本發(fā)明屬于生物，具體涉及isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在制備預(yù)防、治療prrsv感染的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，prrs）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine?reproductive?and?respiratory?syndromevirus，prrsv）引起的一種以妊娠母豬呼吸困難、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎或木乃伊胎和仔豬生長緩慢為特征的一種高度接觸性傳染性疾病。由于病豬耳朵發(fā)紺發(fā)紫，此病也稱為“豬藍(lán)耳病”。prrsv有著變異快、防控難的特點(diǎn)，與豬流感病毒感染不同，prrsv能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)從而引起免疫抑制，疫苗的防控效果并不理想。prrs臨床癥狀以母豬呼吸困難和繁殖障礙、仔豬生長緩慢為主，對(duì)新生仔豬和母豬具有極高致死率，嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。prrsv存在變異快、防控難的特點(diǎn)，滅活疫苗的免疫保護(hù)較弱，而弱毒苗又存在毒力返祖的現(xiàn)象，導(dǎo)致prrsv疫苗的整體保護(hù)效果并不理想。因此實(shí)現(xiàn)對(duì)prrsv的有效防控目前仍是亟待解決的一個(gè)難題。

2、干擾素（interferon,?ifn）是細(xì)胞在病毒或其他刺激因子的作用下產(chǎn)生的一大類具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)，具有廣譜的抗病毒作用和免疫調(diào)節(jié)作用，在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要功能。ifn根據(jù)其編碼基因序列及受體類型不同可分為三大家族：ifn-ⅰ、ifn-ⅱ、ifn-ⅲ。ifn-ⅲ（ifn-λ）是近些年最新發(fā)現(xiàn)的一種干擾素亞型，其抗病毒功能及機(jī)制與ifn-?。╥fn-α/β）相似，但不同于ifn-α/β可以作用于全身組織的特性，ifn-λ主要作用于上皮細(xì)胞，特別是肺臟、胃腸道及腎臟的上皮細(xì)胞，從而能夠避免像ifn-ⅰ一樣產(chǎn)生全身性炎癥反應(yīng)，因此被認(rèn)為在某些病毒性傳染?。ㄈ绾粑到y(tǒng)感染）的治療中具有優(yōu)于ifn-α/β用于治療的潛力，成為了近些年抗病毒治療研究的熱點(diǎn)。在豬病毒性傳染病中，大部分病毒都是通過呼吸道、胃腸道進(jìn)行感染，而ifn-λ作用于此類疾病的“前沿陣地”，因此，開發(fā)ifn-ⅲ型制劑對(duì)豬病毒疾病的防治意義重大。

3、目前，ifn的生產(chǎn)除了從豬白細(xì)胞中分離外，主要依靠基因工程方法進(jìn)行表達(dá)純化。將ifn的目的基因插入宿主基因，誘導(dǎo)宿主基因表達(dá)ifn，并通過一定的方法進(jìn)行純化，從而獲取ifn。常用的ifn表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、腺病毒表達(dá)系統(tǒng)等，桿狀病毒和酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出來的蛋白活性優(yōu)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，能夠正確折疊并發(fā)揮生物學(xué)活性，但是蛋白表達(dá)量低、生產(chǎn)周期及生產(chǎn)成本高，難以大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短、蛋白表達(dá)量高，因此利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行ifn的表達(dá)更加適合生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。但是，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白多為包涵體表達(dá)，難以正確折疊并復(fù)性成功，例如連丹花（“ⅲ型干擾素ifn-λ的表達(dá)純化及活性鑒定”[d]）構(gòu)建了bl21/pet26b（+）/?ifn-λ3原核表達(dá)菌株，并通過1?μg/ml的iptg誘導(dǎo)劑成功誘導(dǎo)出可溶性ifn-λ3重組蛋白，但是重組蛋白在胞周質(zhì)內(nèi)總體表達(dá)量偏低。

4、因而，如何實(shí)現(xiàn)ifn-λ3的大規(guī)模生產(chǎn)是ifn-ⅲ制劑開發(fā)中面臨的重大技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏對(duì)prrsv感染有效的防控和治療手段的問題以及ifn-λ3難以大規(guī)模生產(chǎn)的問題，本發(fā)明旨在提供一種isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，并將其用于制備預(yù)防、治療prrsv感染的藥物，驗(yàn)證了其具體功效。

2、為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在制備預(yù)防、治療prrsv感染的藥物中的應(yīng)用，通過連接肽(h4)2將isg15與ifn-λ3連接起來，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、進(jìn)一步地，所述藥物具有抑制prrsv的復(fù)制、抗prrsv活性的作用。

5、進(jìn)一步地，所述藥物具有減輕肺臟病變的作用，對(duì)prrsv感染的仔豬有治療效果。

6、進(jìn)一步地，所述藥物能夠改善仔豬的病毒血癥。

7、進(jìn)一步地，所述藥物能夠減輕肺臟中的炎性因子的表達(dá)和分泌，具有良好的抗炎作用。

8、進(jìn)一步地，編碼isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

9、進(jìn)一步地，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：

10、1）將seq?id?no.2所示的核苷酸序列克隆到載體從而構(gòu)建重組載體-isg15-(h4)2-ifn-λ3；

11、2）將重組載體-isg15-(h4)2-ifn-λ3轉(zhuǎn)化大腸桿菌從而得到用于制備isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的重組菌；

12、3）誘導(dǎo)表達(dá)獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。

13、更進(jìn)一步地，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：

14、1）將seq?id?no.2所示的核苷酸序列克隆到pet-28a載體從而構(gòu)建重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-ifn-λ3；

15、2）將重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-ifn-λ3轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21（de3）從而得到用于制備isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的重組菌；

16、3）誘導(dǎo)表達(dá)獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。

17、進(jìn)一步地，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：將重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-ifn-λ3轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞bl21（de3）后得到重組菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。

18、第二方面，提供預(yù)防、治療prrsv感染的藥物，所述藥物含有安全有效量的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

19、進(jìn)一步地，編碼isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

20、進(jìn)一步地，所述藥物具有抑制prrsv的復(fù)制、抗prrsv活性的作用；或者所述藥物具有減輕肺臟病變的作用。

21、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

22、本發(fā)明選擇不同的連接肽：rl、hl、(h4)2，將isg15與ifn-λ3連接來促進(jìn)isg15-ifn-λ3的生物活性，研究表明isg15與ifn-λ3通過rl和hl連接后，盡管蛋白表達(dá)量有所提升，但在pbs中大量析出，難以復(fù)性成功，使用(h4)2連接肽的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白成功復(fù)性透析至pbs，且表達(dá)量和穩(wěn)定性顯著提升，在同等條件下，本發(fā)明選擇(h4)2連接肽將isg15和ifn-λ3連接起來，可以實(shí)現(xiàn)ifn-λ3蛋白的穩(wěn)定、大量表達(dá)，解決了無法使用原核表達(dá)系統(tǒng)大量生產(chǎn)ifn-λ3的技術(shù)問題，且其純化后的產(chǎn)量是rl、hl作為連接肽時(shí)的4倍以上，取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果，為ifn-λ3大規(guī)模、低成本量產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

23、本發(fā)明對(duì)isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在體內(nèi)的抗prrsv活性進(jìn)行了驗(yàn)證，證明重組表達(dá)的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白對(duì)抑制prrsv在體內(nèi)的復(fù)制有抑制效果，減輕了肺臟的病變、減輕肺臟中的炎性因子的分泌并改善了prrsv感染后引起的病毒血癥。