一種可工業(yè)化提取白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可工業(yè)化提取白蕓豆中a-淀粉酶抑制劑的方法，屬于植物有效 成分的制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高，糖尿病逐漸成為了一種普遍的疾病，給 人類的健康造成了嚴(yán)重的威脅。糖尿病是一種以糖代謝紊亂為主的全身性疾病，而餐后高 血糖是糖尿病的一個(gè)典型特征。餐后血糖的持續(xù)升高會(huì)產(chǎn)生葡萄糖毒性，損傷心血管系統(tǒng)， 最終對(duì)人體造成不可逆的傷害。因此，控制餐后血糖升高，對(duì)于控制和延緩糖尿病的發(fā)生和 發(fā)展至關(guān)重要。目前全球糖尿病人已超過1. 5億，預(yù)計(jì)到2025年將會(huì)達(dá)到3億，其中我國 的糖尿病患者人數(shù)超過5000萬，而且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。因此，對(duì)有關(guān)預(yù)防和控制 糖尿病產(chǎn)品的研宄與開發(fā)有著現(xiàn)實(shí)的意義和廣闊的前景。
[0003] a-淀粉酶抑制劑是一種被廣泛研宄的抗糖尿病的物質(zhì)，屬于糖苷水解酶抑制 劑，其化學(xué)本質(zhì)是多肽、大分子蛋白質(zhì)或含氮碳水化合物，主要通過特異性抑制唾液及腸道 a_淀粉酶的活性來減少糖分?jǐn)z取，從而抑制血糖濃度升高。目前已從許多植物種子的胚乳 和微生物的代謝產(chǎn)物中分離得到了a-淀粉酶抑制劑，其中從白蕓豆中提取的a-淀粉酶 抑制劑因具有抑制活性高、安全無副作用等優(yōu)點(diǎn)而被更多地研宄和應(yīng)用。白蕓豆是世界上 第二大豆科作物，在我國各省區(qū)均有種植，其中云南、貴州、四川等省份有較大的種植面積。 據(jù)我國古醫(yī)籍記載，白蕓豆性味甘、平，是一種滋補(bǔ)食療佳品。
[0004] 現(xiàn)有從白蕓豆中提取a-淀粉酶抑制劑的方法依賴色譜層析柱，無法工業(yè)化大規(guī) 模應(yīng)用，或者不能得到活性較高的a-淀粉酶抑制劑，因而不能適應(yīng)當(dāng)今社會(huì)的迫切需求。 因此，開發(fā)一種可工業(yè)化提取白蕓豆中a-淀粉酶抑制劑的方法不僅可以促進(jìn)國內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品 資源的開發(fā)利用，而且對(duì)于糖尿病的預(yù)防和控制也有著積極的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種可工業(yè)化提取白蕓豆中 a-淀粉酶抑制劑的方法，適用于白蕓豆中a-淀粉酶抑制劑的工業(yè)化大規(guī)模提取。
[0006] 所述方法主要包括以下步驟：
[0007] (1)白蕓豆的預(yù)處理：浸泡、磨漿，過濾除渣，得到濾液；
[0008] (2)靜置：將濾液在室溫下靜置，使淀粉充分沉降，然后離心取上清液；
[0009] ⑶滅酶：將上清液滅除內(nèi)源性a-淀粉酶活性，然后離心取上清液；
[0010] (4)乙醇沉淀：向上清液中加入無水乙醇適當(dāng)攪拌，沉淀蛋白質(zhì)，然后離心取下層 沉淀物；
[0011] (5)溶解蛋白質(zhì)：將下層沉淀物中殘留的乙醇除去，然后用pH6. 9的磷酸鹽緩沖液 溶解蛋白質(zhì)，得到蛋白液；
[0012] (6)酶解：將蛋白液調(diào)至合適的濃度、溫度和pH后，加入堿性蛋白酶酶解雜蛋白；
[0013] (7)酸沉：用lmol/L的鹽酸將酶解液調(diào)節(jié)至合適的pH進(jìn)行酸沉，然后離心取上清 液；
