7，濃縮罐中活菌數(shù)為1011～1012個/ml。

14、作為優(yōu)選，所述嗜酸乳桿菌發(fā)酵前體粉劑為由嗜酸乳桿菌在純種培養(yǎng)基中進行活化。

15、作為優(yōu)選，各菌種發(fā)酵前體粉劑經(jīng)過多層包埋處理，包括如下步驟：1)將各菌種發(fā)酵前體粉劑與保護劑混合，震蕩處理后得益生菌懸液，所述保護劑中包括如下組分：脫脂乳20～30g/l，海藻糖20～30g/l，甘露醇10～20g/l，山梨醇20～30g/l，l-谷氨酸鈉1.2～3.8g/l，維生素c?0.1～0.2g/l，抗性糊精10～22g/l，牛磺酸0.1～0.5g/l；2)所述益生菌懸液裝入軟膠囊，通過冷凍干燥，得到益生菌粉劑；3)配制漿料，所述漿料中包括植物膠、蜂蜜、益生菌粉劑、魔芋纖維、麥芽糊精、山楂泥及去離子水，將其經(jīng)過滅菌、攪拌及混合后，得滅菌漿料；所述植物膠的濃度為1％～3％，所述蜂蜜的質(zhì)量占所述漿料總質(zhì)量的3％～7％，所述益生菌粉劑的質(zhì)量占所述漿料總質(zhì)量的5～10％，所述魔芋纖維的質(zhì)量占所述漿料總質(zhì)量的3～8％，所述麥芽糊精的質(zhì)量占所述漿料總質(zhì)量的0.1～0.3％；所述山楂泥的質(zhì)量占所述漿料總質(zhì)量的0.3～0.7％；4)將滅菌漿料添加至冷等靜壓壓制機中進行壓制，形成具有多層結(jié)構(gòu)的益生菌制劑；5)將所述具有多層結(jié)構(gòu)的益生菌制劑通過真空袋裝機進行包裝，包裝后的腸道益生菌制劑通過鈷60照射，進行輻照滅菌，所述腸道益生菌制劑中的益生菌菌落數(shù)量≥0.5×105cfu/g,且總存活率為90％以上；所述輻照滅菌的輻照劑量為10～20kgy。

16、作為優(yōu)選，步驟1)中，所述益生菌懸液中，各菌種發(fā)酵前體粉劑與保護劑的比例為1：10～1：20；活菌數(shù)不低于每克5×1010cfu；

17、所述震蕩處理的參數(shù)包括：溫度為40～50℃，且震蕩處理時間為0.5～3小時；然后以0.4～0.7℃/min的速率進行降溫，并在3～10℃下存放12小時以上。

18、作為優(yōu)選，步驟2)中，冷凍干燥前，先在-10～-78℃條件下速凍處理，8-12小時；然后待溫度恢復(fù)至4℃后，在冷等靜壓機下，以每分鐘25～50公斤的速率對軟膠囊進行壓縮，直至壓縮至比其原體積縮小1/6～1/10的體積；所述冷凍干燥的氣壓為0.2～0.4mpa，溫度-50～-10℃，真空度為0.1～0.25pa，冷凍干燥時間為24～48小時。

19、作為優(yōu)選，步驟3)中，先將麥芽糊精和植物膠配制成淀粉混合液，并置于水浴鍋中80℃水浴攪拌20～60min，待降溫降至75℃時，加入山楂泥、蜂蜜，并調(diào)節(jié)溫度至65～70℃，再將混合液靜置冷卻，并于4℃靜置12～16h,得到淀粉凝膠，備用；將所述淀粉凝膠放入均質(zhì)器中，同時將所述益生菌粉劑加入預(yù)配好的淀粉凝膠中，混合均勻，得到粗乳狀液漿料；所述粗乳狀液漿體于-10～-78℃急冷儲存10～12小時后加入至儲存罐中；所述滅菌為在121℃高溫滅菌20min；所述滅菌漿料的ph為4.2～4.6，ph值調(diào)節(jié)劑為檸檬酸與檸檬酸鈉的混合液；所述魔芋纖維為經(jīng)超微粉碎處理10～30min，過200目篩后得到。

20、作為優(yōu)選，步驟3)中，所述植物膠是瓜爾豆膠，經(jīng)水提取后，依次經(jīng)濃縮、稀釋、離心分離及冷凍干燥處理，得濃縮產(chǎn)物；所述濃縮產(chǎn)物中，植物膠的提取方法包括如下步驟：s1：以植物膠:水為1:3～1:10的質(zhì)量比，在90℃～95℃的條件下，對植物膠提取液進行提取，持續(xù)2～4小時；s2：將得到的所述植物膠提取液以6000～10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10～15min，然后取上層清液；s3：對所述上層清液采用膜分離方式進行濃縮處理，得到植物膠粗提液液體；s4：稀釋的參數(shù)為：稀釋后植物膠的濃度為2％～3％，再對稀釋后的植物膠粗提液進行超聲提取，超聲提取的時間為2～4小時，提取溫度為35～55℃，超聲波的功率為150～200w；s5：取步驟s4超聲后的料液，置于離心機以3000～4000r/m離心得到二次提取液，每次離心的時間為15～20min；收集上清液備用；s6：將步驟s5離心后的殘渣加入去離子水，在超聲波功率為100～150w超聲處理5～8min，然后經(jīng)離心分離，得到兩次離心后上層清液；

21、s7：重復(fù)步驟s6處理，并取三次離心后的上層清液，與步驟s5得到的所述上清液合并；s8：對合并后的二次清液進行冷凍干燥處理，得到植物膠濃縮物；

22、作為優(yōu)選，步驟3)中，所述魔芋纖維的制備方法包括如下步驟：取魔芋精粉與水，按每克魔芋粉配2～3ml的水，混合制成魔芋水，調(diào)節(jié)ph為7.0,在磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為500rm下攪拌5min,得到魔芋溶液；將得到的魔芋溶液依次經(jīng)剪切處理、高壓均質(zhì)處理、超聲處理后，置于冷凍冰箱中處理-10℃，處理時間大于12小時；對處理后的魔芋溶液進行干燥，得到魔芋提取物；所述剪切處理的參數(shù)為：剪切速度為18000rm，剪切時間為6分鐘；所述高壓均質(zhì)處理的參數(shù)為：進料壓力為200pa,均質(zhì)次數(shù)為4次通入連續(xù)，均質(zhì)時間為20分鐘，均質(zhì)溫度為50℃；所述超聲處理的參數(shù)為：頻率1800hz，超聲時間15分鐘；所述干燥，包括：取所述處理后的魔芋溶液置于冷凍溫度為-10～-78℃下干燥，干燥時間為10小時；所述干燥處理后所得固體中，水分含量小于5％。

23、本發(fā)明的有益效果是：

24、本發(fā)明的腸道益生菌制劑包含多種高效益生菌，能夠更全面地調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，通過多層包埋的設(shè)計，實現(xiàn)了益生菌在腸道特定部位的精準釋放，提高了益生菌的利用率和效果，制劑結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于制備和儲存，便于患者使用。除此之外，還具有：

25、(1)活菌數(shù)量高，能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群。

26、(2)存活率高，在儲存和使用過程中能夠保持良好的活性。

27、(3)功效顯著，能夠改善腸道健康，緩解腹瀉、便秘等癥狀。

28、(4)制備方法簡單，成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。