[0014] (8)乙醇沉淀：向上清液中加入無水乙醇，沉淀a_淀粉酶抑制劑，然后離心取下 層沉淀物，該沉淀物為a-淀粉酶抑制劑。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還包括冷凍干燥的步驟：將沉淀物在通風(fēng) 櫥中放置l_2h后，于_80°C冷凍干燥48h，超微粉碎后即得粉末狀的a-淀粉酶抑制劑產(chǎn) 品。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟（1)白蕓豆的預(yù)處理，是按每100g白蕓 豆300-500mL蒸餾水的量，將白蕓豆于室溫下浸泡7-10h后去皮，然后按100g白蕓豆 600-800mL蒸餾水的量，將白蕓豆磨漿，過100目篩去除殘?jiān)?，得到濾液。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟（3)的滅酶是將上清液在70 °C水浴滅酶 15_30min〇
[0018] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟（4)乙醇沉淀，是向上清液中加入無水乙醇至 終濃度為70% (v/v)，在4°C下攪拌2h，然后離心取下層沉淀物，得到蛋白質(zhì)。
[0019] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟（5)溶解蛋白質(zhì)，是揮發(fā)除去蛋白質(zhì)中殘留的 乙醇，然后用〇. 〇2mol//L、pH6. 9的磷酸鹽緩沖液溶解蛋白質(zhì)，得到蛋白液。
[0020] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟（6)酶解是將蛋白液濃度調(diào)整為10-20mg/mL， 溫度為50-60°C，pH為6. 5-7. 5,堿性蛋白酶的添加量為2-6U/g蛋白質(zhì)，酶解時(shí)間為2-4h。
[0021] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟（7)酸沉，是用lmol/L的鹽酸將酶解液調(diào)節(jié)至 pH3. 0-5. 5,于4°C下靜置l_2h，然后離心取上清液。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟（8)乙醇沉淀，是向上清液中加入無水乙醇至 終濃度為70% (v/v)，在4°C下攪拌2h，然后離心取下層沉淀物。
[0023] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法主要包括如下步驟：
[0024] (1)浸泡去皮：按每100g白蕓豆300-500mL蒸餾水的量，將白蕓豆于室溫下浸泡 7-10h后去皮；
[0025] (2)磨漿：按100g白蕓豆600-800mL蒸餾水的量，將白蕓豆磨衆(zhòng)，過100目篩去除 殘?jiān)?，得到濾液；
[0026] (3)靜置：將濾液在室溫下靜置2_3h，使淀粉充分沉降，然后離心取上清液；
[0027] (4)滅酶：將上清液在70°C水浴滅酶30min，然后離心取上清液；
[0028](5)乙醇沉淀：向上清液中加入無水乙醇至終濃度為70% (v/v)，在4°C下攪拌 2h，然后離心取下層沉淀物，該沉淀物為蛋白質(zhì)；
[0029] (6)溶解蛋白質(zhì)：將蛋白質(zhì)在通風(fēng)櫥中放置l_2h以揮發(fā)去除殘留的乙醇，然后用 200-400mL0. 02mol/L、pH6. 9的磷酸鹽緩沖液（PBS)溶解蛋白質(zhì)，得到蛋白液；
[0030] (7)酶解：將蛋白液調(diào)至蛋白液濃度為10-20mg/mL，溫度為50-60 °C，pH為 6. 5-7. 5,加酶量為2-6U/g蛋白質(zhì)，酶解時(shí)間為2-4h，得到蛋白酶解液；
[0031] (8)酸沉：用lmol/L的鹽酸將酶解液調(diào)節(jié)至pH3. 0-5. 5進(jìn)行酸沉，于4°C下靜置 l_2h，然后離心取上清液；
[0032](9)乙醇沉淀：向上清液中加入無水乙醇至終濃度為70% (v/v)，在4°C下攪拌 2h，然后離心取下層沉淀物，該沉淀物為a-淀粉酶抑制劑；
[0033] (10)冷凍干燥：將沉淀物在通風(fēng)櫥中放置l_2h后，于_80°C冷凍干燥48h，超微粉 碎后即得粉末狀的a-淀粉酶抑制劑產(chǎn)品。
[0034] 上述的離心條件是：4°C，9000r/min，離心20min。
[0035] 本發(fā)明提取白蕓豆中a_淀粉酶抑制劑的方法，采用浸泡、磨漿、滅酶、乙醇沉淀 的方法獲得蛋白